Name: oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds
Uploaded: 2018-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por concessões do Ministério da ciência, espanhol AGAUR fundos para NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER e 2014SGR-345 AGAUR) e Comissão Europeia. RT detém uma bolsa doutorandos de AGAUR (Espanha), JJ foi apoiada por uma bolsa de doutorado do Conselho da bolsa de China (China) e NR é suportado pelo programa de Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Agradecemos o Dr. Torrealba por consultoria especializada na produção de proteína, s. Botelho da "Servei de Microscopia" e Dr. M. Costa desde o "Servei de Citometria" da Universitat Autònoma de Barcelona, para assistência técnica útil.

Todos os procedimentos experimentais envolvendo peixe-zebra (Danio rerio) foram autorizados pelo Comitê de ética da Universitat Autònoma de Barcelona (número CEEH 1582) de acordo com os princípios orientadores do Internacional para pesquisa envolvendo animais ( EU 2010/63). Todos os experimentos com zebrafish ao vivo foram realizados em 26 e 28 ° C.
1. preparar o equipamento para intubação Oral
<ol><li>Coloque aproximadamente 1 cm de um tubo de silicone fino sobre uma agulha...

<ol>
	<li>Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+exposure+of+zebrafish,+Danio+rerio+(Hamilton),+to+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+peregrinum+reveals+the+gastrointestinal+tract+as+the+primary+route+of+infection:+A+potential+model+for+environmental+mycobacterial+infection.">Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection.</a> Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).</li><li>Lovmo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+nanoparticles+and+Mycobacterium+marinum+across+the+intestinal+epithelium+in+zebrafish+and+the+role+of+the+mucosal+immune+system.">Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system.</a> Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Sized+mPEG-PLGA+Nanoparticles+of+Schisantherin+A+with+Sustained+Release+for+Enhanced+Brain+Uptake+and+Anti-Parkinsonian+Activity.">Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).</li><li>Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gavaging+Adult+Zebrafish.">Gavaging Adult Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).</li><li>Kim, S. H., Jang, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+targeting+to+M+cells+for+enhancing+the+efficacy+of+mucosal+vaccines.">Antigen targeting to M cells for enhancing the efficacy of mucosal vaccines.</a> Experimental and Molecular Medicine. 46 (3), 85 (2014).</li><li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adaptive+immunity+by+the+innate+immune+system.">Regulation of adaptive immunity by the innate immune system.</a> Science. 327 (5963), 291-295 (2010).</li><li>Kunisawa, J., Kiyono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+marvel+of+mucosal+T+cells+and+secretory+antibodies+for+the+creation+of+first+lines+of+defense.">A marvel of mucosal T cells and secretory antibodies for the creation of first lines of defense.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1308-1321 (2005).</li><li>Rombout, J. H., Yang, G., Kiron, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+immune+responses+at+mucosal+surfaces+of+teleost+fish.">Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish.</a> Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).</li><li>Salinas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mucosal+Immune+System+of+Teleost+Fish.">The Mucosal Immune System of Teleost Fish.</a> Biology. 4, 525-539 (2015).</li><li>Munang'andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. &. #. 2. 4. 8. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+challenges+limiting+the+design+of+protective+mucosal+vaccines+for+finfish.">An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish.</a> Frontiers in Immunology. 6, 542 (2015).</li><li>Lickwar, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+dissection+of+conserved+transcriptional+regulation+in+intestinal+epithelial+cells.">Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells.</a> PLoS Biology. 15 (8), 2002054 (2017).</li><li>Brand, M., Granato, M., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+zebrafish.">Keeping and raising zebrafish.</a> Zebrafish. 261, 7-37 (2002).</li><li>Ress&#233;guier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+efficient+uptake+of+surfactant-free+poly(lactic+acid)+nanovaccine+vehicles+by+mucosal+dendritic+cells+in+adult+zebrafish+after+bath+immersion.">Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion.</a> Frontiers in Immunology. 8, 190 (2017).</li><li>Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Performance+RNA+Isolation+Using+the+Maxwell+16+Total+RNA+Purification+Kit.">High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit.</a> Promega Notes. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermo+Fisher+Scientific+NanoDrop+1000+spectrophotometer+V3.8+user's+manual.">Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user's manual.</a> Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).</li><li>Lightfoot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+comparison+of+total+RNA+using+the+Agilent+2100+bioanalyzer,+ribogreen+analysis,+and+UV+spectrometry.">Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry.</a> Agilent Application Note. , (2002).</li><li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+digital+MIQE+guidelines:+Minimum+information+for+publication+of+quantitative+digital+PCR+experiments.">The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Renshaw, S., Loynes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), (2011).</li></ol>

Este protocolo é um aperfeiçoamento da técnica descrita anteriormente para intubação oral por Collymore et al 4 nosso protocolo descreve em detalhes o método de intubação oral e inclui a preparação do intestino para análises a jusante. Nosso método melhora a velocidade de manipulação de peixes permitindo que uma pessoa para executar o protocolo rapidamente, sem muita variação entre os operadores. A principal diferença do nosso protocolo com a anterior é que avaliamos o s...

O objetivo deste artigo é descrever em profundidade um método simples para intubação oral de zebrafish, juntamente com procedimentos de jusante associados útil. Intubação oral usando zebrafish tornou-se um modelo prático no estudo da dinâmica de doenças infecciosas, vacina oral/imuno-estimulantes, drogas/nanopartículas absorção e eficácia e imunidade da mucosa intestinal. Por exemplo, zebrafish intubação oral tem sido usada no estudo de Mycobacterium marinum e Mycobacterium peregrinum infecção1. Lovmo et al . também utilizado com sucesso este modelo para entregar o trato gastro-intestinal de adultos do zebrafish2-nanopartículas e M. marinum . Além disso, Chen et al costumava intubação oral zebrafish para mostrar que drogas encapsuladas por nanopartículas, quando administrada através do trato gastro-intestinal, foram transportados através do sangue cérebro barreira3. Estes autores realizaram intubação baseada no método descrito por Collymore et al gauvage 4 , com algumas modificações. No entanto, eles não forneceu um protocolo altamente detalhado, descrevendo o procedimento de intubação oral. Aqui, apresentamos um método para intubação oral de adultos do zebrafish baseando Collymore et al 4 outras incluem a preparação do intestino para análise pertinente a jusante por citometria, microscopia confocal e qPCR.
O intestino e particularmente sua mucosa é a primeira linha de defesa contra a infecção e o local principal de absorção de nutrientes5. Quando as células epiteliais e células apresentadoras de antígeno dentro da mucosa barreiras percebem sinais de perigo, uma imediata resposta imune inata é acionada. Em seguida, a resposta imune adaptativa altamente específica é estabelecida por de6,de linfócitos T e B7. Desenvolvimento de vacinas orais é uma área de foco atual em Vacinologia. Essas vacinas seria uma ferramenta eficaz para proteger o organismo em locais expostos devido à resposta específica de células do sistema imunológico em tecidos linfoides associados a mucosa (MALT)8,9. Na aquicultura, vacinas da mucosa tem vantagens óbvias em comparação com as vacinas injetáveis. Eles são práticos para vacinação em massa, menos trabalhosa, são menos estressantes para os peixes e podem ser administrados para peixes jovens. No entanto, candidatos vacinais da mucosa devem chegar o segundo segmento de intestino sem ser desnaturada no meio oral. Eles também devem transpor as barreiras da mucosa para obter acesso a apresentadoras de antígenos (APCs) para induzir respostas locais e/ou sistêmica10de células. Portanto, testes de captação da mucosa alcançada pelo candidato oral antígenos e seus sistemas de entrega, bem como a resposta imune evocada, é essencial no desenvolvimento de vacinas orais.
Em um contexto biomédico, desenvolvendo um modelo para testar os efeitos biológicos de compostos após intubação oral é de interesse crescente. Muitas das características anatômicas e fisiológicas do intestino são conservadas entre linhagens é formado por, com mamíferos e peixes ósseos11. Este modelo de entubação oral ligado à análise a jusante pode ser uma ferramenta para fornecer insights sobre a biologia humana, bem como um campo de testes para produtos biológicos ou outros compostos na vivo.
O protocolo de intubação oral pode ser realizado por um operador, por exemplo, administrar com sucesso até 50 µ l de suspensão de nanopartículas de proteína para peixes pesando 1 g, com uma taxa de sobrevivência de alta. O procedimento é simples de configurar e rápido; 30 peixes podem ser intubados em 1h. O protocolo para a preparação do intestino é a chave para fornecer amostras de células e tecidos de qualidade para posterior análise. Exemplos de resultados a jusante são dados que mostram a utilidade do protocolo na obtenção de dados relacionados à absorção intestinal e no isolamento do RNA de qualidade para qPCR. O protocolo seria de grande utilidade para aqueles que necessitam de um modelo adequado para testar a dinâmica da profilaxia oral ou outros compostos no intestino.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1271px;" width="1270">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Silicon tube</td>
			<td style="width:227px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:295px;">508-001</td>
			<td style="width:460px;">0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Luer lock needle</td>
			<td style="width:227px;">Hamilton</td>
			<td style="width:295px;">7750-22</td>
			<td style="width:460px;">31 G, Kel-F Hub</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Luer lock syringe</td>
			<td style="width:227px;">Hamilton</td>
			<td style="width:295px;">81020/01</td>
			<td style="width:460px;">100 &#956;L, Kel-F Hub</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Filtered pipette tip</td>
			<td style="width:227px;">Nerbe Plus</td>
			<td style="width:295px;">07-613-8300</td>
			<td style="width:460px;">10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">MS-222</td>
			<td style="width:227px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">E10521</td>
			<td style="width:460px;">powder</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">10x PBS</td>
			<td style="width:227px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">P5493</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Filter paper&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Filter-Lab</td>
			<td style="width:295px;">RM14034252</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Collagenase</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">17104019</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">31966</td>
			<td style="width:460px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">15240</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:227px;">Falcon</td>
			<td style="width:295px;">352360</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">CellTrics filters&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sysmex Partec</td>
			<td style="width:295px;">04-004-2326 (Wolflabs)</td>
			<td style="width:460px;">30 &#181;m mesh size filters with 2 mL reservoir</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:227px;">SAKURA</td>
			<td style="width:295px;">4583</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plastic molds for cryosections</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4557</td>
			<td>Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Slide</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:295px;">10149870</td>
			<td style="width:460px;">SuperFrost Plus slide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:227px;">Labbox&#160;</td>
			<td style="width:295px;">COVN-024-200</td>
			<td style="width:460px;">24&#180;24 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">158127</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Atto-488 NHS ester</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">41698</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">S5761</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">DMSO</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">D8418</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">AS1340</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:289px;">1-Thioglycerol/Homogenization solution</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td>
			<td style="width:460px;">adding 20 &#956;l 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">vertical laboratory rotator&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Suministros Grupo Esper</td>
			<td style="width:295px;">10000-01062</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cryostat</td>
			<td style="width:227px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:295px;">CM3050S</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:227px;">KINEMATICA</td>
			<td style="width:295px;">Polytron PT1600E</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Flow cytometer&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:295px;">FACS Canto</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">5 mL round bottom tube</td>
			<td style="width:227px;">Falcon</td>
			<td style="width:295px;">352058</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:227px;">Leica</td>
			<td style="width:295px;">SP5</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Fume Hood</td>
			<td style="width:227px;">Kottermann</td>
			<td style="width:295px;">2-447 BST</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Nanodrop 1000</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:295px;">ND-1000</td>
			<td style="width:460px;">Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td style="width:227px;">Agilent</td>
			<td style="width:295px;">G2939A</td>
			<td>RNA bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Maxwell Instrument</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">AS4500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">iScript cDNA synthesis kit&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:295px;">1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:289px;">CFX384 Real-Time PCR&#160;Detection System</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:295px;">1855485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:289px;">iTaq universal SYBR Green Supermix kit</td>
			<td style="width:227px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:295px;">172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Water&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Cryogenic vial&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:295px;">375418</td>
			<td>CryoTube vial</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">F6057</td>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds

A maioria dos patógenos invadem organismos por meio de sua mucosa. Isto é particularmente verdadeiro em peixe como eles estão continuamente expostos a um ambiente de água rica em microbiana. Desenvolver métodos eficazes para entrega oral de Imunoestimuladores ou vacinas, que ativam o sistema imunológico contra doenças infecciosas, é altamente desejável. Na concepção de ferramentas profiláticas, bons modelos experimentais são necessários para testar seu desempenho. Aqui, nós mostramos um método para intubação oral de zebrafish adulto e um conjunto de procedimentos para dissecar e preparar o intestino para citometria, microscopia confocal e análise (qPCR) reação em cadeia de polimerase quantitativa. Com este protocolo, estamos precisamente pode administrar volumes até 50 µ l de pescar pesando cerca de 1 g simplesmente e rapidamente, sem prejudicar os animais. Este método nos permite explorar a absorção direta na vivo de compostos fluorescente rotulados pela mucosa intestinal e a capacidade de imunomoduladores de tais produtos biológicos no local após a intubação. Combinando métodos a jusante como citometria de fluxo, histologia, qPCR e microscopia confocal do tecido intestinal, podemos entender como Imunoestimuladores ou vacinas são capazes de atravessar as barreiras da mucosa intestinais, passar a lâmina própria, e atingir o músculo, exercendo um efeito sobre o sistema imunológico da mucosa intestinal. O modelo pode ser usado para testar a profilaxia oral candidato e sistemas de entrega ou o efeito local de qualquer composto Bioativo administrado por via oral.

Zebrafish (peso médio: 1.03 ± 0,16 g) de sexo misturado com êxito foram intubados com nanopartículas de diferentes proteínas recombinantes (corpos de inclusão bacterianas) usando nosso dispositivo de intubação oral caseiro (Figura 1). Nós temos com sucesso realizada a intubação oral e alcançado uma percentagem média baixa mortalidade (6,8%) (Tabela 1). Zebrafish foram também intubado com 30 µ l ou 50 µ l de suspensões de nano...

Watch this Scientific Journal Video about Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds at JoVE.com

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

Intubação oral de Zebrafish adulto: um modelo para avaliar a absorção Intestinal de compostos bioativos

O protocolo descreve intubação zebrafish adulto com um biológico; em seguida, dissecando e preparar o intestino para citometria, microscopia confocal e qPCR. Este método permite a administração de compostos bioativos para monitorar a absorção intestinal e o estímulo imune local evocado. É relevante para a dinâmica intestinal da profilaxia oral de teste.

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da vacinação da mucosa, como como a mucosa intestinal capta compostos biológicos e como tais biológicos modulam o sistema imunológico no local após a intubação. A principal vantagem dessa técnica é que é simples de configurar, rápido e mostra baixas taxas de mortalidade. Este método pode fornecer informações sobre a vacinação mucosa.Também pode ser aplicado a outros compostos, como produtos químicos, tóxicos ou patógenos. A demonstração visual deste método é fundamental, pois nas etapas de intubação oral e dissecção intestinal, é preciso ter cuidado porque na intubação você pode ferir o zebrafish e causar a morte. Na dissecção, a extremidade do intestino é muito fina e frágil.Coloque aproximadamente um centímetro de tubo de silicone fino em uma agulha de bloqueio Luer calibre 31. Corte uma ponta de pipeta de filtro de 10 microliter estéril, pegue a extremidade mais fina e coloque-a sobre o tubo de silicone como uma baia. Para começar, conecte o aparelho da agulha a uma seringa luer-lock de 100 microliter.Primeiro, mova o peixe para os tanques experimentais uma noite antes do experimento. Vórtice a solução de nanopartículas preparada bem, e elaborar o volume desejado da suspensão. Depois de anestesiar com segurança o peixe, use uma rede para transferir rapidamente o peixe para uma bandeja de plástico molhada.Oriente o animal horizontalmente para enfrentar a agulha. Apoie cuidadosamente o peixe com uma mão e abra a boca com a agulha protegida. Em seguida, insira suavemente a agulha pelo esôfago a cerca de um centímetro da abertura da boca.É difícil ver até onde a agulha deve ir, e isso é uma questão de prática. Você sentirá a agulha quando ela encontrar uma parada, e então, manipulando a agulha, você encontrará o ângulo correto para inserir o dispositivo um pouco mais. Injete lentamente a suspensão da nanopartícula no peixe, garantindo que a suspensão não flua para fora através das brânquias ou da boca.Depois disso, retire suavemente a agulha e coloque o peixe em um tanque de recuperação. Enquanto o peixe se recupera, monitore o peixe para qualquer anormalidade. Uma vez recuperado o peixe, devolva-o a um dos tanques experimentais.Depois de eutanásia do peixe de acordo com o protocolo de texto, coloque o peixe em um pedaço de papel filtro. Usando uma tesoura de dissecção afiada, faça uma incisão semi-circular do ânus até o operículo, e abra a incisão com pinças finas. Em seguida, corte as duas extremidades do intestino, tire todos os órgãos internos e coloque-os no papel do filtro.Em seguida, separe o intestino dos órgãos internos, e estique-o, tomando o cuidado de obter todo o intestino. Por fim, use pinças para enrolar o intestino no papel filtro para desprender o tecido adesivo. Usando este protocolo, os zebrafish de sexo misto foram entubados com sucesso com diferentes nanopartículas de proteína recombinante.Utilizando-se o dispositivo de intubação oral caseiro, foi alcançada uma baixa porcentagem média de mortalidade. Para avaliar a entrega dos corpos de inclusão de nanopartículas fluorescentes feitas com tnf alfa recombinante, foi realizada uma análise de citometria. A quantidade total de células fluorescentes foi significativamente maior no grupo intubado por nanopartículas do que no grupo controle, cinco e 24 horas após a intubação.O equipamento de entubação é barato, preciso e reutilizável. Todo o procedimento de intubação pode ser feito muito rapidamente por um operador e, importante, o método é consistente entre diferentes operadores. A combinação do nosso método de intubação com análise a jusante pode ser ideal para o desenvolvimento de vacinas orais.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Aplicação de um rato ligado patch Peyer Assay alça intestinal para avaliar absorção pelas células bacterianas M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Imunologia e Infecção

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Timectomia completo em ratos adultos com não-invasiva entubação endotraqueal

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis como um organismo modelo para a Avaliação da Interação de bactérias anaeróbias com células do hospedeiro

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Quantificar a colonização de Vibrio cholerae e diarreia no adulto modelo de Zebrafish

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modelagem de tuberculose no Zebrafish adulto infectado de Mycobacterium marinum

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

Imunização do adulto Zebrafish para o rastreio pré-clínica de vacinas baseadas em DNA

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Polimerase quantitativos baseados na reação em cadeia análises de murino Microbiota Intestinal após o tratamento antibiótico Oral

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Um modelo de administração Oral Galleria mellonella para respostas imunes Study Commensal-Induced inata

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

Avaliação Funcional da Permeabilidade Intestinal e Migração Transepitelial de Neutrófilo em Camundongos usando um Modelo de Laço Intestinal Padronizado

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Infecção viral experimental em mosquitos adultos por alimentação oral e microinjeção

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...