Name: oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds
Uploaded: 2018-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra det spanske ministerium for videnskab, Europa-Kommissionen og AGAUR midler til NN (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER og 2014SGR-345 AGAUR). RT afholder et PhD legat fra AGAUR (Spanien), JJ blev støttet af et ph.d.-stipendium fra Kina stipendium Rådet (Kina) og NN er understøttet af Ramón y Cajal-programmet (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Vi takker Dr. Torrealba for ekspertrådgivning i protein produktion, N. Barba fra "Servei de Microscopia" og Dr. M. Costa fra "Servei de Citometria" af Universitat Autònoma de Barcelona for nyttige tekniske bistand.

Alle eksperimentelle procedurer, der involverer zebrafisk (Danio rerio) blev godkendt af den etiske komité Universitat Autònoma de Barcelona (CEEH antallet 1582) i samarbejde med den internationale vejledende principper for forskningen involverer dyr ( EU 2010/63). Alle eksperimenter med levende zebrafisk blev udført på 26-28 ° C.
1. forberede udstyr til mundtlig Intubation
<ol><li>Placer ca 1 cm af et fint silikone rør på 31 G Luer lock nål til at dække nål-spidsen.</li>
...

<ol>
	<li>Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+exposure+of+zebrafish,+Danio+rerio+(Hamilton),+to+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+peregrinum+reveals+the+gastrointestinal+tract+as+the+primary+route+of+infection:+A+potential+model+for+environmental+mycobacterial+infection.">Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection.</a> Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).</li><li>Lovmo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+nanoparticles+and+Mycobacterium+marinum+across+the+intestinal+epithelium+in+zebrafish+and+the+role+of+the+mucosal+immune+system.">Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system.</a> Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Sized+mPEG-PLGA+Nanoparticles+of+Schisantherin+A+with+Sustained+Release+for+Enhanced+Brain+Uptake+and+Anti-Parkinsonian+Activity.">Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).</li><li>Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gavaging+Adult+Zebrafish.">Gavaging Adult Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).</li><li>Kim, S. H., Jang, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+targeting+to+M+cells+for+enhancing+the+efficacy+of+mucosal+vaccines.">Antigen targeting to M cells for enhancing the efficacy of mucosal vaccines.</a> Experimental and Molecular Medicine. 46 (3), 85 (2014).</li><li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adaptive+immunity+by+the+innate+immune+system.">Regulation of adaptive immunity by the innate immune system.</a> Science. 327 (5963), 291-295 (2010).</li><li>Kunisawa, J., Kiyono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+marvel+of+mucosal+T+cells+and+secretory+antibodies+for+the+creation+of+first+lines+of+defense.">A marvel of mucosal T cells and secretory antibodies for the creation of first lines of defense.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1308-1321 (2005).</li><li>Rombout, J. H., Yang, G., Kiron, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+immune+responses+at+mucosal+surfaces+of+teleost+fish.">Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish.</a> Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).</li><li>Salinas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mucosal+Immune+System+of+Teleost+Fish.">The Mucosal Immune System of Teleost Fish.</a> Biology. 4, 525-539 (2015).</li><li>Munang'andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. &. #. 2. 4. 8. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+challenges+limiting+the+design+of+protective+mucosal+vaccines+for+finfish.">An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish.</a> Frontiers in Immunology. 6, 542 (2015).</li><li>Lickwar, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+dissection+of+conserved+transcriptional+regulation+in+intestinal+epithelial+cells.">Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells.</a> PLoS Biology. 15 (8), 2002054 (2017).</li><li>Brand, M., Granato, M., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+zebrafish.">Keeping and raising zebrafish.</a> Zebrafish. 261, 7-37 (2002).</li><li>Ress&#233;guier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+efficient+uptake+of+surfactant-free+poly(lactic+acid)+nanovaccine+vehicles+by+mucosal+dendritic+cells+in+adult+zebrafish+after+bath+immersion.">Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion.</a> Frontiers in Immunology. 8, 190 (2017).</li><li>Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Performance+RNA+Isolation+Using+the+Maxwell+16+Total+RNA+Purification+Kit.">High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit.</a> Promega Notes. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermo+Fisher+Scientific+NanoDrop+1000+spectrophotometer+V3.8+user's+manual.">Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user's manual.</a> Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).</li><li>Lightfoot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+comparison+of+total+RNA+using+the+Agilent+2100+bioanalyzer,+ribogreen+analysis,+and+UV+spectrometry.">Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry.</a> Agilent Application Note. , (2002).</li><li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+digital+MIQE+guidelines:+Minimum+information+for+publication+of+quantitative+digital+PCR+experiments.">The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Renshaw, S., Loynes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), (2011).</li></ol>

Denne protokol er en forbedring af den tidligere beskrevne teknik til mundtlige intubation af Collymore et al. 4 vores protokol beskriver i detaljer den mundtlige intubation metode og omfatter udarbejdelse af tarmen for downstream analyser. Vores metode forbedrer fisk manipulation hastighed giver mulighed for en person til at udføre den hele protokol hurtigt, uden megen variation mellem operatører. Et væsentligste forskel i vores protokol med de foregående er at vi evaluere succesen m...

Målet med denne artikel er at beskrive i dybde en enkel metode til oral intubation af zebrafisk, sammen med nyttige tilhørende downstream procedurer. Mundtlige intubation ved hjælp af zebrafisk er blevet en praktisk model i studiet af infektionssygdom dynamics, oral vaccine/immunostimulant, stof/nanopartikel udbredelse og effekt og tarm mucosal immunitet. For eksempel er zebrafisk mundtlige intubation blevet brugt i studiet af Mycobacterium marinum og Mycobacterium peregrinum infektion1. Lovmo et al. også brugt med succes denne model til at levere nanopartikler og M. marinum til mave-tarmkanalen af voksen zebrafisk2. Derudover Chen et al. bruges zebrafisk mundtlige intubation til at vise, at narkotika indkapslet af nanopartikler, hvornår administreres via mave-tarmkanalen, blev transporteret på tværs af blod hjerne barrieren3. Disse forfattere udført intubation baseret på den gauvage metode beskrevet af Collymore et al. 4 med nogle ændringer. Imidlertid de ikke giver en meget detaljeret protokol beskriver proceduren mundtlig intubation. Vi præsenterer her, en metode til oral intubation af voksen zebrafisk bygning på Collymore et al. 4 vi yderligere omfatter forberedelse af tarmen til relevante downstream analyse ved flowcytometri, Konfokal mikroskopi og qPCR.
Tarmen og især dens slimhinde er den første linje i forsvaret mod infektion og den primære lokalitet af næringsstof optagelse5. Når epitelceller og antigen-præsenterer celler inden for mucosale barrierer opfatter faresignaler, udløses en umiddelbar medfødte immunrespons. Næste, den meget specifikke adaptive immunrespons er etableret af T- og B-lymfocytter6,7. Udvikling af mundtlig vaccines er en nuværende fokusområde i vaccinologi. Sådanne vacciner vil være et effektivt redskab til at beskytte organismen på udsatte steder på grund af den specifikke svar af immunceller i slimhinde-associerede lymfoide væv (MALT)8,9. I akvakultur har slimhinde vacciner åbenlyse fordele i forhold til injicerbare vacciner. De er praktiske for massevaccination, mindre arbejdskrævende, er mindre stressende til fisk, og kan gives til unge fisk. Ikke desto mindre skal slimhinde vaccine kandidater nå den anden gut segment uden at blive denatureret i den mundtlige miljø. De skal også krydser mucosale barrierer for at få adgang til antigen præsentere celler (PMV'er) til at fremkalde lokale og/eller systemisk svar10. Dermed, afprøvning af slimhinde optagelsen opnået af kandidatlande mundtlige antigener og deres fremføringsmidler, samt immun reaktion fremkaldt, er afgørende i udviklingen af orale vacciner.
I forbindelse med biomedicinske, udvikle en model for at teste biologiske virkninger af forbindelser efter mundtlig intubation er af stigende interesse. Mange af de anatomiske og fysiologiske funktioner for tarmen er bevaret mellem bilaterian slægter, med pattedyr og knoklede fisk11. Denne mundtlige intubation model tilsluttet downstream analyse kan være et redskab til at give indsigt i menneskets biologi, såvel som et testområde for biologiske lægemidler eller andre forbindelser i vivo.
Den mundtlige intubation protokol kan udføres af én operatør, fxkorrekt administration af op til 50 µL af protein nanopartikel suspension til fisk vejer 1 g, med en høj overlevelsesrate. Proceduren er enkel at sætte op og hurtig; 30 fisk kan være intubated i 1 h. Protokol for tarmen forberedelse er nøglen til at levere kvalitet celle og væv prøver til efterfølgende analyse. Der gives eksempler af downstream resultater som viser den protokol nytte i at opnå data relateret til tarmens optagelse og isolere kvalitet RNA for qPCR. Protokollen ville være til stor gavn for dem, der har behov for en passende model til at teste dynamikken i mundtlig forebyggelse eller andre forbindelser i tarmen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1271px;" width="1270">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Silicon tube</td>
			<td style="width:227px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:295px;">508-001</td>
			<td style="width:460px;">0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Luer lock needle</td>
			<td style="width:227px;">Hamilton</td>
			<td style="width:295px;">7750-22</td>
			<td style="width:460px;">31 G, Kel-F Hub</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Luer lock syringe</td>
			<td style="width:227px;">Hamilton</td>
			<td style="width:295px;">81020/01</td>
			<td style="width:460px;">100 &#956;L, Kel-F Hub</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Filtered pipette tip</td>
			<td style="width:227px;">Nerbe Plus</td>
			<td style="width:295px;">07-613-8300</td>
			<td style="width:460px;">10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">MS-222</td>
			<td style="width:227px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">E10521</td>
			<td style="width:460px;">powder</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">10x PBS</td>
			<td style="width:227px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">P5493</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Filter paper&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Filter-Lab</td>
			<td style="width:295px;">RM14034252</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Collagenase</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">17104019</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">31966</td>
			<td style="width:460px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">15240</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:227px;">Falcon</td>
			<td style="width:295px;">352360</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">CellTrics filters&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sysmex Partec</td>
			<td style="width:295px;">04-004-2326 (Wolflabs)</td>
			<td style="width:460px;">30 &#181;m mesh size filters with 2 mL reservoir</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:227px;">SAKURA</td>
			<td style="width:295px;">4583</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plastic molds for cryosections</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4557</td>
			<td>Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Slide</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:295px;">10149870</td>
			<td style="width:460px;">SuperFrost Plus slide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:227px;">Labbox&#160;</td>
			<td style="width:295px;">COVN-024-200</td>
			<td style="width:460px;">24&#180;24 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">158127</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Atto-488 NHS ester</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">41698</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">S5761</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">DMSO</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">D8418</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">AS1340</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:289px;">1-Thioglycerol/Homogenization solution</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td>
			<td style="width:460px;">adding 20 &#956;l 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">vertical laboratory rotator&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Suministros Grupo Esper</td>
			<td style="width:295px;">10000-01062</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cryostat</td>
			<td style="width:227px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:295px;">CM3050S</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:227px;">KINEMATICA</td>
			<td style="width:295px;">Polytron PT1600E</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Flow cytometer&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:295px;">FACS Canto</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">5 mL round bottom tube</td>
			<td style="width:227px;">Falcon</td>
			<td style="width:295px;">352058</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:227px;">Leica</td>
			<td style="width:295px;">SP5</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Fume Hood</td>
			<td style="width:227px;">Kottermann</td>
			<td style="width:295px;">2-447 BST</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Nanodrop 1000</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:295px;">ND-1000</td>
			<td style="width:460px;">Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td style="width:227px;">Agilent</td>
			<td style="width:295px;">G2939A</td>
			<td>RNA bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Maxwell Instrument</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">AS4500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">iScript cDNA synthesis kit&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:295px;">1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:289px;">CFX384 Real-Time PCR&#160;Detection System</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:295px;">1855485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:289px;">iTaq universal SYBR Green Supermix kit</td>
			<td style="width:227px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:295px;">172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Water&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Cryogenic vial&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:295px;">375418</td>
			<td>CryoTube vial</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">F6057</td>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds

De fleste patogener invaderer organismer gennem deres slimhinde. Dette gælder især i fisk som de konstant er udsat for en mikrobiel-rige vandmiljø. Udvikle effektive metoder til oral levering af immunostimulanter eller vacciner, som aktiverer immunsystemet mod smitsomme sygdomme, er ønskeligt. I udformningen af profylaktisk værktøjer, gode eksperimentelle modeller er nødvendige for at teste deres ydeevne. Her viser vi en metode til oral intubation af voksen zebrafisk og et sæt af procedurer til at dissekere og forberede tarmen til flowcytometri, Konfokal mikroskopi og kvantitative polymerase kæde reaktion (qPCR) analyse. Med denne protokol, kan vi netop administrere mængder op til 50 µL til at fiske, vejer ca. 1 g enkelt og hurtigt, uden at skade dyrene. Denne metode gør det muligt for os at udforske direkte i vivo optagelsen af fluorescently mærket forbindelser i tarmslimhinden og immunmodulerende kapacitet af sådanne biologics på det lokale websted efter intubation. Ved at kombinere downstream metoder såsom flowcytometri, histologi, qPCR og konfokal mikroskopi af tarmens væv, kan vi forstå, hvordan immunostimulanter eller vacciner er i stand til at krydse de intestinale mucosale barrierer, passere gennem lamina propria, og nå muskel, have en virkning på tarmens slimhinde immunsystemet. Modellen kan bruges til at teste kandidat mundtlige forebyggelse og levering systemer eller den lokale virkning af enhver oralt administreret bioaktive foderblandinger.

Zebrafisk (gennemsnitlig vægt: 1,03 ± 0,16 g) af blandet køn var med held intuberet med forskellige rekombinante protein nanopartikler (bakteriel optagelse organer) ved hjælp af vores hjemmelavede mundtlige intubation enhed (figur 1). Vi har med held udført den mundtlige intubation og opnåede en lav gennemsnitlig procent dødelighed (6,8%) (Tabel 1). Zebrafisk var enten intuberet med 30 µL eller 50 µL af nanopartikel suspensioner og d...

Watch this Scientific Journal Video about Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds at JoVE.com

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

Mundtlige Intubation af voksen zebrafisk: en Model for evaluering af tarmens optagelse af bioaktive stoffer

Protokollen beskriver intubere voksen zebrafisk med en biologiske; derefter dissekere og forberede flowcytometri, Konfokal mikroskopi og qPCR tarmen. Denne metode tillader administration af bioaktive stoffer til at overvåge tarmens optagelse og den lokale immun stimulus fremkaldt. Det er relevant for afprøvning intestinal dynamikken i mundtlig forebyggelse.

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i slimhindevaccinologi området, såsom hvordan tarmslimhinden optagelse biologiske forbindelser, og hvordan sådanne biologiske modulere immunsystemet på lokalt sted efter intubation. Den største fordel ved denne teknik er, at det er nemt at oprette, hurtig, og viser lav dødelighed. Denne metode kan give indsigt i slimhindevaccinologi.Det kan også anvendes på andre forbindelser, såsom kemikalier, giftiker, eller patogener. Visuel demonstration af denne metode er kritisk som i den mundtlige intubation og intestinal dissektion trin, skal du være forsigtig, fordi i intubation du kan skade zebrafisk og forårsage død. I dissektion, enden af tarmen er meget fin og skrøbelig.Placer cirka en centimeter af fine silikone slanger på en 31-gauge Luer-lock nål. Skær en steril 10-mikroliter filter pipette spids, tage finere ende, og læg den over silikone røret som en kappe. Til at begynde, fastgør nåleapparatet til en 100-microliter Luer-lock sprøjte.Først skal du flytte fisken til forsøgstankene en nat før eksperimentet. Vortex den forberedte nanopartikel løsning godt, og udarbejde den ønskede mængde af suspensionen. Efter sikkert bedøvende fisken, skal du bruge et net til hurtigt at overføre fisken til en våd plastikbakke.Orient dyret vandret til ansigt nålen. Støt forsigtigt fisken med den ene hånd, og åbn munden med den beskyttede nål. Derefter forsigtigt indsætte nålen ned spiserøret til omkring en centimeter fra munden åbning.Det er svært at se, hvor langt nålen skal gå, og det er et spørgsmål om praksis. Du vil føle nålen, da den finder et stop, og derefter ved at manipulere nålen, vil du finde den korrekte vinkel til at indsætte enheden lidt mere. Injicer langsomt nanopartikelsuspensionen i fisken, så suspensionen ikke strømmer udad gennem gællerne eller munden.Derefter fjernes nålen forsigtigt, og fisken sættes i en bjærgningstank. Mens fisken kommer sig, overvåge fisken for eventuelle abnormiteter. Når fisken er kommet sig, returneres den til et af forsøgstankene.Efter aflive fisken i henhold til tekstprotokollen, skal du placere fisken på et stykke filterpapir. Brug skarpe dissektion saks, lave en halvcirkelformet snit fra anus til operculum, og åbne snittet med fine pincet. Derefter skæres begge ender af tarmen, tage alle de indre organer, og læg dem på filterpapiret.Dernæst adskille tarmen fra de indre organer, og strække det ud, passe på at opnå alle tarmen. Endelig skal du bruge en pincet til at rulle tarmen på filterpapiret for at løsne det klæbende væv. Ved hjælp af denne protokol blev zebrafisk af blandet køn med succes intuberet med forskellige rekombinant protein nanopartikler.Ved hjælp af den hjemmelavede orale intubation enhed, en lav gennemsnitlig procentdel af dødeligheden blev opnået. For at evaluere leveringen af fluorescerende nanopartikler inklusion organer lavet med rekombinant TNF alpha, en cytometri analyse blev udført. Den samlede mængde lysstofrør var signifikant højere i den nanopartikelinduberede gruppe end i kontrolgruppen både fem og 24 timer efter intubation.Intubation-udstyret er billigt, præcist og genanvendeligt. Hele intubationsproceduren kan gøres meget hurtigt af én operatør, og det er vigtigt, at metoden er konsekvent mellem forskellige operatører. Kombinationen af vores intubationsmetode med downstream-analyse kan være ideel til udvikling af oral vaccine.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Anvendelse af en mus Ligated Peyer er Patch Intestinal Loop Assay at evaluere Bakteriel Optagelse ved M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Komplet thymektomi i voksne rotter med Non-invasiv endotrakeal intubation

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis som model organisme for vurdering Interaktion af anaerobe bakterier med værtsceller

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Kvantificering af Vibrio cholerae kolonisering og diarré i den voksne zebrafisk Model

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modellering tuberkulose i Mycobacterium marinum inficeret voksen zebrafisk

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

Immunisering af voksen zebrafisk for præklinisk Screening af DNA-baserede vacciner

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Kvantitative Polymerase Chain Reaction-baserede analyser af Murine tarmens mikrobiota efter peroral antibiotisk behandling

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

En barciak Oral Administration Model til Study Commensal-Induced medfødte immunrespons

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

Funktionel vurdering af tarmgennemtrængelighed og neutrofil transepithelial migration hos mus ved hjælp af en standardiseret tarmsløjfemodel

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Eksperimentel virusinfektion hos voksne myg ved oral fodring og mikroinjektion

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...