Name: visualize drosophila leg motor neuron axons through the adult cuticle
Uploaded: 2018-10-30T14:30:00
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Agradecemos a Robert Renard para preparar medio mosca alimentos. Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH NS070644 a la R.S.M. y financiación de la Asociación de ELA (#256), FRM (#AJE20170537445) y programa de ATIP-Avenir a J.E.

1. disección y fijación de la pierna
<ol><li>Tomar una placa de cristal de varios pocillos y número apropiado llenado de pozos con etanol al 70%. Añadir 15-20 CO2-moscas anestesiados (de cualquier sexo y cualquier edad) a cada uno bien y usando un cepillo, frote suavemente las moscas en la solución de etanol hasta que moscas son completamente sumergidas. Nota: Este paso es eliminar la hidrofobicidad de la cutícula. No se lave durante más de 1 minuto, porque esto aumenta auto fluorescencia de la cut...

<ol>
	<li>Miller, A., Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+anatomy+and+histology+of+the+imago+of+Drosophila+melanogaster.">The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster.</a> Biology of Drosophila. , 420-531 (1950).</li><li>Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+development+of+muscles+and+tendons+of+the+Drosophila+leg.">Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg.</a> Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).</li><li>Baek, M., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+and+Birth+Date+Specify+Motor+Neuron+Targeting+and+Dendritic+Architecture+in+adult+Drosophila.">Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).</li><li>Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origins+and+architecture+of+Drosophila+leg+motoneurons.">Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons.</a> Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).</li><li>Enriquez, J., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Individual+Adult+Motor+Neuron+Morphologies+by+Combinatorial+Transcription+Factor+Codes.">Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes.</a> Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).</li><li>Mahr, A., Aberle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+pattern+of+the+Drosophila+vesicular+glutamate+transporter:+a+marker+protein+for+motoneurons+and+glutamatergic+centers+in+the+brain.">The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain.</a> Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+(MARCM)+for+Drosophila+neural+development.">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).</li><li>Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differing+Strategies+Despite+Shared+Lineages+of+Motor+Neurons+and+Glia+to+Achieve+Robust+Development+of+an+Adult+Neuropil+in+Drosophila.">Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila.</a> Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions.">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).</li><li>Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+targeting+in+the+leg+neuropil+of+Drosophila:+the+role+of+midline+signalling+molecules+in+generating+a+myotopic+map.">Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000199 (2009).</li></ol>

La cutícula de la Drosophila adulta y de otros artrópodos, que contiene muchos pigmentos oscuros, es un obstáculo importante para la visualización de estructuras dentro de su cuerpo. Además, es fuertemente auto fluorescente que es hecho peor por la fijación. Estas dos características son muy problemáticas para las observaciones de colorantes fluorescentes o moléculas dentro del cuerpo de los animales con un exoesqueleto.
El procedimiento que hemos descrito y que habitualmente utilizam...

Como la extremidad vertebrada, la pierna de adultos del Drosophila está organizada en segmentos. Cada pata de mosca contiene 14 músculos, cada uno de los cuales consta de múltiples fibras musculares1,2. Los cuerpos celulares de los MNs de pierna adulto se encuentran en la T1 (protorácico), T2 (mesotorácicos) y T3 (metathoracic) ganglios a cada lado de la cuerda ventral del nervio (VNC), un estructural análoga a la médula espinal vertebrada (figura 1). Hay aproximadamente 50 minutos en cada uno de los ganglios, cuyo objetivo los músculos en cuatro segmentos de la pierna ipsolateral (coxa, trocánter, fémur y tibia) (figura 1)3. Lo importante, cada pierna adulto individual MN tiene una única identidad morfológica que es altamente estereotipada entre animales3,4. Todos estos MNs únicas derivan de 11 células madre, llamadas neuroblastos (NBs) produciendo MNs de la pierna durante los estadios larvarios3,4. Al final de las etapas larvales todos los MNs postmitotic inmaduros diferencian durante la metamorfosis al adquirir sus árboles dendríticos específicos y objetivos terminal axonales que definen su morfología única3,4. Previamente hemos probado la hipótesis de que un código de combinatorio de factores de transcripción (TFs) especifica la morfología única de cada pata de adultos del Drosophila MN5. Como modelo, se utilizó el linaje B, uno de los 11 linajes NB que produce siete de los MNs y demostró que un código combinatorio de TFs en pierna adulto postmitotic MNs dicta sus morfologías individuales. Por reprogramación del código TF de MNs hemos podido cambiar morfologías MN de manera predecible. Llamamos estos TFs: SMN (morfológicos TFs)5.
Una de las partes más difíciles de los análisis morfológicos de adultos MNs es visualizar los axones a través de una cutícula gruesa y auto-fluorescente con alta resolución. Generalmente la etiqueta de axones con un GFP etiquetadas de membrana que se expresa en el MNs con un sistema binario de la expresión, como DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP o DVglut QF / QUAS mCD8::GFP, donde DVglut es un fuerte conductor expresado en motoneurons6. Al combinar estas herramientas con otras técnicas clonales tales como análisis de mosaico con un marcador repressible (MARCM)7, MARCM cis8o MARCMbow5, podemos restringir la expresión de GFP en subpoblaciones de MNs haciendo el análisis fenotípico de axones más fácil. Hemos generado un protocolo para mantener la pierna morfología axonal MN intacto para la imagen y posterior reconstrucción 3D abordando cuestiones intrínsecas a la pierna de Drosophila adulta tales como (1) fijación de las estructuras internas de la pierna adulto sin afectar la morfología de axón, endógena expresión fluorescente y musculatura de la pierna, (2) montaje de la pierna para preservar la estructura general bajo un cubreobjetos y con la orientación adecuada para la proyección de imagen y (3) de procesamiento de imágenes para obtener la cutícula fondo como señal fluorescente axonal. Aunque este protocolo ha sido detallada para la detección de la expresión fluorescente en axones MN, puede aplicarse para visualizar otros componentes del neuromusculature de la pierna en los artrópodos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E/6550DF/17</td>
			<td>Absolute analytical reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nonionic&#160;surfactant&#160;detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Triton X-100, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td>Jewelers forceps, Dumont No. 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass multi-well plate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71563-01</td>
			<td>9 cavity Pyrex, 100x85 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>28908</td>
			<td>Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP 229-1</td>
			<td>Glycerol (Molecular Biology)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacers</td>
			<td>Sun Jin Lab Co</td>
			<td>IS006</td>
			<td>iSpacer, four wells, around 12 &#956;L working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square 22x22 mm coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FIS#12-541-B</td>
			<td>No.1.5 -0.16 to 0.19mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Vectashield Antifade Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 
			25x/0,8 Imm Korr DIC M27 (oil/ 
			silicon/glycerol/water 
			immersion) (420852-9871-000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imaging software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>ZEN 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D-Image software</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Amira 6.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td>ImageJ/FIJI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualize drosophila leg motor neuron axons through the adult cuticle

La mayoría del trabajo sobre la especificación neuronal se ha realizado en modelos genético y fisiológico manejables como C. elegans, Drosophila larvas y peces, que participan en movimientos ondulatorios (como gatear o natación) como su principal modo de locomoción. Sin embargo, una más sofisticación comprensión de la especificación de cada motoneurona (MN), por lo menos en cuanto a informar a terapias de la enfermedad, exige un sistema igualmente manejable que mejor modela los sistemas complejos basados en apéndices de locomoción de vertebrados. El adulto Drosophila aparato locomotor encargado de caminar cumple todos estos criterios con facilidad, ya que en este modelo es posible estudiar la especificación de un número pequeño de piernas fácilmente distinguido MNs (aproximadamente 50 minutos por pierna) usan una gran matriz de herramientas genéticas de gran alcance y en el contexto fisiológico de un sistema de locomoción basado en el apéndice. Aquí se describe un protocolo para visualizar la inervación del músculo de la pierna en una mosca adulta.

Como se muestra en la figura 4, este procedimiento permite la proyección de imagen excelente de axones GFP marcado en piernas de Drosophila adultas, junto con sus cenadores del terminal. Lo importante es que se obtiene una señal limpia de GFP sin ninguna contaminación de la fluorescencia emitida por la cutícula de la pierna. La señal de la cutícula puede combinarse entonces con la señal de la GFP para identificar el posicionamiento de los axon...

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Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualizar Drosophila pierna axones de la neurona de Motor a través de la cutícula del adulto

Aquí se describe un protocolo para visualizar la orientación axonal con una proteína fluorescente en piernas de adultos del Drosophila por fijación, montaje, proyección de imagen y la proyección de imagen de pasos.

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Este método se puede adaptar fácilmente para observar señales de otras proteínas fluorescentes o se puede utilizar para la imagen de axones en otro adulto La principal ventaja de esta técnica facilita una excelente reconstrucción tridimensional y visualización de los axones y sus árboles terminales. Comience llenando el número adecuado de pozos en una placa de vidrio multi-pozo con 70%etanol. Usa un cepillo para añadir de 15 a 20 moscas anestesadas de dióxido de carbono de cualquier edad o sexo a cada pozo y coloca suavemente las moscas en el etanol hasta que estén completamente sumergidas.Después de no más de un minuto, enjuague las moscas tres veces con una solución de detergente tensioactivo 0,3% no iónico en solución salina tamponada con fosfato durante al menos 10 minutos por lavado. Después del último lavado, utilice fórceps para extraer la cabeza y el abdomen de cada mosca sin dañar el segmento torácico o las piernas y utilice la punta de un par de fórceps finos para aplicar suave pero firmemente presión sobre la unión coxa-tórax para separar una pierna del segmento torácico. Coloque las patas en un pozo de una nueva placa de varios pocillos que contenga 4%paraformaldehído recién preparado sobre hielo para una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados.Es importante empujar las patas suavemente en el tampón de fijación sin dejarlas flotar para obtener patas bien fijas. Al día siguiente, lave las piernas cinco veces en una solución de detergente tensioactivo 0.3% no iónico durante 20 minutos por lavado. Después del último lavado, sustituya el detergente por medio de montaje y mantenga las patas en el medio de montaje durante al menos 24 horas.Al día siguiente, añadir aproximadamente 20 microlitros de 70% glicerol junto al extremo recubierto del portaobjetos del microscopio de vidrio y cubrir el glicerol con un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros. A continuación, añada aproximadamente 10 microlitros de medio de montaje a la derecha del cubreobjetos y aplique una segunda línea de 30 microlitrotros de medio de montaje a la derecha de la línea de 10 microlitro. Usando fórceps finos, transfiera una pierna de la placa multi-pozo en una gota de medio a la tira de 10 microlitrotro del medio de montaje en una orientación externa hacia arriba o hacia abajo.Repita hasta que se hayan montado y alineado seis a ocho patas y coloque un segundo cubreobjetos sobre las patas de forma que el segundo cubreobjetos se apoye ligeramente en el primer cubreobjetos. A continuación, utilice esmalte de uñas en cada esquina de los cubreobjetos para asegurarlos en su lugar. Para crear imágenes de las patas, utilice el láser de 488 nanómetros y dos detectores simultáneamente para configurar la primera pista para obtener la fluorescencia automática GFP y cutícula.Seleccione un objetivo de inmersión de aceite de 20 a 25 veces y establezca la resolución en 1024 por 1024 píxeles con una profundidad de 12 bits y establezca el espaciado z en un micrómetro. Cargue la diapositiva en la etapa del microscopio y utilizando la misma potencia láser para ambos detectores, ajuste la ganancia del primer detector para obtener una señal GFP brillante y ajuste el segundo detector para asegurarse de que algunas áreas con una señal de corte alta produzcan una señal saturada en este detector. A continuación, imagine las patas utilizando las opciones de mosaico o posición para capturar toda la pierna si una pierna está extendida o demasiado grande para ser imagen en un solo marco.Para el procesamiento de imágenes, abra la pila confocal en ImageJ Fiji y utilice el complemento Bio-Formats para abrir cualquier imagen que no esté en formato TIFF. Para dividir los canales, seleccione Imagen, Color y Dividir canales. Para restar la señal de cutícula de la señal GFP, abra Process and Image Calculator y seleccione la pila del detector uno como imagen uno.En la ventana de operación, seleccione restar y seleccione la pista del detector dos como imagen dos para que solo se obtenga la señal GFP endógena. Utilice Imagen, Pilas, Z Protect para generar la proyección de intensidad máxima para la señal GFP endógena. Utilice los controles de la ventana de control de brillo para ajustar el brillo y el contraste.A continuación, genere una intensidad media para la cutícula, seguida de Los canales de imagen, color y fusión para fusionar la pila de GFP con la pila solo de cutícula adquirida del detector dos. Esto dará lugar a una imagen RGB compuesta por la señal GFP específica del tejido, así como la señal de cutícula para ayudar a identificar los árboles de axón dentro de los segmentos de la pierna. Para utilizar la macro, abra la pila confocal y haga clic en Imagen, Ajustar y Brillo/Contraste.A continuación, haga clic en Plugin y Macro Run para ejecutar la macro y siga las instrucciones. Cuando se le pida que especifique la operación en la ventana de la calculadora de imágenes, seleccione la imagen uno como pila uno. En la ventana de operación, seleccione restar.Seleccione la imagen dos como pila dos. Cuando se le pida que ajuste el contraste, utilice los controles en la ventana de control de brillo para ajustar el contraste de brillo de la imagen de proyección máxima de GFP y de la proyección media de la cutícula para generar una imagen combinada RGB de ambas señales que muestran la GFP en verde y la cutícula en gris. A continuación, combine los resultados de la pila uno y la pila dos para generar una GFP combinada y una pila de cutículas que se pueden utilizar en la siguiente etapa.Para visualizar las patas en tres dimensiones, abra la pila RGB en un programa de software 3D adecuado. En la ventana de diálogo emergente, seleccione todos los canales en la sección de conversión de modo e introduzca el tamaño de un voxel obtenido del análisis anterior. En el módulo del canal uno, haga clic con el botón derecho y seleccione Pantalla y Volren.A continuación, haga clic izquierdo en el módulo Volren. En la sección Propiedades, haga clic izquierdo en Avanzado y seleccione DDR. A continuación, ajuste el valor gamma para ver el fondo de la cutícula.En el módulo de canal dos, haga clic con el botón derecho y seleccione Mostrar Volren. A continuación, haga clic izquierdo en el módulo Volren, Editar y seleccione volrenGreen.col. Mediante este procedimiento, la señal de la cutícula se puede combinar con la señal GFP para identificar el posicionamiento de los axones dentro de las patas.Es de vital importancia obtener patas bien fijas. En las patas correctamente fijas, las estructuras internas dentro de las patas son de un color uniforme y las traqueas, que son oscuras, son visibles. En las piernas mal fijas, el material oscuro está presente en el tarso y la tibia y el sistema traqueal no es claramente visible en el fémur y la coxa.El procedimiento que describimos aquí supera el desafío de detectar la expresión fluorescente en los axones de neuronas motoras a través de una cutícula fluorescente gruesa y automática con alta resolución. Así que la señal fluorescente limpia y detallada obtenida nos permite visualizar y cuantificar la característica tridimensional de los arbores de axón utilizando programas de imágenes 3D. Así que esta técnica nos permitirá utilizar Drosophila adulta como modelo no sólo para estudiar el desarrollo de la neurona motora, sino también para estudiar, para entender el impacto de la enfermedad degenerativa como ERAS en el sistema locomotor integrado.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

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Live-proyección de imagen de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Ojo

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Investigación

Biología del Desarrollo

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