Name: oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds
Uploaded: 2018-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממשרד ספרדית של המדע, הנציבות האירופית וקרנות AGAUR ל ע נ (AGL2015-65129-R MINECO/פדר, AGAUR 2014SGR-345). RT מחזיקה מראש דוקטורט במלגת לימודים AGAUR (ספרד), ג'יי-ג'יי נתמכה על ידי מלגת דוקטורט מטעם המועצה מלגה סין (סין), ע"נ נתמכת על-ידי התוכנית Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). אנו מודים Torrealba ד ר על ייעוץ מומחה בייצור חלבונים, הוותיק ש מ "Microscopia דה Servei", ר קוסטה מ מ "Servei דה Citometria" של ברצלונה דה Autònoma Universitat לסיוע טכני מועיל.

כל ההליכים ניסיוני לערב דג זברה (רזבורה rerio) היו מורשה על ידי ועדת האתיקה של Universitat Autònoma דה ברצלונה (CEEH מספר 1582) מסכים עם העקרונות המנחים הבינלאומי עבור המחקר מעורבים חיות ( EU 2010/63). כל הניסויים עם דג זברה בשידור חי בוצעו ב 26 – 28 º C.
1. מכינים את הציוד לצנרור אוראלי
<ol><li>במקו?...

<ol>
	<li>Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+exposure+of+zebrafish,+Danio+rerio+(Hamilton),+to+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+peregrinum+reveals+the+gastrointestinal+tract+as+the+primary+route+of+infection:+A+potential+model+for+environmental+mycobacterial+infection.">Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection.</a> Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).</li><li>Lovmo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+nanoparticles+and+Mycobacterium+marinum+across+the+intestinal+epithelium+in+zebrafish+and+the+role+of+the+mucosal+immune+system.">Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system.</a> Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Sized+mPEG-PLGA+Nanoparticles+of+Schisantherin+A+with+Sustained+Release+for+Enhanced+Brain+Uptake+and+Anti-Parkinsonian+Activity.">Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).</li><li>Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gavaging+Adult+Zebrafish.">Gavaging Adult Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).</li><li>Kim, S. H., Jang, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+targeting+to+M+cells+for+enhancing+the+efficacy+of+mucosal+vaccines.">Antigen targeting to M cells for enhancing the efficacy of mucosal vaccines.</a> Experimental and Molecular Medicine. 46 (3), 85 (2014).</li><li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adaptive+immunity+by+the+innate+immune+system.">Regulation of adaptive immunity by the innate immune system.</a> Science. 327 (5963), 291-295 (2010).</li><li>Kunisawa, J., Kiyono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+marvel+of+mucosal+T+cells+and+secretory+antibodies+for+the+creation+of+first+lines+of+defense.">A marvel of mucosal T cells and secretory antibodies for the creation of first lines of defense.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1308-1321 (2005).</li><li>Rombout, J. H., Yang, G., Kiron, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+immune+responses+at+mucosal+surfaces+of+teleost+fish.">Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish.</a> Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).</li><li>Salinas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mucosal+Immune+System+of+Teleost+Fish.">The Mucosal Immune System of Teleost Fish.</a> Biology. 4, 525-539 (2015).</li><li>Munang'andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. &. #. 2. 4. 8. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+challenges+limiting+the+design+of+protective+mucosal+vaccines+for+finfish.">An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish.</a> Frontiers in Immunology. 6, 542 (2015).</li><li>Lickwar, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+dissection+of+conserved+transcriptional+regulation+in+intestinal+epithelial+cells.">Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells.</a> PLoS Biology. 15 (8), 2002054 (2017).</li><li>Brand, M., Granato, M., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+zebrafish.">Keeping and raising zebrafish.</a> Zebrafish. 261, 7-37 (2002).</li><li>Ress&#233;guier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+efficient+uptake+of+surfactant-free+poly(lactic+acid)+nanovaccine+vehicles+by+mucosal+dendritic+cells+in+adult+zebrafish+after+bath+immersion.">Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion.</a> Frontiers in Immunology. 8, 190 (2017).</li><li>Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Performance+RNA+Isolation+Using+the+Maxwell+16+Total+RNA+Purification+Kit.">High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit.</a> Promega Notes. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermo+Fisher+Scientific+NanoDrop+1000+spectrophotometer+V3.8+user's+manual.">Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user's manual.</a> Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).</li><li>Lightfoot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+comparison+of+total+RNA+using+the+Agilent+2100+bioanalyzer,+ribogreen+analysis,+and+UV+spectrometry.">Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry.</a> Agilent Application Note. , (2002).</li><li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+digital+MIQE+guidelines:+Minimum+information+for+publication+of+quantitative+digital+PCR+experiments.">The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Renshaw, S., Loynes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), (2011).</li></ol>

פרוטוקול זה הוא שיפור של הטכניקה שתואר לעיל לצנרור אוראלי על-ידי. Collymore et al. 4 פרוטוקול שלנו מתאר בפירוט את השיטה צנרור אוראלי, כולל הכנת המעי עבור ניתוחים במורד הזרם. השיטה שלנו משפר את מהירות מניפולציה דגים המאפשר אחד לבצע את כל הפרוטוקול במהירות, ללא הרבה שינויים בין מפע?...

מטרת מאמר זה היא לתאר עומק שיטה פשוטה לצנרור שבעל-פה של דג זברה, יחד עם שימושי משויך הליכים במורד הזרם. אוראלי צנרור באמצעות דג זברה הפך מודל מעשי במחקר של מחלות זיהומיות dynamics, חיסון אוראלי/immunostimulant, ספיגת התרופה/nanoparticle ואת היעילות וחסינות מעיים הרירית. לדוגמה, דג זברה צנרור אוראלי שימש במחקר של זיהום של התחממות עולמית , Mycobacterium peregrinum -1. . Lovmo et al. גם משתמשים בהצלחה מודל זה למסור חלקיקים, התחממות עולמית מ . מערכת העיכול של דג זברה בוגרת2. בנוסף, צ'ן. et al. משמש צנרור אוראלי דג זברה להראות כי סמים כמוס על ידי חלקיקים, כאשר מנוהל באמצעות מערכת העיכול, הוסעו על פני מחסום דם המוח3. מחברים אלה לבצע צנרור המבוסס על שיטת gauvage מתוארת על ידי. Collymore et al. 4 עם מספר שינויים. עם זאת, הם לא סיפקו פרוטוקול מאוד מפורט המתאר את ההליך צנרור אוראלי. כאן, אנו מציגים שיטה לצנרור שבעל-פה של דג זברה בוגרת בונים על. Collymore et al. 4 בהמשך נשלב את הכנת המעי לבדיקה במורד הזרם הרלוונטי על ידי cytometry, מיקרוסקופיה קונפוקלית qPCR.
המעי ורירית במיוחד שלה הוא את השורה הראשונה להגנה מפני זיהום האתר העיקרי של ספיגת התזונתי5. כאשר תאים אפיתל של אנטיגן תאים בתוך מחסומים הרירית תופסים אותות סכנה, תגובה חיסונית מולדת מיידי מופעלת. הבא, התגובה החיסונית מסתגלת ספציפי מאוד היא הוקמה על ידי T ו- B לימפוציטים6,7. פיתוח חיסונים שבעל פה הוא אזור המיקוד הנוכחי ב- vaccinology. חיסונים כאלה יהיה כלי יעיל כדי להגן על האורגניזם באתרים חשופים בשל התגובה ספציפי של תאים חיסוניים ב8,רירית הקשורים רקמות הלימפה (מאלט)9. עופות ומידגה, חיסונים הרירית יש יתרונות ברורים לעומת זריקות חיסונים. הם שימושיים לקבלת חיסון המוני, פחות עתירי עבודה, הן פחות מלחיץ לדג, יכול להיות מנוהל על מנת דגים צעירים. ובכל זאת, החיסון הרירית מועמדים חייבים להגיע על קטע בטן שני מבלי להיות שפגע בסימני בסביבת אוראלי. הם גם חייבים לחצות הרירית המחסומים על מנת לקבל גישה אנטיגן הצגת תאים (נגמ שים) כדי לגרום תגובות מקומיות ו/או מערכתית10. לכן, בדיקה של תפיסה הרירית מושגת על ידי אנטיגנים אוראלי המועמד ומערכות אספקת שלהם, כמו גם התגובה החיסונית עורר, חיוני בפיתוח של חיסונים שבעל-פה.
בהקשר הביו-רפואי, פיתוח מודל לבחון השפעות ביולוגיות של תרכובות לאחר צנרור אוראלי הוא עניין הולך וגדל. רבות מהתכונות אנטומית, פיזיולוגית של המעי נשמרים בין שושלות bilaterian, עם יונקים ודגים כחוש11. מודל זה צנרור אוראלי מחובר ניתוח במורד הזרם יכולה להיות כלי כדי לספק תובנות הביולוגיה האנושית, כמו גם בסיס ביולוגי או אחרים תרכובות ויוו.
פרוטוקול צנרור אוראלי יכול להתבצע על ידי מפעיל אחד, למשל, בהצלחה וניהול עד 50 µL של חלבון nanoparticle ההשעיה לדוג במשקל 1 g, עם שיעור הישרדות גבוהה. ההליך הוא פשוט להגדיר ומהירה; 30 דגים יכול לצנר ב 1 h. הפרוטוקול עבור הכנת המעי היא המפתח לספק דגימות תאים ורקמות איכות לצורך ניתוח מאוחר יותר. דוגמאות של הזרם תוצאות ניתנות אשר מראים את התועלת של הפרוטוקול בקבלת נתונים הקשורים ספיגת מעיים לבודד RNA איכות עבור qPCR. הפרוטוקול תהיה תועלת רבה לאלו הזקוקים מודל מתאים כדי לבדוק את הדינמיקה של אמצעי מניעה אוראלי או תרכובות אחרות במעי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1271px;" width="1270">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Silicon tube</td>
			<td style="width:227px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:295px;">508-001</td>
			<td style="width:460px;">0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Luer lock needle</td>
			<td style="width:227px;">Hamilton</td>
			<td style="width:295px;">7750-22</td>
			<td style="width:460px;">31 G, Kel-F Hub</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Luer lock syringe</td>
			<td style="width:227px;">Hamilton</td>
			<td style="width:295px;">81020/01</td>
			<td style="width:460px;">100 &#956;L, Kel-F Hub</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Filtered pipette tip</td>
			<td style="width:227px;">Nerbe Plus</td>
			<td style="width:295px;">07-613-8300</td>
			<td style="width:460px;">10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">MS-222</td>
			<td style="width:227px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">E10521</td>
			<td style="width:460px;">powder</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">10x PBS</td>
			<td style="width:227px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">P5493</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Filter paper&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Filter-Lab</td>
			<td style="width:295px;">RM14034252</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Collagenase</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">17104019</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">31966</td>
			<td style="width:460px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">15240</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:227px;">Falcon</td>
			<td style="width:295px;">352360</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">CellTrics filters&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sysmex Partec</td>
			<td style="width:295px;">04-004-2326 (Wolflabs)</td>
			<td style="width:460px;">30 &#181;m mesh size filters with 2 mL reservoir</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:227px;">SAKURA</td>
			<td style="width:295px;">4583</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plastic molds for cryosections</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4557</td>
			<td>Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Slide</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:295px;">10149870</td>
			<td style="width:460px;">SuperFrost Plus slide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:227px;">Labbox&#160;</td>
			<td style="width:295px;">COVN-024-200</td>
			<td style="width:460px;">24&#180;24 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">158127</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Atto-488 NHS ester</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">41698</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">S5761</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">DMSO</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">D8418</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">AS1340</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:289px;">1-Thioglycerol/Homogenization solution</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td>
			<td style="width:460px;">adding 20 &#956;l 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">vertical laboratory rotator&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Suministros Grupo Esper</td>
			<td style="width:295px;">10000-01062</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cryostat</td>
			<td style="width:227px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:295px;">CM3050S</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:227px;">KINEMATICA</td>
			<td style="width:295px;">Polytron PT1600E</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Flow cytometer&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:295px;">FACS Canto</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">5 mL round bottom tube</td>
			<td style="width:227px;">Falcon</td>
			<td style="width:295px;">352058</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:227px;">Leica</td>
			<td style="width:295px;">SP5</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Fume Hood</td>
			<td style="width:227px;">Kottermann</td>
			<td style="width:295px;">2-447 BST</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Nanodrop 1000</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:295px;">ND-1000</td>
			<td style="width:460px;">Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td style="width:227px;">Agilent</td>
			<td style="width:295px;">G2939A</td>
			<td>RNA bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Maxwell Instrument</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">AS4500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">iScript cDNA synthesis kit&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:295px;">1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:289px;">CFX384 Real-Time PCR&#160;Detection System</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:295px;">1855485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:289px;">iTaq universal SYBR Green Supermix kit</td>
			<td style="width:227px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:295px;">172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Water&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Cryogenic vial&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:295px;">375418</td>
			<td>CryoTube vial</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">F6057</td>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds

רוב פתוגנים פולשים אורגניזמים דרך רירית שלהם. זה נכון במיוחד בדגים כפי שהם נחשפים באופן רציף סביבה מים עתירי חיידקים. פיתוח שיטות יעילות עבור משלוח אוראלי של immunostimulants או חיסונים, אשר מפעיל את מערכת החיסון כנגד מחלות זיהומיות, רצוי מאוד. בהמצאת כלי מניעתי, ניסיוניות טוב יש צורך לבחון את הביצועים שלהם. כאן, אנו מראים שיטה לצנרור שבעל-פה של דג זברה בוגרת וערכה של ההליכים כדי לנתח ולהתכונן המעי cytometry, מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח תגובת שרשרת (qPCR) פולימראז כמותית. עם פרוטוקול זה, אנחנו יכולים בדיוק לנהל אמצעי אחסון עד 50 µL לדוג במשקל כ 1 g בפשטות ובמהירות, מבלי לפגוע החיות. שיטה זו מאפשרת לנו לבחון תפיסה ישירה ויוו של תרכובות fluorescently עם תוויות ברורות על ידי רירית המעי לבין יכולת immunomodulatory של תכשירים כאלה באתר המקומי לאחר צנרור. על ידי שילוב שיטות במורד הזרם כמו cytometry זרימה, היסטולוגיה, qPCR ומיקרוסקופיה קונפוקלית של רקמת המעי, נוכל להבין איך immunostimulants או חיסונים הם מסוגלים לחצות את המחסומים הרירית מעיים, עוברים פרופריה. מוסקולריס, ו להגיע לשריר, הפעלת השפעה על מערכת החיסון הרירית מעיים. המודל יכול לשמש כדי לבחון אמצעי מניעה אוראלי המועמד ו מערכות אספקה או אפקט מקומיים של כל המתחם ביואקטיביות אוראלית.

דג זברה (ממוצע משקל: 1.03 ± 0.16 g) מין מעורבים היו בהצלחה לצינורות עם חלקיקים שונים חלבון רקומביננטי (גופים הכללה חיידקי) באמצעות המכשיר תוצרת בית צנרור אוראלי שלנו (איור 1). יש לבצע צנרור אוראלי ואנו מושגת התמותה נמוכה האחוז הממוצע (6.8%) בהצלחה (טבלה 1). ד...

Watch this Scientific Journal Video about Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds at JoVE.com

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

צנרור שבעל-פה של דג זברה למבוגרים: מודל להערכת ספיגת מעיים של תרכובות ביו

הפרוטוקול מתאר נלוקסון דג זברה למבוגרים עם ביולוגי; לאחר מכן לנתח, הכנת המעי עבור cytometry, מיקרוסקופיה קונפוקלית ו- qPCR. שיטה זו מאפשרת ניהול של תרכובות ביו לעקוב אחר ספיגת מעיים ואת הגירוי המערכת החיסונית המקומית עורר. זה רלוונטי לבדיקה את הדינמיקה מעיים של אמצעי מניעה שבעל-פה.

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חיסון רירית, כגון כיצד רירית המעי ספיגת תרכובות ביולוגיות וכיצד ביולוגים כאלה לווסת את המערכת החיסונית באתר המקומי לאחר צנרור. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה פשוט להגדיר, מהיר, ומראה שיעורי תמותה נמוכים. שיטה זו יכולה לספק תובנה על חיסון ריר.זה יכול להיות מיושם גם על תרכובות אחרות, כגון כימיקלים, רעילים, או פתוגנים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו צנרור הפה וצעדי ניתוח מעיים, אתה צריך להיות זהיר כי באינקובציה אתה יכול לפגוע זברה ולגרום למוות. בניתוח, סוף המעי הוא עדין מאוד שביר.מניחים כ סנטימטר אחד של צינורות סיליקון עדין על מחט 31-מד Luer-lock. חותכים קצה פיפטה סטרילי 10 מיקרוליטר מסנן, לקחת את הקצה עדין, ולמקום אותו על צינור הסיליקון כמו נדן. כדי להתחיל, חבר את מנגנון המחט למזרק 100 מיקרוליטר לואר-לוק.ראשית, להעביר את הדגים למיכלי הניסוי לילה אחד לפני הניסוי. Vortex פתרון חלקיקים מוכן היטב, ולצייר את הנפח הרצוי של ההשעיה. לאחר הרדמה בטוחה של הדגים, השתמש ברשת כדי להעביר במהירות את הדגים למגש פלסטיק רטוב.לכוון את החיה אופקית כדי להתמודד עם המחט. בזהירות לתמוך בדגים ביד אחת, ולפתוח את הפה עם המחט מוגנת. לאחר מכן, הכנס בעדינות את המחט במורד הוושט לס"מ אחד מפתיחת הפה.קשה לראות כמה רחוק המחט צריכה ללכת, וזה עניין של תרגול. אתה תרגיש את המחט כפי שהוא מוצא עצירה, ולאחר מכן על ידי מניפולציה המחט, תמצא את הזווית הנכונה כדי להכניס את המכשיר קצת יותר. לאט להזריק את ההשעיה חלקיקים לתוך הדג, להבטיח את ההשעיה לא לזרום החוצה דרך הזימים או הפה.לאחר מכן, בעדינות להסיר את המחט, ולמקום את הדגים לתוך מיכל התאוששות. בעוד הדג מתאושש, לפקח על הדגים לכל חריגות. ברגע שהדגים התאוששו, תחזירו אותו לאחד ממיכלי הניסוי.לאחר המתת חום הדגים על פי פרוטוקול הטקסט, מניחים את הדגים על פיסת נייר סינון. באמצעות מספריים ניתוח חד, לעשות חתך מעגלי למחצה מן פי הטבעת אל אופרקולום, ולפתוח את החתך עם פינצטה עדינה. לאחר מכן, לחתוך את שני הקצוות של המעי, להוציא את כל האיברים הפנימיים, ולה מניח אותם על נייר המסנן.לאחר מכן, להפריד את המעי מן האיברים הפנימיים, למתוח אותו, דואג להשיג את כל המעי. לבסוף, להשתמש פינצטה לגלגל את המעי על נייר המסנן כדי לנתק את רקמת דבק. באמצעות פרוטוקול זה, זברה של סקס מעורב היו צנרר בהצלחה עם חלקיקי חלבון רקומביננטי שונים.באמצעות מכשיר צנרור אוראלי תוצרת בית, אחוז ממוצע נמוך של תמותה הושג. כדי להעריך את המסירה של גופי הכללת חלקיקים פלואורסצנטיים שנעשו עם אלפא TNF רקומביננטי, בוצע ניתוח ציטומטריה. הכמות הכוללת של תאים פלואורסצנטיים הייתה גבוהה משמעותית בקבוצה עם צנר-חלקיקים מאשר בקבוצת הביקורת הן חמש והן 24 שעות לאחר צנרור.ציוד ההטמעה זול, מדויק וניתן לשימוש חוזר. כל הליך צנרור יכול להיעשות מהר מאוד על ידי אופרטור אחד, וחשוב, השיטה עקבית בין אופרטורים שונים. השילוב של שיטת הינטובציה שלנו עם ניתוח במורד הזרם יכול להיות אידיאלי לפיתוח חיסון אוראלי.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Thymectomy מלא בחולדות מבוגרות עם לא פולשני endotracheal אינטובציה

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

gingivalis Porphyromonas כאורגניזם מודל להערכת אינטראקציה של חיידקים אנאירוביים עם תאי מארח

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

לכימות ויבריו cholerae קולוניזציה ושלשולים במודל דג זברה למבוגרים

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

מידול שחפת ב דג נגוע זברה בוגרת התחממות עולמית

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

חיסונים של דג זברה בוגרת להקרנה פרה של חיסונים מבוסס DNA

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

פולימראז כמותי המבוסס על תגובת שרשרת ניתוחים של מאתר Microbiota מעיים לאחר טיפול אנטיביוטי דרך הפה

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

גלרייה mellonella מודל הניהול אוראלי את תגובות מערכת החיסון מולדים Study Commensal-Induced

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

הערכה תפקודית של חלחיליות מעיים ונדידה טרנס-אפיתלית נויטרופילית בעכברים באמצעות מודל לולאת מעיים מתוקננת

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

זיהום ויראלי ניסיוני ביתושים בוגרים על ידי האכלה אוראלית ומיקרו-הזרקה

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...