Name: oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds
Uploaded: 2018-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra det spanske departementet for vitenskap, Europakommisjonen og AGAUR midler til NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER og 2014SGR-345 AGAUR). RT har pre stipend fra AGAUR (Spania), JJ ble støttet av en PhD fellowship fra Kina stipend Council (Kina) og NR støttes av programmet Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Vi takker Dr. Torrealba for ekspertråd i protein produksjon, N. Barba fra "Servei de Microscopia" og Dr. M. Costa fra "Servei de Citometria" av Universitat Autònoma de Barcelona for nyttig teknisk assistanse.

Alle eksperimentelle prosedyrer som involverer sebrafisk (Danio rerio) ble godkjent av den etiske komiteen av Universitat Autònoma de Barcelona (CEEH nummer 1582) med det internasjonale styrende prinsippet for forskning som involverer dyr ( EU 2010/63). Alle eksperimenter med live sebrafisk ble utført på 26-28 ° C.
1. forbereder utstyret muntlig intubasjon
<ol><li>Legg ca 1 cm av en fin silikon rør på en 31 G Luer lås nål å dekke pinne-spissen.</li>
	<li>Kuttet en 10 µL st...

<ol>
	<li>Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+exposure+of+zebrafish,+Danio+rerio+(Hamilton),+to+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+peregrinum+reveals+the+gastrointestinal+tract+as+the+primary+route+of+infection:+A+potential+model+for+environmental+mycobacterial+infection.">Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection.</a> Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).</li><li>Lovmo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+nanoparticles+and+Mycobacterium+marinum+across+the+intestinal+epithelium+in+zebrafish+and+the+role+of+the+mucosal+immune+system.">Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system.</a> Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Sized+mPEG-PLGA+Nanoparticles+of+Schisantherin+A+with+Sustained+Release+for+Enhanced+Brain+Uptake+and+Anti-Parkinsonian+Activity.">Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).</li><li>Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gavaging+Adult+Zebrafish.">Gavaging Adult Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).</li><li>Kim, S. H., Jang, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+targeting+to+M+cells+for+enhancing+the+efficacy+of+mucosal+vaccines.">Antigen targeting to M cells for enhancing the efficacy of mucosal vaccines.</a> Experimental and Molecular Medicine. 46 (3), 85 (2014).</li><li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adaptive+immunity+by+the+innate+immune+system.">Regulation of adaptive immunity by the innate immune system.</a> Science. 327 (5963), 291-295 (2010).</li><li>Kunisawa, J., Kiyono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+marvel+of+mucosal+T+cells+and+secretory+antibodies+for+the+creation+of+first+lines+of+defense.">A marvel of mucosal T cells and secretory antibodies for the creation of first lines of defense.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1308-1321 (2005).</li><li>Rombout, J. H., Yang, G., Kiron, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+immune+responses+at+mucosal+surfaces+of+teleost+fish.">Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish.</a> Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).</li><li>Salinas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mucosal+Immune+System+of+Teleost+Fish.">The Mucosal Immune System of Teleost Fish.</a> Biology. 4, 525-539 (2015).</li><li>Munang'andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. &. #. 2. 4. 8. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+challenges+limiting+the+design+of+protective+mucosal+vaccines+for+finfish.">An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish.</a> Frontiers in Immunology. 6, 542 (2015).</li><li>Lickwar, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+dissection+of+conserved+transcriptional+regulation+in+intestinal+epithelial+cells.">Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells.</a> PLoS Biology. 15 (8), 2002054 (2017).</li><li>Brand, M., Granato, M., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+zebrafish.">Keeping and raising zebrafish.</a> Zebrafish. 261, 7-37 (2002).</li><li>Ress&#233;guier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+efficient+uptake+of+surfactant-free+poly(lactic+acid)+nanovaccine+vehicles+by+mucosal+dendritic+cells+in+adult+zebrafish+after+bath+immersion.">Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion.</a> Frontiers in Immunology. 8, 190 (2017).</li><li>Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Performance+RNA+Isolation+Using+the+Maxwell+16+Total+RNA+Purification+Kit.">High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit.</a> Promega Notes. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermo+Fisher+Scientific+NanoDrop+1000+spectrophotometer+V3.8+user's+manual.">Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user's manual.</a> Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).</li><li>Lightfoot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+comparison+of+total+RNA+using+the+Agilent+2100+bioanalyzer,+ribogreen+analysis,+and+UV+spectrometry.">Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry.</a> Agilent Application Note. , (2002).</li><li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+digital+MIQE+guidelines:+Minimum+information+for+publication+of+quantitative+digital+PCR+experiments.">The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Renshaw, S., Loynes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), (2011).</li></ol>

Denne protokollen er en forbedring av den tidligere beskrevet teknikken for muntlig intubasjon ved Collymore et al. 4 vår beskriver i detalj metoden muntlig intubasjon og inkluderer utarbeidelse av tarmen for nedstrøms analyser. Vår metode forbedrer fisk manipulasjon fart slik at en person til å utføre hele protokollen raskt, uten mye variasjon mellom operatørene. Største forskjellen av våre protokollen med forrige er at vi evaluere hvor vellykket et muntlig intubasjon eksperiment...

Målet med denne artikkelen er å beskrive i dybden en grei metode for muntlig intubasjon av sebrafisk, sammen med nyttige tilknyttede nedstrøms prosedyrer. Muntlig intubasjon bruker sebrafisk blitt en praktisk modell i studiet av infeksjonssykdommer dynamics, oral vaksine/immunostimulant, narkotika/hydrogenion opptak og effekt og intestinal slimhinnene immunitet. For eksempel har sebrafisk muntlig intubasjon blitt brukt i studiet av Mycobacterium marinum og Mycobacterium peregrinum infeksjon1. Lovmo et al. også brukt denne modellen til å levere nanopartikler og M. marinum til mage-tarmkanalen voksen sebrafisk2. I tillegg Chen et al. brukt sebrafisk muntlig intubasjon vise at narkotika innkapslet av nanopartikler, når administrert via mage-tarmkanalen, ble fraktet over blod hjernen barriere3. Disse forfatterne utført intubasjon basert på gauvage metoden beskrevet av Collymore et al. 4 med noen modifikasjoner. Men gir de ikke en svært detaljerte protokoll som beskriver muntlig intubasjon prosedyren. Her presenterer vi en metode for muntlig intubasjon av voksen sebrafisk bygger på Collymore et al. 4 vi videre inkluderer utarbeidelse av tarmen for relevante nedstrøms analyse av cytometri, AC confocal mikroskopi og qPCR.
Tarmen og spesielt dens mucosa er den første linjen i forsvaret mot infeksjon og hovedwebområdet av nærings-opptak5. Når de epitelceller og antigen-presentasjon innen mucosal barrierer oppfatter fare signaler, utløses en umiddelbar medfødte immunforsvaret. Neste, svært spesifikke adaptive immunforsvaret er etablert av T- og B-lymfocytter6,7. Utvikling av muntlig vaksiner er en gjeldende fokusområde i vaccinology. Slike vaksiner vil være et effektivt verktøy for å beskytte organismen utsatte områder på grunn av bestemte svaret av immunceller i mucosa-assosiert lymfoid vev (MALT)8,9. I akvakultur har mucosal vaksiner åpenbare fordeler sammenlignet med injiserbare vaksiner. De er praktisk for masse vaksinasjon, mindre arbeidskrevende, er mindre stressende for fisken, og kan administreres til unge fisken. Likevel må mucosal vaksine kandidater nå andre gut segmentet uten å bli denaturert i muntlig miljø. De må også krysse mucosal barrierer for å få tilgang til antigen presentere celler (APCs) å indusere lokale og/eller systemisk svar10. Derfor er testing av slimhinnene opptaket av kandidaten muntlig antigener og deres leveringsmidler, samt immunrespons fremkalt, viktig i utviklingen av muntlig vaksiner.
Utvikle en modell for å teste biologiske effekter av forbindelser etter muntlig intubasjon er økende interesse i biomedisinsk sammenheng. Mange av de anatomiske og fysiologiske funksjonene i tarmen er bevart mellom bilaterian linjene, pattedyr og bony fisker11. Denne muntlig intubasjon modellen koblet til nedstrøms kan være et verktøy for å gi innsikt i menneskets biologi, samt et prøvefelt for biologiske eller andre forbindelser i vivo.
Muntlig intubasjon protokollen kan utføres av en operatør, f.eksvellykket administrere opptil 50 µL av protein hydrogenion suspensjon fiske veiing 1 g, med en høy overlevelse. Fremgangsmåten er enkel å sette opp og rask; 30 fisk kan være intubated i 1 time. Protokollen for tarmen forberedelser er nøkkelen til å gi kvalitet celler og vev eksempler for senere analyse. Eksempler på nedstrømsresultater gis som viser protokollen nytte å skaffe data relatert til intestinal opptak og isolere kvalitet RNA for qPCR. Protokollen ville være for de som trenger en passende modell å teste dynamikken i muntlig profylaktiske ordninger eller andre forbindelser i tarmen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1271px;" width="1270">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Silicon tube</td>
			<td style="width:227px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:295px;">508-001</td>
			<td style="width:460px;">0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Luer lock needle</td>
			<td style="width:227px;">Hamilton</td>
			<td style="width:295px;">7750-22</td>
			<td style="width:460px;">31 G, Kel-F Hub</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Luer lock syringe</td>
			<td style="width:227px;">Hamilton</td>
			<td style="width:295px;">81020/01</td>
			<td style="width:460px;">100 &#956;L, Kel-F Hub</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Filtered pipette tip</td>
			<td style="width:227px;">Nerbe Plus</td>
			<td style="width:295px;">07-613-8300</td>
			<td style="width:460px;">10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">MS-222</td>
			<td style="width:227px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">E10521</td>
			<td style="width:460px;">powder</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">10x PBS</td>
			<td style="width:227px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">P5493</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Filter paper&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Filter-Lab</td>
			<td style="width:295px;">RM14034252</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Collagenase</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">17104019</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">31966</td>
			<td style="width:460px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">15240</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:227px;">Falcon</td>
			<td style="width:295px;">352360</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">CellTrics filters&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sysmex Partec</td>
			<td style="width:295px;">04-004-2326 (Wolflabs)</td>
			<td style="width:460px;">30 &#181;m mesh size filters with 2 mL reservoir</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:227px;">SAKURA</td>
			<td style="width:295px;">4583</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plastic molds for cryosections</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4557</td>
			<td>Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Slide</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:295px;">10149870</td>
			<td style="width:460px;">SuperFrost Plus slide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:227px;">Labbox&#160;</td>
			<td style="width:295px;">COVN-024-200</td>
			<td style="width:460px;">24&#180;24 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">158127</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Atto-488 NHS ester</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">41698</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">S5761</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">DMSO</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">D8418</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">AS1340</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:289px;">1-Thioglycerol/Homogenization solution</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td>
			<td style="width:460px;">adding 20 &#956;l 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">vertical laboratory rotator&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Suministros Grupo Esper</td>
			<td style="width:295px;">10000-01062</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cryostat</td>
			<td style="width:227px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:295px;">CM3050S</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:227px;">KINEMATICA</td>
			<td style="width:295px;">Polytron PT1600E</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Flow cytometer&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:295px;">FACS Canto</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">5 mL round bottom tube</td>
			<td style="width:227px;">Falcon</td>
			<td style="width:295px;">352058</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:227px;">Leica</td>
			<td style="width:295px;">SP5</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Fume Hood</td>
			<td style="width:227px;">Kottermann</td>
			<td style="width:295px;">2-447 BST</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Nanodrop 1000</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:295px;">ND-1000</td>
			<td style="width:460px;">Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td style="width:227px;">Agilent</td>
			<td style="width:295px;">G2939A</td>
			<td>RNA bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Maxwell Instrument</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">AS4500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">iScript cDNA synthesis kit&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:295px;">1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:289px;">CFX384 Real-Time PCR&#160;Detection System</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:295px;">1855485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:289px;">iTaq universal SYBR Green Supermix kit</td>
			<td style="width:227px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:295px;">172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Water&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Cryogenic vial&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:295px;">375418</td>
			<td>CryoTube vial</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">F6057</td>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds

De fleste patogener invadere organismer gjennom deres mucosa. Dette gjelder særlig i fisk som de kontinuerlig utsatt for en mikrobiell-rik vann miljøet. Utvikle effektive metoder for muntlig levering av immunostimulants eller vaksiner, som aktiverer immunforsvaret mot smittsomme sykdommer, er svært ettertraktet. I utarbeide forebyggende verktøy, for god eksperimentelle modeller å teste resultatene. Her viser vi en metode for muntlig intubasjon av voksen sebrafisk og et sett av prosedyrer for å analysere og forberede tarmen cytometri, AC confocal mikroskopi og kvantitative polymerase kjedereaksjon (qPCR) analyse. Med denne protokollen, kan vi nettopp administrere volumer opptil 50 µL fiske veier ca 1 g enkelt og raskt, uten å skade dyr. Denne metoden tillater oss å utforske direkte i vivo opptaket av fluorescently merket forbindelser med tarmen og immunmodulerende kapasitet av slike biologiske på det lokale området etter intubasjon. Ved å kombinere nedstrøms metoder som flowcytometri, histology, qPCR og AC confocal mikroskopi av intestinal vev, kan vi forstå hvordan immunostimulants eller vaksiner er kunne krysse intestinal slimhinnene barrierer, passerer gjennom lamina propria, og nå muskler, øve en effekt på intestinal mucosal immunsystem. Modellen kan brukes til å teste kandidat muntlig profylaktiske ordninger og leveringssystemer eller lokale effekten av en muntlig-administrert bioaktive sammensatte.

Sebrafisk (gjennomsnittlig vekt: 1,03 ± 0,16 g) av blandet sex var lykkes intubated med forskjellige rekombinante proteiner nanopartikler (bakteriell inkludering organer) ved hjelp av vårt hjemmelagde muntlig intubasjon enhet (figur 1). Vi har utført den muntlige intubasjon og oppnådde en lav gjennomsnittlig prosentandel dødelighet (6,8%) (Tabell 1). Sebrafisk var enten intubated med 30 µL eller 50 µL av hydrogenion suspensjoner og dø...

Watch this Scientific Journal Video about Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds at JoVE.com

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

Muntlig intubasjon av voksen sebrafisk: en modell for å vurdere Intestinal opptak av bioaktive forbindelser

Protokollen beskriver intubere voksen sebrafisk med en biologisk; deretter dissekere og forbereder tarmen cytometri, AC confocal mikroskopi og qPCR. Denne metoden tillater administrasjon av bioaktive forbindelser å overvåke intestinal opptak og lokale immunforsvaret stimulans fremkalt. Det er relevant for testing intestinal dynamikken i muntlig profylaktiske ordninger.

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i slimhinnevaccinology feltet, for eksempel hvordan intestinal mucosa opptak biologiske forbindelser og hvordan slike biologiske modulere immunsystemet på lokalt sted etter intubasjon. Den største fordelen med denne teknikken er at det er enkelt å sette opp, raske og viser lave dødelighetsrater. Denne metoden kan gi innsikt i slimhinnevaksiner.Det kan også brukes på andre forbindelser, for eksempel kjemikalier, giftige eller patogener. Visuell demonstrasjon av denne metoden er kritisk som i oral intubasjon og tarm disseksjon trinn, må du være forsiktig fordi i intubasjon kan du skade sebrafisk og forårsake død. Ved disseksjon er tarmens ende veldig fin og skjør.Plasser omtrent en centimeter fin silikonrør på en 31-gauge Luer-lock nål. Klipp en steril 10-mikroliter filterpipettespiss, ta den finere enden og plasser den over silikonrøret som en hylse. Til å begynne med fester du nåleapparatet til en 100 mikroliter Luer-låsesprøyte.Først flytter du fisken til de eksperimentelle tankene en natt før eksperimentet. Vortex den tilberedte nanopartikkelløsningen godt, og trekk opp ønsket volum av suspensjonen. Etter å ha bedøvet fisken på en trygg måte, bruk et nett til raskt å overføre fisken til et vått plastbrett.Orienter dyret horisontalt for å møte nålen. Støtt fisken forsiktig med den ene hånden, og åpne munnen med den beskyttede nålen. Deretter setter du forsiktig nålen ned spiserøret til omtrent en centimeter fra munnåpningen.Det er vanskelig å se hvor langt nålen skal gå, og dette er et spørsmål om praksis. Du vil føle nålen som den finner et stopp, og deretter ved å manipulere nålen, finner du riktig vinkel for å sette inn enheten litt mer. Injiser nanopartikkelfjæringen langsomt inn i fisken, slik at suspensjonen ikke strømmer utover gjennom gjellene eller munnen.Etter dette fjerner du forsiktig nålen, og legg fisken i en gjenopprettingstank. Mens fisken gjenoppretter, overvåke fisken for eventuelle abnormiteter. Når fisken har kommet seg, returnerer du den til en av de eksperimentelle tankene.Etter euthanizing fisken i henhold til tekstprotokollen, plasser fisken på et stykke filterpapir. Ved hjelp av skarp disseksjon saks, lage et semi-sirkulært snitt fra anus til operculum, og åpne snittet med fine pinsett. Deretter kutter du begge ender av tarmen, tar ut alle de indre organene og legger dem på filterpapiret.Deretter skiller tarmen fra de indre organene, og strekker den ut, og tar vare på å få hele tarmen. Til slutt, bruk pinsett til å rulle tarmen på filterpapiret for å løsne klebemiddelvevet. Ved hjelp av denne protokollen ble sebrafisk av blandet sex vellykket intubert med forskjellige rekombinante proteinnanopartikler.Ved hjelp av den hjemmelagde orale intubasjonsenheten ble det oppnådd en lav gjennomsnittlig prosentandel av dødeligheten. For å evaluere leveringen av de fluorescerende nanopartikler inkluderingsorganer laget med rekombinant TNF alfa, ble det utført en cytometrianalyse. Den totale mengden fluorescerende celler var signifikant høyere i nanopartikkel-intubert gruppe enn i kontrollgruppen både fem og 24 timer etter intubasjon.Intubasjonsutstyret er billig, presist og gjenbrukbart. Hele intubasjonsprosedyren kan gjøres veldig raskt av en operatør, og viktigst av alt er metoden konsistent mellom forskjellige operatører. Kombinasjonen av vår intubasjonsmetode med nedstrøms analyse kan være ideell for oral vaksineutvikling.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Anvendelse av en Mouse Ligated Peyer er Patch Intestinal Loop Assay å evaluere Bakteriell Opptak av M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Komplett tymektomi hos voksne rotter med Non-invasiv endotrakeal intubering

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis som modellorganisme for Assessing Interaksjon av anaerobe bakterier med vertsceller

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Kvantifisere Vibrio cholerae kolonisering og diaré i voksen sebrafisk modell

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modellering tuberkulose Mycobacterium marinum infisert voksen sebrafisk

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

Immunisering av voksen sebrafisk for prekliniske Screening av DNA-baserte vaksiner

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Kvantitativ Polymerase kjedereaksjon-baserte analyser av Murine tarmen bakterieflora etter muntlig antibiotika behandling

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Galleria mellonella muntlig administrasjonsmodell til Study Commensal-Induced medfødte immunreaksjoner

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

Funksjonell vurdering av intestinal permeabilitet og nøytrofil transepithelial migrasjon hos mus ved hjelp av en standardisert tarmsløyfemodell

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Eksperimentell virusinfeksjon hos voksne mygg ved oral fôring og mikroinjeksjon

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...