Name: oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds
Uploaded: 2018-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантов от испанского министерства науки, Европейской Комиссии и AGAUR средства для NR (AGL2015-65129-R МИНЕКО/ФЕДЕР и 2014SGR-345 AGAUR). RT имеет предварительно докторской стипендии от AGAUR (Испания), JJ было поддержано PhD стипендии от Совета стипендию Китай (Китай) и NR поддерживается программой Ramón y Cajal (Исправительные-2010-06210, МИНЕКО, 2010). Мы благодарим д-р Торреальба для консультации экспертов в производстве белка, н. «Барба» от «Обслуживание де Microscopia» и д-р м. Коста от «Обслуживание de Citometria» на близлежащем автономном Университат де Барселона полезной технической помощи.

Все экспериментальные процедуры с участием данио рерио (Danio рерио) были утверждены Комитетом по этике близлежащем автономном Университат де Барселона (CEEH номер 1582) по согласованию с международные руководящие принципы для исследований с участием животных ( EU 2010/63). Все эксперименты ...

<ol>
	<li>Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+exposure+of+zebrafish,+Danio+rerio+(Hamilton),+to+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+peregrinum+reveals+the+gastrointestinal+tract+as+the+primary+route+of+infection:+A+potential+model+for+environmental+mycobacterial+infection.">Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection.</a> Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).</li><li>Lovmo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+nanoparticles+and+Mycobacterium+marinum+across+the+intestinal+epithelium+in+zebrafish+and+the+role+of+the+mucosal+immune+system.">Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system.</a> Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Sized+mPEG-PLGA+Nanoparticles+of+Schisantherin+A+with+Sustained+Release+for+Enhanced+Brain+Uptake+and+Anti-Parkinsonian+Activity.">Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).</li><li>Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gavaging+Adult+Zebrafish.">Gavaging Adult Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).</li><li>Kim, S. H., Jang, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+targeting+to+M+cells+for+enhancing+the+efficacy+of+mucosal+vaccines.">Antigen targeting to M cells for enhancing the efficacy of mucosal vaccines.</a> Experimental and Molecular Medicine. 46 (3), 85 (2014).</li><li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adaptive+immunity+by+the+innate+immune+system.">Regulation of adaptive immunity by the innate immune system.</a> Science. 327 (5963), 291-295 (2010).</li><li>Kunisawa, J., Kiyono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+marvel+of+mucosal+T+cells+and+secretory+antibodies+for+the+creation+of+first+lines+of+defense.">A marvel of mucosal T cells and secretory antibodies for the creation of first lines of defense.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1308-1321 (2005).</li><li>Rombout, J. H., Yang, G., Kiron, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+immune+responses+at+mucosal+surfaces+of+teleost+fish.">Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish.</a> Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).</li><li>Salinas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mucosal+Immune+System+of+Teleost+Fish.">The Mucosal Immune System of Teleost Fish.</a> Biology. 4, 525-539 (2015).</li><li>Munang'andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. &. #. 2. 4. 8. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+challenges+limiting+the+design+of+protective+mucosal+vaccines+for+finfish.">An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish.</a> Frontiers in Immunology. 6, 542 (2015).</li><li>Lickwar, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+dissection+of+conserved+transcriptional+regulation+in+intestinal+epithelial+cells.">Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells.</a> PLoS Biology. 15 (8), 2002054 (2017).</li><li>Brand, M., Granato, M., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+zebrafish.">Keeping and raising zebrafish.</a> Zebrafish. 261, 7-37 (2002).</li><li>Ress&#233;guier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+efficient+uptake+of+surfactant-free+poly(lactic+acid)+nanovaccine+vehicles+by+mucosal+dendritic+cells+in+adult+zebrafish+after+bath+immersion.">Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion.</a> Frontiers in Immunology. 8, 190 (2017).</li><li>Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Performance+RNA+Isolation+Using+the+Maxwell+16+Total+RNA+Purification+Kit.">High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit.</a> Promega Notes. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermo+Fisher+Scientific+NanoDrop+1000+spectrophotometer+V3.8+user's+manual.">Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user's manual.</a> Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).</li><li>Lightfoot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+comparison+of+total+RNA+using+the+Agilent+2100+bioanalyzer,+ribogreen+analysis,+and+UV+spectrometry.">Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry.</a> Agilent Application Note. , (2002).</li><li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+digital+MIQE+guidelines:+Minimum+information+for+publication+of+quantitative+digital+PCR+experiments.">The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Renshaw, S., Loynes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), (2011).</li></ol>

Этот протокол является улучшение ранее описанные методики для устного интубации на Коллимор et al. 4 наши протокол подробно описывает метод устные интубации и включает в себя подготовку intestine вниз по течению анализа. Наш метод улучшает скорость манипуляции рыбы, позволя...

Цель этой статьи заключается в подробно описать простой метод для устного интубации данио рерио, наряду с полезной связанные течению процедур. Устные интубации, используя данио рерио стала практической моделью в изучении динамики инфекционного заболевания, устные вакцины/иммуностимулирующим, потребление наркотиков/наночастиц и эффективность и кишечной слизистой иммунитета. Например в исследовании Mycobacterium marinum и peregrinum микобактерий инфекции1был использован данио рерио устные интубации. Lovmo и др. также успешно используется эта модель для доставки наночастиц и м. marinum желудочно кишечного тракта у взрослых рыбок данио2. Кроме того, Чэнь et al. используется данио рерио устные интубации чтобы показать, что наркотики инкапсулируется наночастиц, когда управляемые через желудочно кишечного тракта, были перевезены через барьер мозга крови3. Эти авторы провели интубации, основанную на методе gauvage, характеризуется Коллимор et al. 4 с некоторыми изменениями. Однако они не обеспечивают весьма подробный протокол описания процедуры устного интубации. Здесь мы представляем метод для устного интубации взрослых рыбок данио, опираясь на Коллимор et al. 4 далее мы включают подготовку intestine для соответствующих течению анализа цитометрии, конфокальная микроскопия и ПЦР.
Кишечника и особенно ее слизистой оболочки является первой линией обороны против инфекции и основной сайт питательных5. Когда клетки эпителия и антиген представляющих клеток в слизистой барьеры воспринимают сигналы опасности, запускается немедленно врожденный иммунный ответ. Далее,6,лимфоцитов T и B7устанавливается весьма специфический адаптивного иммунного ответа. Развитие устной вакцин является текущее направление в вакцинологии. Такие вакцины будет эффективным инструментом для защиты организма на открытых участках из-за конкретный ответ иммунных клеток в слизистой оболочки связанных лимфоидной ткани (MALT)8,9. В аквакультуре слизистой вакцины имеют очевидные преимущества, по сравнению с инъекционные вакцины. Они практичны для массовой вакцинации, менее трудоемкой, менее стрессовым для рыб и может назначаться молоди рыб. Тем не менее слизистой вакцин-кандидатов должны достичь второго сегмента кишки без денатурировано в устной окружающей среды. Они также должны пересекать слизистой барьеров для того, чтобы получить доступ к антиген представляющих клеток (БТР), чтобы побудить местных или системных ответов10. Таким образом тестирование слизистой поглощения, достигнутые устные антигены кандидат и систем их доставки, а также иммунный ответ вызвал, имеет важное значение в развитии устных вакцин.
В рамках биомедицинских разработка модели для тестирования биологических эффектов соединений после интубации в Оральный растущий интерес. Многие анатомические и физиологические функции кишечника консервируют между bilaterian линий, с11млекопитающих и костистых рыб. Эта модель устные интубации, подключенных к течению анализа может быть инструментом обеспечить понимание биологии человека, а также полигоном для biologics или других соединений в естественных условиях.
Протокол устное интубации могут выполняться одним оператором, например, успешно администрирование до 50 мкл суспензии наночастиц белок рыбы весом 1 g, с высокой выживаемости. Процедура проста в настройке и быстро; 30 рыб может быть интубированных в 1 час. Протокол для кишечника подготовки является ключом к обеспечению качества образцов клеток и тканей для последующего анализа. Приведены примеры течению результаты, которые показывают полезность протокола в получении данных, относящиеся к кишечного поглощения и изолировать РНК качества для ПЦР. Протокол будет весьма полезным для тех, кто нуждается подходящую модель для проверки динамика устных профилактики или других соединений в кишечнике.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1271px;" width="1270">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Silicon tube</td>
			<td style="width:227px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:295px;">508-001</td>
			<td style="width:460px;">0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Luer lock needle</td>
			<td style="width:227px;">Hamilton</td>
			<td style="width:295px;">7750-22</td>
			<td style="width:460px;">31 G, Kel-F Hub</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Luer lock syringe</td>
			<td style="width:227px;">Hamilton</td>
			<td style="width:295px;">81020/01</td>
			<td style="width:460px;">100 &#956;L, Kel-F Hub</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Filtered pipette tip</td>
			<td style="width:227px;">Nerbe Plus</td>
			<td style="width:295px;">07-613-8300</td>
			<td style="width:460px;">10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">MS-222</td>
			<td style="width:227px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">E10521</td>
			<td style="width:460px;">powder</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">10x PBS</td>
			<td style="width:227px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">P5493</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Filter paper&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Filter-Lab</td>
			<td style="width:295px;">RM14034252</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Collagenase</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">17104019</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">31966</td>
			<td style="width:460px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:295px;">15240</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:227px;">Falcon</td>
			<td style="width:295px;">352360</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">CellTrics filters&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sysmex Partec</td>
			<td style="width:295px;">04-004-2326 (Wolflabs)</td>
			<td style="width:460px;">30 &#181;m mesh size filters with 2 mL reservoir</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:227px;">SAKURA</td>
			<td style="width:295px;">4583</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plastic molds for cryosections</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4557</td>
			<td>Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Slide</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:295px;">10149870</td>
			<td style="width:460px;">SuperFrost Plus slide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:227px;">Labbox&#160;</td>
			<td style="width:295px;">COVN-024-200</td>
			<td style="width:460px;">24&#180;24 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">158127</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Atto-488 NHS ester</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">41698</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">S5761</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">DMSO</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">D8418</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">AS1340</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:289px;">1-Thioglycerol/Homogenization solution</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td>
			<td style="width:460px;">adding 20 &#956;l 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">vertical laboratory rotator&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Suministros Grupo Esper</td>
			<td style="width:295px;">10000-01062</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Cryostat</td>
			<td style="width:227px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:295px;">CM3050S</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:227px;">KINEMATICA</td>
			<td style="width:295px;">Polytron PT1600E</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Flow cytometer&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:295px;">FACS Canto</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">5 mL round bottom tube</td>
			<td style="width:227px;">Falcon</td>
			<td style="width:295px;">352058</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:227px;">Leica</td>
			<td style="width:295px;">SP5</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Fume Hood</td>
			<td style="width:227px;">Kottermann</td>
			<td style="width:295px;">2-447 BST</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Nanodrop 1000</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:295px;">ND-1000</td>
			<td style="width:460px;">Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td style="width:227px;">Agilent</td>
			<td style="width:295px;">G2939A</td>
			<td>RNA bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Maxwell Instrument</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:295px;">AS4500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">iScript cDNA synthesis kit&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:295px;">1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:289px;">CFX384 Real-Time PCR&#160;Detection System</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:295px;">1855485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:289px;">iTaq universal SYBR Green Supermix kit</td>
			<td style="width:227px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:295px;">172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Water&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Cryogenic vial&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:295px;">375418</td>
			<td>CryoTube vial</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:289px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:295px;">F6057</td>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds

Большинство возбудителей вторгнуться организмов через их слизистой оболочки. Это особенно верно в рыбе, как они постоянно подвергаются воздействию микробной богатые водной среды. Разработка эффективных методов для перорального Иммуностимуляторы или вакцин, которые активируют иммунную систему против инфекционных заболеваний, является весьма желательным. В разработке профилактических средств, хорошие экспериментальные модели необходимо проверить их эффективность. Здесь мы показываем, метод для устного интубации взрослых рыбок данио и набор процедур для вскрыть и подготовки кишечника цитометрии, confocal микроскопии и анализа количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот протокол мы точно можно администрировать тома до 50 мкл рыбы весом примерно 1 g просто и быстро, без ущерба для животных. Этот метод позволяет нам исследовать поглощения прямых в vivo дневно помечены соединений на слизистой оболочке кишечника и иммуномодулирующим потенциала таких биопрепаратов на локальном сайте после интубации. Объединив течению методы, такие как проточной цитометрии, гистология, ПЦР и confocal микроскопии кишечника ткани, мы можем понять, как возможность пересечь кишечной слизистой барьеров, проходят через lamina propria, иммуностимуляторы или вакцины и достичь мышцы, оказывая влияние на кишечной слизистой иммунной системы. Модель может использоваться для проверки кандидата устные профилактики и систем доставки или местное действие любого перорального биоактивных соединений.

Данио рерио (средний вес: 1,03 ± 0,16 g) смешанного пола были успешно интубированных с различными рекомбинантных белков наночастиц (бактериальный включение органы) с помощью нашего дома сделал устные интубации устройства (рис. 1). Мы успешно выполнять устные...

Watch this Scientific Journal Video about Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds at JoVE.com

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

Устные интубации взрослых рыбок данио: модель для оценки кишечного поглощения биоактивных соединений

Протокол описывает интубирование взрослых данио рерио с биологическими; затем рассечения и подготовка кишечника цитометрии, конфокальная микроскопия и ПЦР. Этот метод позволяет администрации биоактивных соединений для мониторинга кишечного поглощения и местной иммунной стимул вызывали. Это актуально для тестирования кишечных динамика устных профилактики.

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области вакцинологии слизистой оболочки, такие как, как кишечные слизистой оболочки поглощения биологических соединений и как такие биологические модулировать иммунную систему на местном сайте после инотубации. Основным преимуществом этого метода является то, что он прост в настройке, быстро, и показывает низкие показатели смертности. Этот метод может дать представление о слизистой вакцинологии.Он также может быть применен к другим соединениям, таким как химические вещества, токсичные вещества или патогенные микроорганизмы. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, как и в устной инаблизации и кишечных шагов вскрытия, вы должны быть осторожны, потому что в intubation вы можете повредить зебры и привести к смерти. При вскрытии конец кишечника очень тонкий и хрупкий.Поместите примерно один сантиметр тонкой силиконовой трубки на 31-калиберной игле Luer-lock. Вырезать стерильные 10-микролитровый фильтр пипетки кончик, принять тонкий конец, и поместить его на силиконовую трубку в качестве оболочки. Для начала прикрепите аппарат иглы к 100-микролитровому шприцу Luer-lock.Во-первых, переместить рыбу в экспериментальные резервуары за одну ночь до начала эксперимента. Vortex хорошо подготовил раствор наночастиц и нарисует нужный объем подвески. После безопасной анестезии рыбы, используйте сетку, чтобы быстро передать рыбу на мокрый пластиковый лоток.Сориентировать животное горизонтально, чтобы лицом к игле. Аккуратно поддержите рыбу одной рукой и откройте рот защищенной иглой. Затем аккуратно вставьте иглу вниз пищевода примерно на один сантиметр от отверстия рта.Трудно понять, как далеко должна зайти игла, и это вопрос практики. Вы почувствуете иглу, как она находит остановку, а затем, манипулируя иглой, вы найдете правильный угол, чтобы вставить устройство немного больше. Медленно введать наночастицы подвески в рыбу, гарантируя, что подвеска не течет наружу через жабры или рот.После этого аккуратно снимите иглу и поместите рыбу в восстановительный бак. Пока рыба восстанавливается, следите за рыбой на любые аномалии. Как только рыба выздоровеет, верните ее в один из экспериментальных резервуаров.После усыпания рыбы в соответствии с текстовым протоколом, поместите рыбу на лист фильтровальной бумаги. Используя острые ножницы для вскрытия, сделайте полукруглый разрез от ануса до оперкулума и откройте разрез мелким пинцетом. Затем вырежьте оба конца кишечника, вывихйте все внутренние органы и поместите их на фильтровальную бумагу.Далее отделяем кишечник от внутренних органов и растягиваем его, заботясь о том, чтобы получить весь кишечник. Наконец, используйте пинцет, чтобы свернуть кишечник на фильтровальную бумагу, чтобы отделить клейую ткань. Используя этот протокол, зебрафиш смешанного пола были успешно интубированы с различными рекомбинантными белковыми наночастицами.С помощью самодельного прибора пероральной илюбимости был достигнут низкий средний процент смертности. Для оценки доставки флуоресцентных наночастиц инклюзивных тел, сделанных с рекомбинантной альфа-ТНФ, был проведен цитометрийный анализ. Общее количество флуоресцентных клеток было значительно выше в группе наночастиц, чем в контрольной группе, как через пять, так и через 24 часа после интубации.Оборудование для инкубации недорогое, точное и многоразовое. Вся процедура инотубации может быть выполнена очень быстро одним оператором, и, что важно, метод согласуется между различными операторами. Сочетание нашего метода итубации с анализом ниже по течению может быть идеальным для разработки пероральной вакцины.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Применение Мышь лигируют Патч Пейера Кишечные Пробирной Loop для оценки бактериальной поглощение М клетки

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Полный Тимэктомия у крыс взрослых с неинвазивной интубации трахеи

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis в качестве модельного организма для оценки интерактивности анаэробных бактерий с клеток-хозяев

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Холерный вибрион колонизации и диарея в модели для взрослых рыбок данио

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Моделирование туберкулеза Mycobacterium marinum инфицированных взрослых рыбок данио

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

Иммунизации взрослых рыбок данио доклинические скрининга на основе ДНК вакцин

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Количественные полимеразной цепной реакции на основе анализ мышиных кишечной микробиоты после устные лечения антибиотиками

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Модель администрирования Galleria mellonella устные Innate иммунных реакций Study Commensal-Induced

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

Функциональная оценка кишечной проницаемости и трансэпителиальной миграции нейтрофилов у мышей с использованием стандартизированной модели кишечной петли

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Экспериментальная вирусная инфекция у взрослых комаров при пероральном кормлении и микроинъекциях

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...