Name: oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds
Uploaded: 2018-09-27T15:00:00
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この作品は、欧州委員会と AGAUR 資金 NR (AGL2015-65129-R MINECO/フェダー、2014SGR-345 AGAUR) スペイン語科学省からの補助金によって支えられました。RT は、AGAUR (スペイン)、JJ から博士奨学金に支えられ中国公費 (中国) から博士課程フェローシップと NR は Ramón y カハール プログラム (RYC-2010-06210、2010 年、MINECO) によってサポートされているを保持します。タンパク質の生産、「Servei ・ デ ・ ミクロスコピア」から (名) バルバで専門家の助言ありがとう博士トレアルバと博士 m ・ コスタ、Autònoma · デ · バルセロナの役に立つのテクニカル サポートの「Servei ・ デ ・ Citometria」から。

ゼブラフィッシュ (動脈分布) を含むすべての実験手順は、Autònoma · デ · バルセロナ (CEEH 番号 1582) 研究を含む動物 (国際指導原則に一致しての倫理委員会によって承認されました。EU 2010/63)。26-28 ° C で生きたゼブラフィッシュで実験を行った
1. 経口挿管装置の準備
<ol><li>針の先端をカバーする 31 G ルアー ロック針に高級シリコン チューブを約 1 cm を配置しま?...

<ol>
	<li>Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+exposure+of+zebrafish,+Danio+rerio+(Hamilton),+to+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+peregrinum+reveals+the+gastrointestinal+tract+as+the+primary+route+of+infection:+A+potential+model+for+environmental+mycobacterial+infection.">Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection.</a> Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).</li><li>Lovmo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+nanoparticles+and+Mycobacterium+marinum+across+the+intestinal+epithelium+in+zebrafish+and+the+role+of+the+mucosal+immune+system.">Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system.</a> Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Sized+mPEG-PLGA+Nanoparticles+of+Schisantherin+A+with+Sustained+Release+for+Enhanced+Brain+Uptake+and+Anti-Parkinsonian+Activity.">Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).</li><li>Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gavaging+Adult+Zebrafish.">Gavaging Adult Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).</li><li>Kim, S. H., Jang, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+targeting+to+M+cells+for+enhancing+the+efficacy+of+mucosal+vaccines.">Antigen targeting to M cells for enhancing the efficacy of mucosal vaccines.</a> Experimental and Molecular Medicine. 46 (3), 85 (2014).</li><li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adaptive+immunity+by+the+innate+immune+system.">Regulation of adaptive immunity by the innate immune system.</a> Science. 327 (5963), 291-295 (2010).</li><li>Kunisawa, J., Kiyono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+marvel+of+mucosal+T+cells+and+secretory+antibodies+for+the+creation+of+first+lines+of+defense.">A marvel of mucosal T cells and secretory antibodies for the creation of first lines of defense.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1308-1321 (2005).</li><li>Rombout, J. H., Yang, G., Kiron, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+immune+responses+at+mucosal+surfaces+of+teleost+fish.">Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish.</a> Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).</li><li>Salinas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mucosal+Immune+System+of+Teleost+Fish.">The Mucosal Immune System of Teleost Fish.</a> Biology. 4, 525-539 (2015).</li><li>Munang'andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. &. #. 2. 4. 8. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+challenges+limiting+the+design+of+protective+mucosal+vaccines+for+finfish.">An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish.</a> Frontiers in Immunology. 6, 542 (2015).</li><li>Lickwar, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+dissection+of+conserved+transcriptional+regulation+in+intestinal+epithelial+cells.">Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells.</a> PLoS Biology. 15 (8), 2002054 (2017).</li><li>Brand, M., Granato, M., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+zebrafish.">Keeping and raising zebrafish.</a> Zebrafish. 261, 7-37 (2002).</li><li>Ress&#233;guier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+efficient+uptake+of+surfactant-free+poly(lactic+acid)+nanovaccine+vehicles+by+mucosal+dendritic+cells+in+adult+zebrafish+after+bath+immersion.">Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion.</a> Frontiers in Immunology. 8, 190 (2017).</li><li>Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Performance+RNA+Isolation+Using+the+Maxwell+16+Total+RNA+Purification+Kit.">High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit.</a> Promega Notes. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermo+Fisher+Scientific+NanoDrop+1000+spectrophotometer+V3.8+user's+manual.">Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user's manual.</a> Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).</li><li>Lightfoot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+comparison+of+total+RNA+using+the+Agilent+2100+bioanalyzer,+ribogreen+analysis,+and+UV+spectrometry.">Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry.</a> Agilent Application Note. , (2002).</li><li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+digital+MIQE+guidelines:+Minimum+information+for+publication+of+quantitative+digital+PCR+experiments.">The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Renshaw, S., Loynes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), (2011).</li></ol>

このプロトコルは前述コリモアらによる経口気管挿管法の改善4私達のプロトコルは経口挿管法の詳細に説明し、下流解析のため腸の準備が含まれています。本手法は、演算子間の変動があまりなく、急速に全体のプロトコルを実行する人を許可する魚操作速度を向上します。以前のものと弊社のプロトコルの主な違いは、幸福のための動物の観察によってだけでなく...

この記事の目標は、深さで関連付けられている下流の有用な手順と共に、ゼブラフィッシュの経口挿管に簡単なメソッドを記述することです。ゼブラフィッシュを用いた経口気管挿管における感染症の動態、経口ワクチン/免疫賦活剤、薬/ナノ粒子の吸収・効果、腸管粘膜免疫の実用的なモデルとなっています。たとえば、ゼブラフィッシュ経口挿管は、 marinum 結核菌や結核菌 peregrinum感染1の研究で使用されています。Lovmoら正常に大人ゼブラフィッシュ2の消化管をナノ粒子やM. marinum提供するのにこのモデルを使用します。さらに、陳らは、ナノ粒子、薬がカプセル化をゼブラフィッシュ経口挿管を使用とき投与による消化管血頭脳障壁3間で運ばれました。これらの著者実行コリモアらによって記述されている gauvage メソッドに基づいて、挿管4いくつかの変更。しかし、彼らは、経口挿管の手順を記述する非常に詳細なプロトコルを提供しませんでした。ここでは、建物コリモアら大人のゼブラフィッシュの経口挿管法を提案します。4フローサイトメトリー、共焦点顕微鏡、qPCR による関連する下流解析のため腸の準備を更に含んで。
腸、特にその粘膜は感染に対する防御の最初の行と養分吸収5主のサイトです。上皮細胞と抗原提示細胞粘膜障壁内では、危険信号を感知、即時の自然免疫応答がトリガーされます。次に、非常に特定の適応免疫応答は、T および B リンパ球6,7で確立されます。経口ワクチンの開発は、ワクチン学に現在フォーカス エリアです。このようなワクチンは粘膜関連リンパ組織 (モルト)8,9の免疫細胞の特定の応答のための露出サイトで有機体を保護するために効果的なツールになります。養殖業、粘膜ワクチン注射ワクチンと比較して明らかな利点があります。集団予防接種は、比較的手間のかからないための実用的、魚、ストレスの少ない、若い魚に投与することができます。それにもかかわらず、粘膜ワクチン候補口腔内環境に変性されることがなく腸の 2 番目のセグメントに到達する必要があります。彼らはまた抗原提示細胞 (APCs) ローカルおよび全身の応答10を誘発するへのアクセスを得るために粘膜の障壁を越える必要があります。したがって、候補の経口抗原およびその配信システムにより粘膜吸収のテスト、誘発、免疫反応だけでなく、不可欠である経口ワクチンの開発に
生体においては、経口挿管の関心の高まりの後、化合物の生物学的効果をテストするモデルを開発します。腸の解剖学的および生理学的機能の多くは哺乳類、硬骨魚類11、左右相称性系統間保存されます。下流の分析に接続されているこの経口挿管モデルは、生物学的製剤の試験場と同様、人間の生物学への洞察力を提供するためのツールをすることができます。 または他の化合物の生体内で。
経口気管挿管プロトコルは、1 つの演算子、例えば、魚の重さの 1 g は、生存率の高いタンパク質ナノ粒子懸濁液の最大 50 μ L を正常に管理実行できます。手順はセットアップするシンプルで簡単です。30 魚は 1 h で挿管することができます。腸の準備のためのプロトコルは、その後の分析のため品質の細胞・組織のサンプルを提供する鍵です。下流の結果の例の腸管吸収に関連するデータを取得、qPCR の質 RNA を隔離するプロトコルの有用性を示すとおりです。これら腸内口腔予防薬のダイナミクスや他の化合物をテストするための適切なモデルを必要とする偉大な使用のプロトコルになります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1271px;" width="1270">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Silicon tube</td>
			<td style="width:227px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:295px;">508-001</td>
			<td style="width:460px;">0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Luer lock needle</td>
			<td style="width:227px;">Hamilton</td>
			<td style="width:295px;">7750-22</td>
			<td style="width:460px;">31 G, Kel-F Hub</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Luer lock syringe</td>
			<td style="width:227px;">Hamilton</td>
			<td style="width:295px;">81020/01</td>
			<td style="width:460px;">100 &#956;L, Kel-F Hub</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Filtered pipette tip</td>
			<td style="width:227px;">Nerbe Plus</td>
			<td style="width:295px;">07-613-8300</td>
			<td style="width:460px;">10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">MS-222</td>
			<td style="width:227px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">E10521</td>
			<td style="width:460px;">powder</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">10x PBS</td>
			<td style="width:227px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">P5493</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Filter paper&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Filter-Lab</td>
			<td style="width:295px;">RM14034252</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Collagenase</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">17104019</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">31966</td>
			<td style="width:460px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">15240</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:227px;">Falcon</td>
			<td style="width:295px;">352360</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">CellTrics filters&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sysmex Partec</td>
			<td style="width:295px;">04-004-2326 (Wolflabs)</td>
			<td style="width:460px;">30 &#181;m mesh size filters with 2 mL reservoir</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:227px;">SAKURA</td>
			<td style="width:295px;">4583</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plastic molds for cryosections</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4557</td>
			<td>Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Slide</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:295px;">10149870</td>
			<td style="width:460px;">SuperFrost Plus slide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:227px;">Labbox&#160;</td>
			<td style="width:295px;">COVN-024-200</td>
			<td style="width:460px;">24&#180;24 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">158127</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Atto-488 NHS ester</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">41698</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">S5761</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">DMSO</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">D8418</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">AS1340</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:289px;">1-Thioglycerol/Homogenization solution</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td>
			<td style="width:460px;">adding 20 &#956;l 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">vertical laboratory rotator&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Suministros Grupo Esper</td>
			<td style="width:295px;">10000-01062</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cryostat</td>
			<td style="width:227px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:295px;">CM3050S</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:227px;">KINEMATICA</td>
			<td style="width:295px;">Polytron PT1600E</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Flow cytometer&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:295px;">FACS Canto</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">5 mL round bottom tube</td>
			<td style="width:227px;">Falcon</td>
			<td style="width:295px;">352058</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:227px;">Leica</td>
			<td style="width:295px;">SP5</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Fume Hood</td>
			<td style="width:227px;">Kottermann</td>
			<td style="width:295px;">2-447 BST</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Nanodrop 1000</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:295px;">ND-1000</td>
			<td style="width:460px;">Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td style="width:227px;">Agilent</td>
			<td style="width:295px;">G2939A</td>
			<td>RNA bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Maxwell Instrument</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">AS4500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">iScript cDNA synthesis kit&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:295px;">1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:289px;">CFX384 Real-Time PCR&#160;Detection System</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:295px;">1855485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:289px;">iTaq universal SYBR Green Supermix kit</td>
			<td style="width:227px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:295px;">172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Water&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Cryogenic vial&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:295px;">375418</td>
			<td>CryoTube vial</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">F6057</td>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds

ほとんどの病原体は侵入、粘膜を通して生物です。これは、微生物が豊富な水環境にさらされ続ける魚で特に。ワクチンは、感染症に対する免疫システムをアクティブ化、または生理の口頭配達の効果的な手法の開発は非常に望ましいです。予防ツールを工夫すること、彼らのパフォーマンスをテストする良い実験モデルが必要です。ここでは、大人のゼブラフィッシュの経口挿管法とを細かく分析し、フローサイトメトリー、共焦点顕微鏡と量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) 分析のための腸の準備の手順のセットを示します。このプロトコルでは、我々 は正確に魚の動物を傷つけることがなく簡単かつ迅速に、約 1 g の重さを 50 μ L までボリュームを管理できます。このメソッドでは、挿管後腸の粘膜とローカル ・ サイトでこのような生物学的製剤の免疫調節能力によって蛍光標識化合物の生体内で直接取り込みを探索することが出来ます。Cytometry 流れ、組織学、qPCR 腸組織の共焦点顕微鏡など下流の方法を組み合わせることによって我々 は生理やワクチンが腸の粘膜の障壁を交差、粘膜を通過することができる方法を理解できると腸管の粘膜免疫系に効果を発揮、筋肉に到達します。モデルは、候補者口腔予防薬と配信システムまたは任意の経口投与の生物活性化合物の局所効果をテストする使用できます。

ゼブラフィッシュ (平均重量: 1.03 ± 0.16 g) 混合性が正常に異なる組換えタンパク質ナノ粒子 (細菌封入体)、自家製経口気管挿管デバイス (図 1) を使用して挿管します。正常に経口挿管を行い平均割合が低い死亡率 (6.8%) を達成(表 1)。ゼブラフィッシュは 30 μ L とナノ粒子懸濁液を 50 μ l 添加いずれか挿管され 24 時間ポスト挿管内死?...

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Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

大人のゼブラフィッシュの経口挿管: 生理活性化合物の腸管吸収の評価モデル

プロトコルは、生物学的製剤; とラリンジアルマスクエアウェイ アダルト ゼブラフィッシュを記述します。解剖し、フローサイトメトリー、共焦点顕微鏡と qPCR の腸を準備します。このメソッドは、腸内の吸収と局所の免疫刺激誘発を監視する生理活性物質を管理できます。口腔予防薬の腸内ダイナミクスのテストに適用されます。

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

この方法は、腸管粘膜が生物学的化合物をどのように取り込むか、そのような生物学的が挿管後の局所部位で免疫系を調節する方法など、粘膜空洞化学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、セットアップが簡単で、迅速で、低い死亡率を示していることです。この方法は、粘膜のワクチン接種に関する洞察を提供することができる。また、化学物質、毒性、病原体などの他の化合物にも適用できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、口腔挿管と腸管解剖のステップのように重要であり、挿管ではゼブラフィッシュを傷つけ、死を引き起こす可能性があるため、注意する必要があります。解剖では、腸の終わりは非常に細かく、壊れやすいです。31ゲージのルアーロック針に約1センチの細かいシリコンチューブを置きます。滅菌10マイクロリットルフィルターピペットチップをカットし、より細かい端を取り、シースとしてシリコーンチューブの上に置きます。まず、針装置を100マイクロリットルのルアーロックシリンジに取り付けます。まず、実験の1晩前に魚を実験タンクに移動します。調製したナノ粒子溶液をうまく渦巻き、懸濁液の所望の容積を引き出す。魚を安全に麻酔した後、網を使って魚を濡れたプラスチックトレイに素早く移します。針に向くように動物を水平方向に向けます。慎重に片手で魚をサポートし、保護された針で口を開きます。その後、口の開口部から約1センチメートルまで食道に針をそっと挿入します。針がどこまで進むべきかを見るのは難しく、これは練習の問題です。あなたは、それが停止を見つけると針を感じ、その後、針を操作することによって、あなたはもう少しデバイスを挿入するための正しい角度を見つけるでしょう。ナノ粒子懸濁液をゆっくりと魚に注入し、懸濁液がエラや口を通って外側に流れないようにします。その後、針をそっと取り出し、魚を回収槽に入れます。魚が回復している間、異常がない場合は魚を監視します。魚が回復したら、実験用タンクの1つに戻します。テキストプロトコルに従って魚を安楽死させた後、フィルターペーパーの上に魚を置きます。鋭利な解剖はさみを使用して、アヌスからオーペルキュラムへの半円形切開を行い、細かいピンセットで切開を開きます。次に、腸の両端を切り、すべての内臓を取り出し、濾紙の上に置きます。次に、腸を内臓から分離し、それを伸ばし、すべての腸を得るように注意を払う。最後に、ピンセットを使用して濾紙の腸を転がし、粘着組織を取り外します。このプロトコルを用いて、混合性のゼブラフィッシュは、異なる組換えタンパク質ナノ粒子で正常に挿管された。自家製の口腔挿管装置を用いて、死亡率の平均割合が低かった。組換えTNFαを用いて作製した蛍光ナノ粒子封入体の送達を評価するために、サイトメトリー分析を行った。蛍光細胞の総量は、挿管後5時間および24時間後の対照群よりもナノ粒子挿管群において有意に高かった。挿管装置は安価で精密で再利用可能です。挿管手順全体は、1 つの演算子で非常に迅速に行うことができます。当社の挿管法と下流分析の組み合わせは、経口ワクチン開発に理想的です。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M細胞による細菌の取り込みを評価するパイエル板腸管ループアッセイを連結したマウスのアプリケーション

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

非侵襲的気管挿管と成体ラットにおける完全な胸腺摘出

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

宿主細胞と嫌気性菌の相互作用を評価するためのモデル生物としてポルフィロモナス・ジンジバリス

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

コレラの植民地化と大人のゼブラフィッシュ モデルで下痢を定量化

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

結核抗酸菌 marinum感染成人ゼブラフィッシュをモデル化

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

大人のゼブラフィッシュの DNA 基づかせていたワクチンの前臨床スクリーニングのため予防接種

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

経口抗生物質による治療後マウス腸内細菌叢の量的なポリメラーゼの連鎖反応に基づく分析

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

ハチミツガ口腔管理モデル Study Commensal-Induced 自然免疫応答

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

標準化腸ループモデルを用いたマウスにおける腸透過性と好中球経上皮移動の機能評価

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

経口摂食とマイクロインジェクションによる成体蚊の実験的ウイルス感染

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...