Name: oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds
Uploaded: 2018-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse vom spanischen Ministerium für Wissenschaft, Europäische Kommission und AGAUR Mittel zur NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER und 2014SGR-345 AGAUR) unterstützt. RT hält ein Pre-Promotionsstipendium aus AGAUR (Spanien), JJ wurde unterstützt durch ein Promotionsstipendium von der China Scholarship Council (China) und NR stützt sich auf das Ramón y Cajal-Programm (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Wir danken Dr. Torrealba für kompetente Beratung in Protein-Produktion, N. Barba aus "Servei de Microscopia" und Dr. M. Costa von der "Servei de Citometria" von der Universitat Autònoma de Barcelona für hilfreiche technische Unterstützung.

Alle experimentellen Verfahren Zebrafisch (Danio Rerio) wurden von der Ethikkommission der Universitat Autònoma de Barcelona (CEEH Nummer 1582) im Einvernehmen mit der internationalen Leitprinzipien für Forschung an denen Tiere (autorisiert. EU 2010/63). Alle Experimente mit live Zebrafisch wurden bei 26 – 28 ° c durchgeführt.
1. Vorbereitung der Ausrüstung für orale Intubation
<ol><li>Legen Sie ca. 1 cm von einem feinen Silikonschlauch auf einer 31 G Luer Lock Nadel an der ...

<ol>
	<li>Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+exposure+of+zebrafish,+Danio+rerio+(Hamilton),+to+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+peregrinum+reveals+the+gastrointestinal+tract+as+the+primary+route+of+infection:+A+potential+model+for+environmental+mycobacterial+infection.">Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection.</a> Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).</li><li>Lovmo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+nanoparticles+and+Mycobacterium+marinum+across+the+intestinal+epithelium+in+zebrafish+and+the+role+of+the+mucosal+immune+system.">Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system.</a> Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Sized+mPEG-PLGA+Nanoparticles+of+Schisantherin+A+with+Sustained+Release+for+Enhanced+Brain+Uptake+and+Anti-Parkinsonian+Activity.">Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).</li><li>Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gavaging+Adult+Zebrafish.">Gavaging Adult Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).</li><li>Kim, S. H., Jang, Y. 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H., Yang, G., Kiron, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+immune+responses+at+mucosal+surfaces+of+teleost+fish.">Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish.</a> Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).</li><li>Salinas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mucosal+Immune+System+of+Teleost+Fish.">The Mucosal Immune System of Teleost Fish.</a> Biology. 4, 525-539 (2015).</li><li>Munang'andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. &. #. 2. 4. 8. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+challenges+limiting+the+design+of+protective+mucosal+vaccines+for+finfish.">An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish.</a> Frontiers in Immunology. 6, 542 (2015).</li><li>Lickwar, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+dissection+of+conserved+transcriptional+regulation+in+intestinal+epithelial+cells.">Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells.</a> PLoS Biology. 15 (8), 2002054 (2017).</li><li>Brand, M., Granato, M., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+zebrafish.">Keeping and raising zebrafish.</a> Zebrafish. 261, 7-37 (2002).</li><li>Ress&#233;guier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+efficient+uptake+of+surfactant-free+poly(lactic+acid)+nanovaccine+vehicles+by+mucosal+dendritic+cells+in+adult+zebrafish+after+bath+immersion.">Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion.</a> Frontiers in Immunology. 8, 190 (2017).</li><li>Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Performance+RNA+Isolation+Using+the+Maxwell+16+Total+RNA+Purification+Kit.">High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit.</a> Promega Notes. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermo+Fisher+Scientific+NanoDrop+1000+spectrophotometer+V3.8+user's+manual.">Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user's manual.</a> Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).</li><li>Lightfoot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+comparison+of+total+RNA+using+the+Agilent+2100+bioanalyzer,+ribogreen+analysis,+and+UV+spectrometry.">Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry.</a> Agilent Application Note. , (2002).</li><li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+digital+MIQE+guidelines:+Minimum+information+for+publication+of+quantitative+digital+PCR+experiments.">The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Renshaw, S., Loynes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), (2011).</li></ol>

Dieses Protokoll ist eine Verbesserung der zuvor beschriebenen Technik für orale Intubation von Collymore Et al. 4 unser Protokoll beschreibt im Detail die orale Intubation Methode und umfasst die Vorbereitung des Darms für nachgelagerte Analysen. Unsere Methode verbessert Fisch Manipulation Geschwindigkeit, so dass eine Person das gesamte Protokoll schnell und ohne viel Variation zwischen den Betreibern durchführen. Ein Hauptunterschied von unserem Protokoll mit dem vorherigen ist, da...

Das Ziel dieses Artikels soll in der Tiefe eine einfache Methode für die orale Intubation Zebrafisch, zusammen mit nützlichen verbunden nachgelagerten Verfahren beschreiben. Orale Intubation mit Zebrafisch ist ein praktisches Modell bei der Untersuchung von Infektionskrankheiten Dynamik, oralen Impfstoff/immunstimulierende Medikament/Nanoparticle Aufnahme und Wirksamkeit und Darm-Schleimhaut Immunität geworden. Zebrafisch orale Intubation wird zum Beispiel in der Studie von Mycobacterium Marinum und Mycobacterium Peregrinum Infektion1eingesetzt wurden. Lovmo Et al. auch zur erfolgreich dieses Modell Nanopartikel und M. Marinum mit dem Magen-Darm-Trakt von Erwachsenen Zebrafisch2liefern. Darüber hinaus verwendet Chen Et Al. Zebrafisch orale Intubation um zu zeigen, dass Drogen durch Nanopartikel verkapselt wann verabreicht über den Magen-Darm-Trakt, über die Blut-Gehirn-Schranke3transportiert wurden. Diese Autoren durchgeführt Intubation basierend auf der Gauvage-Methode von Collymore Et Al. beschrieben 4 mit einigen Änderungen. Allerdings hat sie kein sehr detailliertes Protokoll beschreibt die orale Intubation Verfahren bereitgestellt. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode für die orale Intubation Erwachsenen Zebrafisch aufbauend auf Collymore Et al. 4 wir sind weiter die Vorbereitung des Darms für nachgelagerte Analyse zytometrie, konfokale Mikroskopie und qPCR.
Der Darm und vor allem seine Schleimhaut ist die erste Linie der Verteidigung gegen Infektion und die primären Ort der Nährstoffaufnahme5. Wenn die Epithelzellen und Antigen-präsentierenden Zellen in der Schleimhaut Barrieren Gefahrensignale wahrnehmen, ist eine sofortige angeborene Immunantwort ausgelöst. Als nächstes ist die hochspezifische adaptiven Immunantwort von T- und B-Lymphozyten6,7gegründet. Entwicklung von oralen Impfstoffen ist ein aktueller Schwerpunkt im Vaccinology. Solchen Impfstoffen wäre ein effektives Werkzeug, um den Organismus an exponierten Standorten aufgrund der spezifischen Reaktion der Immunzellen in der Mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT)8,9zu schützen. In der Aquakultur haben Schleimhaut-Impfstoffe offensichtliche Vorteile im Vergleich zu injizierbaren Impfstoffen. Sie sind praktisch für Massenimpfungen, weniger arbeitsintensiv, sind für die Fische weniger belastend und Jungfische verabreicht werden können. Dennoch müssen Schleimhaut Impfstoffkandidaten das zweite Segment der Darm erreichen, ohne in die Mundhöhle denaturiert wird. Sie müssen auch Schleimhaut Hindernisse überqueren, um Zugriff auf antigenpräsentierende Zellen (APCs), lokale und/oder systemische Reaktionen10zu induzieren. Daher unbedingt testen der Schleimhaut-Aufnahme durch die Kandidaten mündliche Antigene und ihrer Trägersysteme erreicht, sowie die Immunantwort hervorgerufen, bei der Entwicklung von oralen Impfstoffen.
In einem biomedizinischen Kontext entwickelt ein Modell, um die biologische Wirkungen von Verbindungen zu testen, nachdem orale Intubation von Interesse ist. Viele von den anatomischen und physiologischen Merkmale des Darms sind zwischen Bilaterian Linien mit Säugetieren und Knochenfische11konserviert. Diese orale Intubation Modell an nachgelagerte Analyse angeschlossen kann ein Werkzeug, um Einblicke in die menschliche Biologie sowie ein Testfeld für Biologics zur Verfügung zu stellen oder andere Substanzen in Vivo.
Die orale Intubation Protokoll kann von einem Bediener, z.B.erfolgreich administrieren bis zu 50 µL der Protein Nanopartikel Suspension mit einem Gewicht von 1 g, mit eine hohe Überlebensrate Fischen durchgeführt werden. Das Verfahren ist einfach einzurichten und schnell; 30 Fische können in 1 h intubiert werden. Das Protokoll für Darm Vorbereitung ist Schlüssel zur Bereitstellung von QUALITÄTSPROBEN Zell- und für die spätere Analyse. Der nachgeschaltete Ergebnisse Beispiele die zeigen das Protokoll nutzen bei der Beschaffung von Daten in Bezug auf intestinale Aufnahme und Qualität RNA für qPCR zu isolieren. Das Protokoll wäre von großem Nutzen für diejenigen, die ein geeignetes Modell, um die Dynamik von oralen Prophylaxe oder andere Verbindungen im Darm zu testen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1271px;" width="1270">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Silicon tube</td>
			<td style="width:227px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:295px;">508-001</td>
			<td style="width:460px;">0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Luer lock needle</td>
			<td style="width:227px;">Hamilton</td>
			<td style="width:295px;">7750-22</td>
			<td style="width:460px;">31 G, Kel-F Hub</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Luer lock syringe</td>
			<td style="width:227px;">Hamilton</td>
			<td style="width:295px;">81020/01</td>
			<td style="width:460px;">100 &#956;L, Kel-F Hub</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Filtered pipette tip</td>
			<td style="width:227px;">Nerbe Plus</td>
			<td style="width:295px;">07-613-8300</td>
			<td style="width:460px;">10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">MS-222</td>
			<td style="width:227px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">E10521</td>
			<td style="width:460px;">powder</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">10x PBS</td>
			<td style="width:227px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">P5493</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Filter paper&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Filter-Lab</td>
			<td style="width:295px;">RM14034252</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Collagenase</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">17104019</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">31966</td>
			<td style="width:460px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">15240</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:227px;">Falcon</td>
			<td style="width:295px;">352360</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">CellTrics filters&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sysmex Partec</td>
			<td style="width:295px;">04-004-2326 (Wolflabs)</td>
			<td style="width:460px;">30 &#181;m mesh size filters with 2 mL reservoir</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:227px;">SAKURA</td>
			<td style="width:295px;">4583</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plastic molds for cryosections</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4557</td>
			<td>Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Slide</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:295px;">10149870</td>
			<td style="width:460px;">SuperFrost Plus slide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:227px;">Labbox&#160;</td>
			<td style="width:295px;">COVN-024-200</td>
			<td style="width:460px;">24&#180;24 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">158127</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Atto-488 NHS ester</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">41698</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">S5761</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">DMSO</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">D8418</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">AS1340</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:289px;">1-Thioglycerol/Homogenization solution</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td>
			<td style="width:460px;">adding 20 &#956;l 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">vertical laboratory rotator&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Suministros Grupo Esper</td>
			<td style="width:295px;">10000-01062</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cryostat</td>
			<td style="width:227px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:295px;">CM3050S</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:227px;">KINEMATICA</td>
			<td style="width:295px;">Polytron PT1600E</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Flow cytometer&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:295px;">FACS Canto</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">5 mL round bottom tube</td>
			<td style="width:227px;">Falcon</td>
			<td style="width:295px;">352058</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:227px;">Leica</td>
			<td style="width:295px;">SP5</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Fume Hood</td>
			<td style="width:227px;">Kottermann</td>
			<td style="width:295px;">2-447 BST</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Nanodrop 1000</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:295px;">ND-1000</td>
			<td style="width:460px;">Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td style="width:227px;">Agilent</td>
			<td style="width:295px;">G2939A</td>
			<td>RNA bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Maxwell Instrument</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">AS4500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">iScript cDNA synthesis kit&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:295px;">1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:289px;">CFX384 Real-Time PCR&#160;Detection System</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:295px;">1855485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:289px;">iTaq universal SYBR Green Supermix kit</td>
			<td style="width:227px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:295px;">172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Water&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Cryogenic vial&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:295px;">375418</td>
			<td>CryoTube vial</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">F6057</td>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds

Die meisten Krankheitserreger dringen in Organismen durch ihre Schleimhaut. Dies gilt insbesondere bei Fischen wie sie kontinuierlich zu einer mikrobiellen angereicherte Wasser Umwelt ausgesetzt sind. Entwicklung effektiver Methoden zur mündlichen Lieferung von immunstimulantien oder Impfstoffe, die das Immunsystem gegen Infektionskrankheiten zu aktivieren, ist höchst wünschenswert. Bei der Ausarbeitung prophylaktische Werkzeuge, werden gute experimentelle Modelle benötigt, um ihre Leistung zu testen. Hier zeigen wir eine Methode für die orale Intubation Erwachsenen Zebrafisch und eine Reihe von Verfahren zu sezieren und zytometrie, konfokale Mikroskopie und quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) Analyse des Darms vorbereiten. Mit diesem Protokoll können wir präzise Volumen bis zu 50 µL für Fische mit einem Gewicht von ca. 1 g einfach und schnell, ohne Schädigung der Tiere verwalten. Diese Methode ermöglicht es uns, die Aufnahme direkt in Vivo eindringmittel gekennzeichneten Verbindungen durch die Darmschleimhaut und die immunmodulatorische Fähigkeit von solchen Biologics am lokalen Standort nach Intubation zu erkunden. Durch die Kombination von nachgelagerten Verfahren wie Durchflusszytometrie, Histologie, qPCR und konfokalen Mikroskopie des intestinalen Gewebes, können wir verstehen, wie immunstimulantien oder Impfstoffe in der Lage sind, die intestinale Schleimhaut-Hindernisse überqueren, durchlaufen die Lamina Propria und den Muskel, übt eine Wirkung auf die intestinalen mukosalen Immunsystems zu erreichen. Das Modell könnte verwendet werden, um Kandidaten orale Prophylaxe und Delivery-Systeme oder die lokale Wirkung von eine oral verabreichte bioaktive Verbindung testen.

Zebrafisch (durchschnittliches Gewicht: 1,03 ± 0,16 g) des gemischten Geschlechts wurden erfolgreich intubiert mit verschiedenen rekombinanten Proteins Nanopartikel (bakterielle Einschlusskörperchen) mit unseren hausgemachten orale Intubation Gerät (Abbildung 1). Wir haben erfolgreich die orale Intubation durchgeführt und erreicht eine niedrige durchschnittliche prozentuale Mortalität (6,8 %) (Tabelle 1). Zebrafisch waren entweder mit 30...

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Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

Orale Intubation Erwachsenen Zebrafisch: ein Modell für die Bewertung der intestinalen Aufnahme von bioaktiven Substanzen

Das Protokoll beschreibt sondenschaft Erwachsenen Zebrafisch mit einem biologischen; dann zerlegen und zytometrie, konfokale Mikroskopie und qPCR Darm vorbereiten. Diese Methode ermöglicht die Verwaltung von bioaktiven Substanzen, intestinale Aufnahme und der lokalen immun Reiz hervorgerufen zu überwachen. Es ist relevant für die Prüfung der intestinalen Dynamik von oralen Prophylaxe.

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Schleimhautimpfung zu beantworten, wie z. B. wie Darmschleimhaut biologische Verbindungen aufnehmen und wie solche biologischen Daseinstatoren das Immunsystem an der lokalen Stelle nach der Intubation modulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es einfach einzurichten, schnell, und zeigt niedrige Sterblichkeitsraten. Diese Methode kann Einblicke in die Schleimhautimpfung geben.Es kann auch auf andere Verbindungen angewendet werden, wie Chemikalien, Giftstoffe, oder Krankheitserreger. Visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, wie in der oralen Intubation und Darmsektion Schritte, müssen Sie vorsichtig sein, weil in der Intubation könnten Sie den Zebrafisch verletzen und den Tod verursachen. Bei der Zerlegung ist das Ende des Darms sehr fein und zerbrechlich.Legen Sie etwa einen Zentimeter feinen Silikonschlauch auf eine 31-Spur Luer-Lock-Nadel. Schneiden Sie eine sterile 10-Mikroliter-Filterpipettenspitze, nehmen Sie das feinere Ende und legen Sie es über das Silikonrohr als Mantel. Zunächst befestigen Sie das Nadelgerät an einer 100-Mikroliter-Luer-Lock-Spritze.Erstens, bewegen Sie die Fische in die Versuchstanks eine Nacht vor dem Experiment. Wirbel nisch die vorbereitete Nanopartikellösung gut, und ziehen Sie das gewünschte Volumen der Suspension. Nach der sicheren Beästhesierung der Fische, verwenden Sie ein Netz, um den Fisch schnell auf eine nasse Kunststoffschale zu übertragen.Richten Sie das Tier horizontal aus, um der Nadel zu begegnen. Unterstützen Sie den Fisch vorsichtig mit einer Hand und öffnen Sie den Mund mit der geschützten Nadel. Dann legen Sie die Nadel vorsichtig die Speiseröhre hinunter, bis etwa einen Zentimeter von der Mundöffnung entfernt.Es ist schwer zu sehen, wie weit die Nadel gehen sollte, und das ist eine Frage der Praxis. Sie werden die Nadel fühlen, wie sie einen Stopp findet, und dann durch die Manipulation der Nadel, finden Sie den richtigen Winkel, um das Gerät ein wenig mehr einsetzen. Injizieren Sie die Nanopartikelsuspension langsam in den Fisch, sodass die Suspension nicht nach außen durch die Kiemen oder den Mund fließt.Danach entfernen Sie vorsichtig die Nadel und legen Sie den Fisch in einen Erholungsbehälter. Während sich der Fisch erholt, überwachen Sie den Fisch auf Anomalien. Sobald sich der Fisch erholt hat, kehren Sie ihn in einen der Versuchstanks zurück.Nach der Einschläferne der Fische gemäß dem Textprotokoll, legen Sie den Fisch auf ein Stück Filterpapier. Mit scharfen Sezierscheren einen halbkreisförmigen Schnitt vom Anus zum Operculum machen und den Schnitt mit feiner Pinzette öffnen. Schneiden Sie dann beide Enden des Darms, nehmen Sie alle inneren Organe heraus und legen Sie sie auf das Filterpapier.Als nächstes trennen Sie den Darm von den inneren Organen, und dehnen Sie ihn aus, wobei Sie darauf achten, den gesamten Darm zu erhalten. Schließlich verwenden Sie eine Pinzette, um den Darm auf dem Filterpapier zu rollen, um das Klebegewebe zu lösen. Mit diesem Protokoll wurden Zebrafische gemischten Geschlechts erfolgreich mit verschiedenen rekombinanten Protein-Nanopartikeln intubiert.Mit dem hausgemachten oralen Intubationsgerät wurde ein niedriger durchschnittlicher Prozentsatz der Sterblichkeit erreicht. Um die Abgabe der fluoreszierenden Nanopartikel-Einschlusskörper mit rekombinantem TNF-Alpha zu bewerten, wurde eine Zytometrie-Analyse durchgeführt. Die Gesamtmenge der fluoreszierenden Zellen war in der nanopartikelintubierten Gruppe sowohl fünf als auch 24 Stunden nach der Intubation signifikant höher als in der Kontrollgruppe.Die Intubationsausrüstung ist kostengünstig, präzise und wiederverwendbar. Das gesamte Intubationsverfahren kann sehr schnell von einem Operator durchgeführt werden, und, was wichtig ist, ist die Methode zwischen verschiedenen Operatoren konsistent. Die Kombination unserer Intubationsmethode mit der nachgelagerten Analyse könnte ideal für die Entwicklung oraler Impfstoffe sein.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Die Anwendung eines Maus Ligierte Peyer-Patch-Darmschlinge Assay zu bakterielle Aufnahme von M-Zellen auswerten

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Komplette Thymektomie bei erwachsenen Ratten mit Nicht-invasive Intubation

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis als Modellorganismus für die Beurteilung der Interaktion von anaeroben Bakterien mit Wirtszellen

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Quantifizierung von Vibrio Cholerae Kolonisation und Durchfall bei Erwachsenen Zebrafisch-Modell

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modellierung von Tuberkulose Mycobacterium Marinum infizierten Erwachsenen Zebrafisch

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

Impfung von Erwachsenen Zebrafisch für die präklinische Screening von DNA-basierte Impfstoffe

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Quantitative Polymerase Kettenreaktion-basierte Analysen der murinen intestinale Mikrobiota nach Behandlung mit oralen Antibiotika

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Ein Galleria Mellonella mündliche Administrationsmodell zu Study Commensal-Induced angeborene Immunantwort

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

Funktionelle Beurteilung der Intestinalpermeabilität und der neutrophilen transepithelialen Migration bei Mäusen mit einem standardisierten Darmschleifenmodell

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Experimentelle Virusinfektion bei adulten Stechmücken durch orale Fütterung und Mikroinjektion

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...