Name: oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds
Uploaded: 2018-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds at JoVE.com

وأيد هذا العمل المنح المقدمة من الوزارة الإسبانية للعلوم واللجنة الأوروبية والصناديق عجور للمجلة (AGL2015-65129 آر مينيكو/FEDER وعجور 2014SGR-345). RT يحمل دكتوراه قبل منحة دراسية من عجور (إسبانيا)، ي ي وأيده على زمالة دكتوراه من "مجلس المنح الدراسية الصيني" (الصين) وتقرير وطني معتمد من قبل البرنامج رامون y كيال (تأهيل-2010-06210، 2010، مينيكو). ونحن نشكر الدكتور توريالبا على مشورة الخبراء في إنتاج البروتين، باربا أ من "ميكروسكوبيا دي سيرفي" والدكتور م. كوستا من "سيتوميتريا دي سيرفي" للمستقلة جامعة برشلونة للمساعدة التقنية مفيدة.

إذن جميع الإجراءات التجريبية التي تنطوي على الزرد (دانيو rerio) لجنة الأخلاقيات التابعة لجامعة المستقلة دي برشلونة (سيه رقم 1582) يتفق مع "المبادئ التوجيهية الدولية" "البحوث المتعلقة بالحيوانات" ( EU 2010/63). أجريت جميع التجارب مع الزرد يعيش في 26-28 درجة مئوية.
1. إعداد المعدات التنب...

<ol>
	<li>Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+exposure+of+zebrafish,+Danio+rerio+(Hamilton),+to+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+peregrinum+reveals+the+gastrointestinal+tract+as+the+primary+route+of+infection:+A+potential+model+for+environmental+mycobacterial+infection.">Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection.</a> Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).</li><li>Lovmo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+nanoparticles+and+Mycobacterium+marinum+across+the+intestinal+epithelium+in+zebrafish+and+the+role+of+the+mucosal+immune+system.">Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system.</a> Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Sized+mPEG-PLGA+Nanoparticles+of+Schisantherin+A+with+Sustained+Release+for+Enhanced+Brain+Uptake+and+Anti-Parkinsonian+Activity.">Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).</li><li>Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gavaging+Adult+Zebrafish.">Gavaging Adult Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).</li><li>Kim, S. H., Jang, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+targeting+to+M+cells+for+enhancing+the+efficacy+of+mucosal+vaccines.">Antigen targeting to M cells for enhancing the efficacy of mucosal vaccines.</a> Experimental and Molecular Medicine. 46 (3), 85 (2014).</li><li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adaptive+immunity+by+the+innate+immune+system.">Regulation of adaptive immunity by the innate immune system.</a> Science. 327 (5963), 291-295 (2010).</li><li>Kunisawa, J., Kiyono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+marvel+of+mucosal+T+cells+and+secretory+antibodies+for+the+creation+of+first+lines+of+defense.">A marvel of mucosal T cells and secretory antibodies for the creation of first lines of defense.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1308-1321 (2005).</li><li>Rombout, J. H., Yang, G., Kiron, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+immune+responses+at+mucosal+surfaces+of+teleost+fish.">Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish.</a> Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).</li><li>Salinas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mucosal+Immune+System+of+Teleost+Fish.">The Mucosal Immune System of Teleost Fish.</a> Biology. 4, 525-539 (2015).</li><li>Munang'andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. &. #. 2. 4. 8. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+challenges+limiting+the+design+of+protective+mucosal+vaccines+for+finfish.">An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish.</a> Frontiers in Immunology. 6, 542 (2015).</li><li>Lickwar, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+dissection+of+conserved+transcriptional+regulation+in+intestinal+epithelial+cells.">Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells.</a> PLoS Biology. 15 (8), 2002054 (2017).</li><li>Brand, M., Granato, M., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+zebrafish.">Keeping and raising zebrafish.</a> Zebrafish. 261, 7-37 (2002).</li><li>Ress&#233;guier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+efficient+uptake+of+surfactant-free+poly(lactic+acid)+nanovaccine+vehicles+by+mucosal+dendritic+cells+in+adult+zebrafish+after+bath+immersion.">Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion.</a> Frontiers in Immunology. 8, 190 (2017).</li><li>Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Performance+RNA+Isolation+Using+the+Maxwell+16+Total+RNA+Purification+Kit.">High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit.</a> Promega Notes. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermo+Fisher+Scientific+NanoDrop+1000+spectrophotometer+V3.8+user's+manual.">Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user's manual.</a> Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).</li><li>Lightfoot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+comparison+of+total+RNA+using+the+Agilent+2100+bioanalyzer,+ribogreen+analysis,+and+UV+spectrometry.">Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry.</a> Agilent Application Note. , (2002).</li><li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+digital+MIQE+guidelines:+Minimum+information+for+publication+of+quantitative+digital+PCR+experiments.">The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Renshaw, S., Loynes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), (2011).</li></ol>

هذا البروتوكول تحسين تقنية هو موضح سابقا تنبيب الشفوي من كوليمور et al. 4 لدينا بروتوكول يصف بالتفصيل طريقة تنبيب الشفوي ويشمل إعداد الأمعاء لتحليلات المتلقين للمعلومات. لدينا طريقة تحسين سرعة التلاعب الأسماك السماح لشخص واحد لتنفيذ البروتوكول كله سريعاً، دون تباين كبير ?...

والهدف من هذه المادة وصف في عمق طريقة واضحة تنبيب الشفوي من الزرد، جنبا إلى جنب مع الإجراءات المتلقين للمعلومات المفيدة المرتبطة بها. تنبيب الشفوي استخدام الزرد أصبح نموذج عملي في دراسة ديناميات الأمراض المعدية واللقاحات الفموية/منبه المناعة والإقبال على المخدرات/نانوحبيبات ونجاعة وحصانة المخاطية المعوية. على سبيل المثال، استخدمت الزرد تنبيب الشفوي في دراسة الإصابة بكتريا مارينوم و بكتريا بيريجرينوم 1. لوفمو et al. كما استخدمت بنجاح هذا النموذج لتقديم جسيمات نانوية و M. marinum للقناة الهضمية الزرد الكبار2. وبالإضافة إلى ذلك، يستخدم تشن et al. الزرد تنبيب الشفوي لإظهار أن المخدرات مغلفة بجسيمات نانوية، عندما تدار عبر المسالك المعدية المعوية، ونقلت عبر حاجز الدم الدماغ3. أجرى المؤلفون هذه تنبيب استناداً إلى أسلوب جوفاجي وصف كوليمور et al. 4 مع بعض التعديلات. بيد أنها لا توفر بروتوكول مفصلة للغاية وصف الإجراء تنبيب الشفوي. وهنا نقدم طريقة للفم تنبيب للكبار الزرد بناء على كوليمور et al. 4 ونحن كذلك تشمل إعداد الأمعاء لتحليل المتلقين للمعلومات ذات الصلة الخلوي والفحص المجهري [كنفوكل] و qPCR.
الأمعاء، ولا سيما في الغشاء المخاطي هو الخط الأول للدفاع ضد العدوى والموقع الرئيسي لامتصاص المغذيات5. عند الخلايا الظهارية وعرض مستضد الخلايا ضمن الحواجز المخاطية يرون إشارات الخطر، يتم تشغيل استجابة فورية للمناعة فطرية. المقبل، هي الاستجابة المناعية التكيفية محددة للغاية الذي حددته تي وب لمفاوية6،7. تطوير اللقاحات الفموية مجال تركيز الحالي في اللقاحات. هذه اللقاحات ستكون أداة فعالة لحماية الكائنات الحية في مواقع مكشوفة نظراً لاستجابة محددة من الخلايا المناعية في8،الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالغشاء المخاطي (الشعير)9. في تربية الأحياء المائية، واللقاحات المخاطية قد مزايا واضحة مقارنة باللقاحات عن طريق الحقن. أنها هي العملية لتطعيم، أقل كثيفة العمالة وهي أقل إرهاقاً للأسماك ويمكن أن تدار لصغار الأسماك. ومع ذلك، يجب أن تصل إلى المرشحين لقاح مخاطية الجزء الثاني المتعلق بالقناة الهضمية دون يجري التشويه والتحريف في البيئة عن طريق الفم. أنها أيضا يجب أن تعبر الحواجز المخاطية بغية الوصول إلى مستضد تقديم الخلايا (Apc) للحث على الاستجابات المحلية و/أو النظمية10. ومن ثم اختبار امتصاص المخاطية التي حققها مرشح المستضدات الشفوي ومنظومات إيصالها، فضلا عن الاستجابة المناعية أثارت، أمر ضروري في تطوير اللقاحات الفموية.
في إطار الطب الحيوي، وضع نموذج لاختبار الآثار البيولوجية للمركبات بعد تنبيب الشفوي باهتمام متزايد. العديد من الميزات التشريحية والفسيولوجية للامعاء يتم المحافظة عليها بين الأنساب بيلاتيريان، مع الثدييات والأسماك العظمية11. نموذج تنبيب الشفوي هذا متصلاً بتحليل المتلقين للمعلومات يمكن أن يكون أداة لتوفير رؤى في البيولوجيا البشرية، فضلا عن ساحة اختبار للبيولوجي أو المركبات الأخرى في فيفو.
يمكن أن يؤديها البروتوكول تنبيب الشفوي إلى عامل واحد، مثلاً، إدارة بنجاح يصل إلى 50 ميليلتر من تعليق نانوحبيبات بروتين الأسماك تزن 1 غ، مع معدل البقاء على قيد الحياة عالية. الإجراء إجراء بسيط لإعداد وسريعة؛ يمكن تنبيب الأسماك 30 في ح 1. البروتوكول المتعلق بإعداد الأمعاء هو المفتاح لتوفير نوعية الخلايا والأنسجة وعينات لتحليلها لاحقاً. ترد أمثلة للنتائج النهائية التي تظهر فائدة البروتوكول في الحصول على البيانات ذات الصلة بامتصاص الأمعاء وعزل الحمض النووي الريبي نوعية ل qPCR. البروتوكول ستكون ذات فائدة كبيرة لأولئك الذين يحتاجون إلى نموذج مناسب لاختبار ديناميات الوقائية عن طريق الفم أو غيرها من المركبات في الأمعاء.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1271px;" width="1270">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Silicon tube</td>
			<td style="width:227px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:295px;">508-001</td>
			<td style="width:460px;">0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Luer lock needle</td>
			<td style="width:227px;">Hamilton</td>
			<td style="width:295px;">7750-22</td>
			<td style="width:460px;">31 G, Kel-F Hub</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Luer lock syringe</td>
			<td style="width:227px;">Hamilton</td>
			<td style="width:295px;">81020/01</td>
			<td style="width:460px;">100 &#956;L, Kel-F Hub</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Filtered pipette tip</td>
			<td style="width:227px;">Nerbe Plus</td>
			<td style="width:295px;">07-613-8300</td>
			<td style="width:460px;">10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">MS-222</td>
			<td style="width:227px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">E10521</td>
			<td style="width:460px;">powder</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">10x PBS</td>
			<td style="width:227px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">P5493</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Filter paper&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Filter-Lab</td>
			<td style="width:295px;">RM14034252</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Collagenase</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">17104019</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">31966</td>
			<td style="width:460px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">15240</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:227px;">Falcon</td>
			<td style="width:295px;">352360</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">CellTrics filters&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sysmex Partec</td>
			<td style="width:295px;">04-004-2326 (Wolflabs)</td>
			<td style="width:460px;">30 &#181;m mesh size filters with 2 mL reservoir</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:227px;">SAKURA</td>
			<td style="width:295px;">4583</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plastic molds for cryosections</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4557</td>
			<td>Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Slide</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:295px;">10149870</td>
			<td style="width:460px;">SuperFrost Plus slide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:227px;">Labbox&#160;</td>
			<td style="width:295px;">COVN-024-200</td>
			<td style="width:460px;">24&#180;24 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">158127</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Atto-488 NHS ester</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">41698</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">S5761</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">DMSO</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">D8418</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">AS1340</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:289px;">1-Thioglycerol/Homogenization solution</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td>
			<td style="width:460px;">adding 20 &#956;l 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">vertical laboratory rotator&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Suministros Grupo Esper</td>
			<td style="width:295px;">10000-01062</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cryostat</td>
			<td style="width:227px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:295px;">CM3050S</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:227px;">KINEMATICA</td>
			<td style="width:295px;">Polytron PT1600E</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Flow cytometer&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:295px;">FACS Canto</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">5 mL round bottom tube</td>
			<td style="width:227px;">Falcon</td>
			<td style="width:295px;">352058</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:227px;">Leica</td>
			<td style="width:295px;">SP5</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Fume Hood</td>
			<td style="width:227px;">Kottermann</td>
			<td style="width:295px;">2-447 BST</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Nanodrop 1000</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:295px;">ND-1000</td>
			<td style="width:460px;">Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td style="width:227px;">Agilent</td>
			<td style="width:295px;">G2939A</td>
			<td>RNA bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Maxwell Instrument</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">AS4500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">iScript cDNA synthesis kit&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:295px;">1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:289px;">CFX384 Real-Time PCR&#160;Detection System</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:295px;">1855485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:289px;">iTaq universal SYBR Green Supermix kit</td>
			<td style="width:227px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:295px;">172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Water&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Cryogenic vial&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:295px;">375418</td>
			<td>CryoTube vial</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">F6057</td>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds

معظم مسببات الأمراض تغزو الكائنات عن طريق الغشاء المخاطي بهم. وهذا صحيح بصفة خاصة في الأسماك كما أنهم يتعرضون باستمرار لبيئة مياه الغنية بالجراثيم. تطوير أساليب فعالة لإيصال الفم immunostimulants أو اللقاحات، وتنشيط الجهاز المناعي ضد الأمراض المعدية، مرغوب فيه للغاية. في استنباط أدوات وقائية، هناك حاجة جيدة نماذج تجريبية لاختبار أدائها. هنا، نحن إظهار أسلوب تنبيب الشفوي من الزرد الكبار ومجموعة من الإجراءات لتشريح وإعداد الأمعاء للخلوي ومجهرية [كنفوكل] وتحليل سلسلة من ردود الفعل (qPCR) بوليميريز الكمية. مع أحكام هذا البروتوكول، ونحن تحديداً إدارة وحدات تخزين ما يصل إلى 50 ميليلتر الأسماك تزن حوالي 1 ز ببساطة وسرعة، دون الأضرار بالحيوانات. هذا الأسلوب يسمح لنا باستكشاف مباشرة في فيفو امتصاص مركبات فلوريسسينتلي المسمى مخاطية الأمعاء، وقدرة immunomodulatory مثل البيولوجي في الموقع المحلي بعد التنبيب. عن طريق الجمع بين أساليب المصب مثل التدفق الخلوي، علم الأنسجة، وقبكر ومجهرية [كنفوكل] الأنسجة المعوية، يمكننا أن نفهم كيف إيمونوستيمولانتس أو اللقاحات قادرة على عبور الحواجز المخاطية المعوية، وتمر من خلال بروبريا الصفيحة، و تصل العضلات، وممارسة تأثير على جهاز المناعة المخاطية المعوية. يمكن استخدام النموذج لاختبار المرشح عن طريق الفم الوقائية ومنظومات إيصالها أو تأثير المحلية أي مركب النشطة بيولوجيا تدار شفويا.

الزرد (متوسط الوزن: 1.03 ± ز 0.16) من الجنس المختلط تم تنبيب بنجاح مع البروتين المؤتلف مختلفة جسيمات نانوية (البكتيرية إدراج الهيئات) باستخدام لدينا جهاز محلية الصنع تنبيب الشفوي (الشكل 1). لدينا بنجاح إجراء تنبيب الشفوي وتحقق من معدل وفيات منخفض متوسط النسبة م?...

Watch this Scientific Journal Video about Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds at JoVE.com

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

تنبيب الشفوي من الزرد الكبار: نموذج لتقييم امتصاص الأمعاء للمركبات النشطة بيولوجيا

وصف البروتوكول تنبيب الزرد الكبار مع البيولوجية؛ ثم تشريح وإعداد الأمعاء للخلوي والفحص المجهري [كنفوكل] وقبكر. هذا الأسلوب يسمح لإدارة مركبات النشطة بيولوجيا لرصد امتصاص الأمعاء والتحفيز المناعي المحلية آثار. أنها ذات صلة لاختبار المعوية ديناميات الوقائية عن طريق الفم.

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الغشاء المخاطي ، مثل كيفية امتصاص الغشاء المخاطي للأمعاء للمركبات البيولوجية وكيف تعدل هذه البيولوجية الجهاز المناعي في الموقع المحلي بعد النوبات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه من السهل إعداد ، سريع ، ويظهر معدلات وفيات منخفضة. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة في vaccinology المخاطية.ويمكن أيضا أن تطبق على مركبات أخرى، مثل المواد الكيميائية، والمواد السامة، أو مسببات الأمراض. المرئية مظاهرة من هذه الطريقة أمر بالغ الأهمية كما هو الحال في النوبات عن طريق الفم وتشريح الأمعاء، تحتاج إلى توخي الحذر لأنه في النوبه يمكن أن تجرح حمار وحشي وتسبب الموت. في تشريح، ونهاية الأمعاء هو جيد جدا وهشة.ضع ما يقرب من سنتيمتر واحد من أنابيب السيليكون الدقيقة على إبرة قفل Luer عيار 31. قطع معقمة 10 ميكرولتر مرشح ماصة تلميح، واتخاذ نهاية أدق، ووضعها على أنبوب السيليكون كما اغرد. للبدء، إرفاق جهاز إبرة إلى حقنة 100 ميكرولتر لور لوك.أولاً، نقل السمكة إلى الصهاريج التجريبية ليلة واحدة قبل التجربة. دوامة الحل جسيمات النانو المعدة جيدا، ورسم حجم المطلوب من التعليق. بعد تخدير الأسماك بأمان، استخدم شبكة لنقل الأسماك بسرعة إلى صينية بلاستيكية مبللة.وجه الحيوان أفقيا لمواجهة الإبرة. دعم الأسماك بعناية بيد واحدة، وفتح الفم مع إبرة محمية. ثم، أدخل بلطف الإبرة أسفل المريء إلى حوالي سنتيمتر واحد من فتح الفم.من الصعب أن نرى إلى أي مدى يجب أن تذهب الإبرة ، وهذه مسألة ممارسة. سوف تشعر الإبرة كما يجد وقف، ومن ثم عن طريق التلاعب الإبرة، ستجد زاوية الصحيح لإدراج الجهاز أكثر من ذلك بقليل. حقن ببطء تعليق الجسيمات النانوية في الأسماك، وضمان تعليق لا تتدفق إلى الخارج من خلال الخياشيم أو الفم.بعد ذلك، قم بإزالة الإبرة بلطف، ووضع السمك في خزان الانتعاش. بينما يتعافى السمك، مراقبة الأسماك عن أي تشوهات. وبمجرد أن تتعافى الأسماك، إعادتها إلى أحد الصهاريج التجريبية.بعد القتل الرحيم الأسماك وفقا لبروتوكول النص، ووضع الأسماك على قطعة من ورقة التصفية. باستخدام مقص تشريح حاد، وجعل شق شبه دائري من فتحة الشرج إلى operculum، وفتح شق مع ملاقط غرامة. ثم، قطع طرفي الأمعاء، إخراج جميع الأعضاء الداخلية، ووضعها على ورقة التصفية.بعد ذلك ، افصل الأمعاء عن الأعضاء الداخلية ، وتمدها ، مع الحرص على الحصول على جميع الأمعاء. وأخيراً، استخدم ملاقط لفة الأمعاء على ورق التصفية لفصل الأنسجة اللاصقة. باستخدام هذا البروتوكول، تم بنجاح حمار وحشي من الجنس المختلط intubated مع جسيمات نانوية البروتين المؤتلف مختلفة.وباستخدام جهاز الاحتضان الفموي منزلي الصنع، تم تحقيق متوسط منخفض للنسبة المئوية للوفيات. لتقييم تسليم جسيمات نانوية فلورية مصنوعة من أجسام TNF ألفا المؤتلفة، تم إجراء تحليل للمعالجة الفلورية. وكان إجمالي كمية الخلايا الفلورية أعلى بكثير في مجموعة الجسيمات النانوية المُنخَبة عنها في مجموعة التحكم بعد خمس ساعات و24 ساعة من النوبات.معدات الاحتضان غير مكلفة ودقيقة وقابلة لإعادة الاستخدام. يمكن إجراء النوبات بالكامل بسرعة كبيرة من قبل مشغل واحد ، والأهم من ذلك ، أن الطريقة متسقة بين المشغلين المختلفين. يمكن أن يكون الجمع بين طريقة النوب مع تحليل المصب مثاليًا لتطوير اللقاح الفموي.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

التيموس كاملة في الجرذان الكبار مع غير الغازية التنبيب الرغامي

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

اللثوية Porphyromonas كما كائن نموذج لتقييم تفاعل البكتيريا اللاهوائية مع خلايا المضيف

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

التحديد الكمي لاستعمار الكوليرا والإسهال في النموذج الزرد الكبار

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

السل النمذجة في "الزرد الكبار المصابين" بكتريا مارينوم

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

تحصين الزرد الكبار للفحص السريري للقاحات الحمض النووي القائم

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

تحليلات تستند إلى سلسلة من ردود الفعل بوليميريز الكمية الحجمية المعوية مورين بعد العلاج بالمضادات الحيوية عن طريق الفم

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

نموذج الإدارة عن طريق الفم Galleria mellonella للاستجابات المناعية الفطرية Study Commensal-Induced

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

التقييم الوظيفي نفاذية الأمعاء والهجرة العدلية عبر الإبط في الفئران باستخدام نموذج حلقة معوية موحدة

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

العدوى الفيروسية التجريبية في البعوض البالغ عن طريق التغذية الفموية والحقن المجهري

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...