Name: oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds
Uploaded: 2018-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions du ministère espagnol de la Science, la commission européenne et des fonds AGAUR NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER et AGAUR 2014SGR-345). RT est titulaire d’une bourse d’études pré-doctorales de AGAUR (Espagne), JJ a été soutenue par une bourse de doctorat de la China Scholarship Council (Chine) et NR est pris en charge par le programme Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Nous remercions m. Torrealba conseils spécialisés dans la production de protéines, N. Barba de la « Servei de Microscopia » et Dr M. Costa de la « Servei de Citometria » de l’Universitat Autònoma de Barcelona pour assistance technique utile.

Toutes les procédures expérimentales impliquant le poisson zèbre (Danio rerio) ont été autorisés par le Comité d’éthique de l’Universitat Autònoma de Barcelona (nombre CEEH 1582) en accord avec les principes directeurs de l’International pour la recherche avec des animaux) EU 2010/63). Toutes les expériences avec webcam live poisson zèbre ont été effectuées à 26 et 28 ° C.
1. préparer le matériel pour l’Intubation orale
<ol><li>Placer environ 1 cm d’un tu...

<ol>
	<li>Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+exposure+of+zebrafish,+Danio+rerio+(Hamilton),+to+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+peregrinum+reveals+the+gastrointestinal+tract+as+the+primary+route+of+infection:+A+potential+model+for+environmental+mycobacterial+infection.">Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection.</a> Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).</li><li>Lovmo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+nanoparticles+and+Mycobacterium+marinum+across+the+intestinal+epithelium+in+zebrafish+and+the+role+of+the+mucosal+immune+system.">Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system.</a> Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Sized+mPEG-PLGA+Nanoparticles+of+Schisantherin+A+with+Sustained+Release+for+Enhanced+Brain+Uptake+and+Anti-Parkinsonian+Activity.">Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).</li><li>Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. 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M., Mutoloki, S., Evensen, O. &. #. 2. 4. 8. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+challenges+limiting+the+design+of+protective+mucosal+vaccines+for+finfish.">An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish.</a> Frontiers in Immunology. 6, 542 (2015).</li><li>Lickwar, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+dissection+of+conserved+transcriptional+regulation+in+intestinal+epithelial+cells.">Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells.</a> PLoS Biology. 15 (8), 2002054 (2017).</li><li>Brand, M., Granato, M., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+zebrafish.">Keeping and raising zebrafish.</a> Zebrafish. 261, 7-37 (2002).</li><li>Ress&#233;guier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+efficient+uptake+of+surfactant-free+poly(lactic+acid)+nanovaccine+vehicles+by+mucosal+dendritic+cells+in+adult+zebrafish+after+bath+immersion.">Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion.</a> Frontiers in Immunology. 8, 190 (2017).</li><li>Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Performance+RNA+Isolation+Using+the+Maxwell+16+Total+RNA+Purification+Kit.">High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit.</a> Promega Notes. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermo+Fisher+Scientific+NanoDrop+1000+spectrophotometer+V3.8+user's+manual.">Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user's manual.</a> Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).</li><li>Lightfoot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+comparison+of+total+RNA+using+the+Agilent+2100+bioanalyzer,+ribogreen+analysis,+and+UV+spectrometry.">Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry.</a> Agilent Application Note. , (2002).</li><li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+digital+MIQE+guidelines:+Minimum+information+for+publication+of+quantitative+digital+PCR+experiments.">The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Renshaw, S., Loynes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), (2011).</li></ol>

Ce protocole est une amélioration de la technique décrite précédemment pour l’intubation orale par Collymore et al. 4 notre protocole décrit en détail la méthode intubation orale et comprend la préparation de l’intestin pour les analyses en aval. Notre méthode améliore la vitesse de manipulation de poissons permettant à une personne d’effectuer le protocole entier rapidement, sans beaucoup de variation entre les opérateurs. Une différence principale de notre protocole a...

L’objectif de cet article est de décrire en détail une méthode simple pour l’intubation orale du poisson-zèbre, ainsi que des procédures en aval connexes utiles. Intubation orale à l’aide de poisson-zèbre est devenu un modèle de pratique dans l’étude de la dynamique des maladies infectieuses, vaccin oral/immunostimulant, absorption de drogues/NANOPARTICULE et efficacité et immunité muqueuse intestinale. Par exemple, le poisson zèbre intubation orale a été utilisée dans l’étude de l’infection à Mycobacterium marinum et Mycobacterium peregrinum 1. Lovmo et al. également utilisé avec succès ce modèle pour livrer des nanoparticules et M. marinum vers le tractus gastro-intestinal du poisson-zèbre adulte2. En outre, Chen et coll. utilisé zebrafish intubation orale pour montrer que les médicaments encapsulés par nanoparticules, quand administré via le tractus gastro-intestinal, ont été transportés à travers le sang cerveau barrière3. Ces auteurs ont effectué l’intubation selon la méthode de gauvage décrite par Collymore et al. 4 sous réserve de modifications. Toutefois, ils ne prévoyaient pas un protocole très détaillé décrivant la procédure d’intubation orale. Ici, nous présentons une méthode pour l’intubation orale du poisson-zèbre adulte s’appuyant sur l’arrêt Collymore et al. 4 nous incluons également la préparation de l’intestin pour analyse en aval pertinent par cytométrie en flux, microscopie confocale et qPCR.
L’intestin et particulièrement sa muqueuse est la première ligne de défense contre l’infection et le principal site d’absorption des éléments nutritifs5. Lorsque les cellules épithéliales et les cellules présentatrices d’antigène dans les barrières muqueuses perçoivent les signaux de danger, une réponse immédiate d’immunitaire innée est déclenchée. Ensuite, l’immuno-réaction adaptative très spécifique est établie par de6,les lymphocytes T et B7. Mise au point de vaccins oraux est une zone de mise au point actuelle en vaccinologie. Ces vaccins serait un outil efficace pour protéger l’organisme à des sites exposés en raison de la réponse spécifique des cellules immunitaires dans les tissus lymphoïdes associé aux muqueuses (MALT)8,9. En aquaculture, les vaccins ont des avantages évidents par rapport à l’aide de vaccins injectables. Ils sont pratiques pour la vaccination de masse, beaucoup moins de travail, sont moins stressants pour les poissons et peuvent être administrés aux jeunes poissons. Néanmoins, muqueuse vaccins candidats doivent atteindre le deuxième segment de l’intestin sans être dénaturé dans le milieu buccal. Ils doivent aussi franchir les obstacles muqueux pour accéder à l’antigène présentant des cellules (CPA) pour provoquer des réactions locales ou systémiques,10. Test de l’absorption muqueuse atteindre par les antigènes orale de candidats et de leurs vecteurs, ainsi que de la réponse immunitaire évoquée, est donc essentiel dans le développement de vaccins oraux.
Dans un contexte biomédical, élaboration d’un modèle pour tester les effets biologiques des composés après que intubation orale est d’un intérêt croissant. Bon nombre des caractéristiques anatomiques et physiologiques de l’intestin sont conservées entre deux lignées forment, avec les mammifères et poissons osseux11. Ce modèle d’intubation orale relié à l’analyse en aval peut être un outil pour donner un aperçu de la biologie humaine, mais aussi un terrain d’essai pour les produits biologiques ou autres composés en vivo.
Le protocole d’intubation orale peut être effectué par un seul opérateur, par exemple, administrer avec succès jusqu'à 50 µL de la suspension de nanoparticules de protéines de poissons pesant 1 g, avec un taux de survie élevé. La procédure est simple à mettre en place et rapide ; 30 poissons peuvent être intubés en 1 h. Le protocole pour la préparation intestinale est essentielle pour fournir des échantillons de cellules et de tissus de qualité pour une analyse ultérieure. On trouvera des exemples de résultats en aval qui montrent utilité du protocole dans l’obtention de données relies à l’absorption intestinale et à isoler l’ARN de qualité pour qPCR. Le protocole serait d’une grande utilité pour ceux qui ont besoin d’un modèle approprié pour tester la dynamique de la prophylaxie par voie orale ou d’autres composés dans l’intestin.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1271px;" width="1270">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Silicon tube</td>
			<td style="width:227px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:295px;">508-001</td>
			<td style="width:460px;">0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Luer lock needle</td>
			<td style="width:227px;">Hamilton</td>
			<td style="width:295px;">7750-22</td>
			<td style="width:460px;">31 G, Kel-F Hub</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Luer lock syringe</td>
			<td style="width:227px;">Hamilton</td>
			<td style="width:295px;">81020/01</td>
			<td style="width:460px;">100 &#956;L, Kel-F Hub</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Filtered pipette tip</td>
			<td style="width:227px;">Nerbe Plus</td>
			<td style="width:295px;">07-613-8300</td>
			<td style="width:460px;">10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">MS-222</td>
			<td style="width:227px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">E10521</td>
			<td style="width:460px;">powder</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">10x PBS</td>
			<td style="width:227px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">P5493</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Filter paper&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Filter-Lab</td>
			<td style="width:295px;">RM14034252</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Collagenase</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">17104019</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">31966</td>
			<td style="width:460px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">15240</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:227px;">Falcon</td>
			<td style="width:295px;">352360</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">CellTrics filters&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sysmex Partec</td>
			<td style="width:295px;">04-004-2326 (Wolflabs)</td>
			<td style="width:460px;">30 &#181;m mesh size filters with 2 mL reservoir</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:227px;">SAKURA</td>
			<td style="width:295px;">4583</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plastic molds for cryosections</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4557</td>
			<td>Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Slide</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:295px;">10149870</td>
			<td style="width:460px;">SuperFrost Plus slide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:227px;">Labbox&#160;</td>
			<td style="width:295px;">COVN-024-200</td>
			<td style="width:460px;">24&#180;24 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">158127</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Atto-488 NHS ester</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">41698</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">S5761</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">DMSO</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">D8418</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">AS1340</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:289px;">1-Thioglycerol/Homogenization solution</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td>
			<td style="width:460px;">adding 20 &#956;l 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">vertical laboratory rotator&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Suministros Grupo Esper</td>
			<td style="width:295px;">10000-01062</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cryostat</td>
			<td style="width:227px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:295px;">CM3050S</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:227px;">KINEMATICA</td>
			<td style="width:295px;">Polytron PT1600E</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Flow cytometer&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:295px;">FACS Canto</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">5 mL round bottom tube</td>
			<td style="width:227px;">Falcon</td>
			<td style="width:295px;">352058</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:227px;">Leica</td>
			<td style="width:295px;">SP5</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Fume Hood</td>
			<td style="width:227px;">Kottermann</td>
			<td style="width:295px;">2-447 BST</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Nanodrop 1000</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:295px;">ND-1000</td>
			<td style="width:460px;">Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td style="width:227px;">Agilent</td>
			<td style="width:295px;">G2939A</td>
			<td>RNA bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Maxwell Instrument</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">AS4500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">iScript cDNA synthesis kit&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:295px;">1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:289px;">CFX384 Real-Time PCR&#160;Detection System</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:295px;">1855485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:289px;">iTaq universal SYBR Green Supermix kit</td>
			<td style="width:227px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:295px;">172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Water&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Cryogenic vial&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:295px;">375418</td>
			<td>CryoTube vial</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">F6057</td>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds

Plupart des agents pathogènes envahissent les organismes par l’intermédiaire de leur muqueuse. Cela est particulièrement vrai chez les poissons, car ils sont exposés en permanence à un environnement microbien riches en eau. Développer des méthodes efficaces pour l’administration orale d’immunostimulants ou de vaccins, qui activent le système immunitaire contre les maladies infectieuses, est hautement souhaitable. Dans l’élaboration des outils prophylactiques, bons modèles expérimentaux sont nécessaires pour tester leurs performances. Ici, nous montrons une méthode pour l’intubation orale du poisson-zèbre adulte et un ensemble de procédures de disséquer et de préparer l’intestin pour la cytométrie en flux, microscopie confocale et analyse la réaction en chaîne (qPCR) polymérase quantitative. Avec ce protocole, nous pouvons administrer précisément les volumes jusqu'à 50 µL de pêcher pesant environ 1 g simplement et rapidement, sans nuire aux animaux. Cette méthode permet d’explorer l’absorption directe in vivo des composés fluorescents marqués par la muqueuse intestinale et la capacité immunomodulatrice de tels produits biologiques sur le site local après intubation. En combinant des méthodes en aval comme la cytométrie en flux, histologie, qPCR et microscopie confocale du tissu intestinal, nous pouvons comprendre comment immunostimulants ou vaccins sont capables de traverser les barrières muqueuses intestinales, passent par la lamina propria, et atteindre le muscle, exerçant un effet sur le système immunitaire des muqueuses intestinal. Le modèle pourrait servir à tester la prophylaxie orale de candidat et de vecteurs ou de l’effet local de tous les composés bioactifs administré par voie orale.

Poisson-zèbre (poids moyen : 1,03 ± 0,16 g) de sexe mixte ont été intubés avec succès avec des nanoparticules de différentes protéines recombinantes (inclusions bactériennes) à l’aide de notre dispositif d’intubation orale fait maison (Figure 1). Nous avons avec succès effectué l’intubation orale et atteint un taux de mortalité faible pourcentage moyen (6,8 %) (Tableau 1). Poisson zèbre ont été soit intubé avec 30 µL ...

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Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

Intubation orale du poisson-zèbre adulte : un modèle pour l’évaluation de l’absorption intestinale des composés bioactifs

Le protocole décrit intubating poisson-zèbre adulte avec un produit biologique ; puis dissection et la préparation de l’intestin pour la cytométrie en flux, microscopie confocale et qPCR. Cette méthode permet à l’administration de composés bioactifs pour surveiller l’absorption intestinale et la stimulation immunitaire locale évoquée. Il est utile pour tester la dynamique intestinale de la prophylaxie par voie orale.

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la vaccinologie muqueuse, telles que la façon dont la muqueuse intestinale absorption des composés biologiques et comment ces produits biologiques modulent le système immunitaire au site local après l’intubation. Le principal avantage de cette technique est qu’il est simple à mettre en place, rapide, et montre de faibles taux de mortalité. Cette méthode peut fournir un aperçu de la vaccinologie muqueuse.Il peut également être appliqué à d’autres composés, tels que les produits chimiques, les substances toxiques ou les agents pathogènes. La démonstration visuelle de cette méthode est critique car dans les étapes orales d’intubation et de dissection intestinale, vous devez être prudent parce que dans l’intubation vous pourriez blesser le poisson zèbre et causer la mort. En dissection, l’extrémité de l’intestin est très fine et fragile.Placez environ un centimètre de tubes en silicone fin sur une aiguille luer-lock de calibre 31. Coupez une pointe stérile de pipette filtrant de 10 microlitres, prenez l’extrémité la plus fine et placez-la sur le tube de silicone comme gaine. Pour commencer, fixez l’appareil à aiguille à une seringue luer-lock de 100 microlitres.Tout d’abord, déplacez le poisson vers les réservoirs expérimentaux une nuit avant l’expérience. Vortex la solution de nanoparticule préparée bien, et d’élaborer le volume désiré de la suspension. Après avoir anesthésier le poisson en toute sécurité, utilisez un filet pour transférer rapidement le poisson dans un plateau en plastique humide.Orientez l’animal horizontalement pour faire face à l’aiguille. Soutenir soigneusement le poisson d’une main et ouvrir la bouche avec l’aiguille protégée. Puis, insérez doucement l’aiguille vers le bas de l’œsophage à environ un centimètre de l’ouverture de la bouche.Il est difficile de voir jusqu’où l’aiguille doit aller, et c’est une question de pratique. Vous sentirez l’aiguille comme il trouve un arrêt, puis en manipulant l’aiguille, vous trouverez l’angle correct pour insérer l’appareil un peu plus. Injectez lentement la suspension des nanoparticules dans le poisson, en veillant à ce que la suspension ne s’écoule pas vers l’extérieur par les branchies ou la bouche.Après cela, retirez doucement l’aiguille et placez le poisson dans un réservoir de récupération. Pendant que le poisson récupère, surveillez le poisson pour toutes les anomalies. Une fois le poisson récupéré, retournez-le dans l’un des réservoirs expérimentaux.Après avoir euthanasié le poisson selon le protocole du texte, placez le poisson sur un morceau de papier filtre. À l’aide de ciseaux de dissection tranchants, faire une incision semi-circulaire de l’anus à l’operculum, et ouvrir l’incision avec des pinces fines. Ensuite, coupez les deux extrémités de l’intestin, sortez tous les organes internes et placez-les sur le papier filtre.Ensuite, séparez l’intestin des organes internes, et étirez-le, en prenant soin d’obtenir tout l’intestin. Enfin, utilisez des pinces à épiler pour rouler l’intestin sur le papier filtre pour détacher le tissu adhésif. Utilisant ce protocole, le poisson zèbre du sexe mélangé ont été avec succès intubés avec différentes nanoparticules recombinantes de protéine.Utilisant le dispositif oral fait maison d’intubation, un faible pourcentage moyen de mortalité a été réalisé. Pour évaluer la livraison des corps fluorescents d’inclusion de nanoparticules faits avec l’alpha recombinant de TNF, une analyse de cytométrie a été exécutée. La quantité totale de cellules fluorescentes était significativement plus élevée dans le groupe intubé par nanoparticules que dans le groupe témoin cinq et 24 heures après l’intubation.L’équipement d’intubation est peu coûteux, précis et réutilisable. L’ensemble de la procédure d’intubation peut être fait très rapidement par un opérateur, et, surtout, la méthode est cohérente entre les différents opérateurs. La combinaison de notre méthode d’intubation et de l’analyse en aval pourrait être idéale pour la mise au point d’un vaccin oral.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application d&#39;une souris ligaturés Assay Peyer Patch anse intestinale pour évaluer absorption par les cellules bactériennes M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Recherche

Immunologie et infection

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Thymectomie complète chez des rats adultes avec les non-invasive intubation endotrachéale

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

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Porphyromonas gingivalis comme un organisme modèle pour l&#39;évaluation de l&#39;interaction des bactéries anaérobies avec des cellules hôtes

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

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Quantifier la colonisation de Vibrio cholerae et la diarrhée dans le modèle de poisson-zèbre adulte

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modélisation de la tuberculose chez Mycobacterium marinum adultes infectés poisson zèbre

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

Vaccination de poisson-zèbre adulte pour la projection préclinique des vaccins basés sur l’ADN

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Analyses de polymérase quantitative axée sur la réaction en chaîne de murin microbiote Intestinal après un traitement antibiotique par voie orale

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Un modèle d’Administration orale à des réponses immunitaires innées Study Commensal-Induced Galleria mellonella

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

Évaluation fonctionnelle de la perméabilité intestinale et de la migration transépithéliale des neutrophiles chez la souris à l’aide d’un modèle normalisé de boucle intestinale

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Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Infection virale expérimentale chez les moustiques adultes par alimentation orale et micro-injection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...