Name: the mub40 peptide for use in detecting neutrophil-mediated inflammation events
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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这项工作得到了 laurette fugain 基金会 (lf-2015-15) (b. s. m.) 和 anr jcjc 赠款 (anr-17-ce15-0012) (b. s. m.) 的支持。

法国的 comrc (clices)、cpp (人员保护委员会) 和国家信息和自由委员会 (cnil) 都审查并批准了这里所述的所有方法。
1. 用荧光标记的 mub 40 在组织病理组织中染色中性粒细胞
<ol><li>要获得组织病理学组织, 根据样品厚度, 将组织/活检切片固定在4% 的甲醛 (pfa) 的适当体积中30分钟至4小时。固定时, 请将样品放在4°c 的冰箱中。 注意: 可根据用户的独特需求替代替代固定方?...

<ol>
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在这里, 两个检测中描述了 mub40肽用于研究中性粒细胞炎症和激活。我们展示了 mub40如何揭示组织病理学部分中存在的中性粒细胞, 或使用活纯化的中性粒细胞显示其激活状态。使用 mub40作为染色试剂的关键步骤与任何其他荧光检测方法相同。必须注意确保荧光信号的兼容性, 并采取适当的洗涤步骤来消除背景染色。要获得良好的染色效果, 最重要的考虑因素是显微镜、玻?...

中性粒细胞是先天免疫系统的主要武器之一, 经常被招募到身体周围的炎症部位。中性粒细胞的研究在很大程度上受到其体外寿命短 (不到 8小时) 以及在基础条件下或激活后的有限检测工具的影响。在这里, 我们提出了一个经过很好检验的协议, 广泛和具体的检测哺乳动物中性粒细胞在固定渗透样品。我们还提供了一个详细的协议染色活中性粒细胞与 mub40。利用活性中性粒细胞染色协议, 可以确定中性粒细胞活化的时间和位置。该方案是理想的研究人员谁希望研究中性粒细胞激活或颗粒释放。除了抗菌功能, 中性粒细胞现在被视为免疫调节细胞, 参与了广泛的疾病和免疫反应 (先天和适应性)1,2。中性粒细胞存在于大多数炎症组织中, 在感染组织中的数量较多, 在炎症性肿瘤3中, 在 ibs 和克罗恩的爆发过程中, 在 4, 以及在非传染性炎症的地区, 如类风湿关节炎滑膜 (ra) 患者5。中性粒细胞含有四类预先形成的颗粒, 分别称为阿佐罗非 (α)、特异性 (β1)、三级 (β2) 颗粒和分泌囊泡 (γ)6。当迁移到炎症部位时, 被招募的中性粒细胞就会被激活并依次分泌颗粒含量 (由粘附、抗菌化合物和免疫调节分子组成), 从而促进进一步的招募, 并有助于进一步的招募。感染分辨率 (也对宿主组织损伤)7。虽然中性粒细胞被认为是先天免疫的一个关键方面, 但到目前为止, 可用于研究它们的检测试剂很少, 可用于评估活中性粒细胞激活状态的试剂更少。
目前检测中性粒细胞的方法依赖于针对细胞表面暴露的抗原产生的单克隆抗体, 如 ly-6g2或在基础条件下专门储存在中性粒细胞颗粒中的蛋白质 (如髓过氧化物酶), 乳铁蛋白)。单克隆抗体的优点包括在各种检测条件下具有很强的结合性、灵敏度和多功能性。然而, 使用单克隆抗体, 特别是抗 le-6g 有几个缺点。这些缺点包括特异性, 因为 Ly-6G 存在于骨髓中的大多数骨髓细胞和包括嗜酸性粒细胞在内的所有粒细胞上;因此, 用这种标记从嗜酸性粒细胞中破译中性粒细胞需要更多的复合物接近8。单克隆抗体的另一个常见权衡是它们的宿主特异性范围往往有限, 因此很难与不止一种动物进行比较研究。抗体检测方法的第三个缺点, 特别是在使用活细胞或在体内使用时,是它们有可能破坏细胞功能或导致细胞激活。例如, 对小鼠使用抗 le-6g 通常用于中性粒细胞的消耗和短暂性中性粒细胞减少9。此外, 抗体注射还可以刺激中性粒细胞的抗肿瘤功能10。最后, 中性粒细胞的抗体检测并不能揭示细胞的激活状态。
我们已经确定了一种名为 mub 40 的 40-氨基酸肽, 它可用于在体外或体内条件下标记中性粒细胞的一些检测, 并检测活中性粒细胞的激活状态11。mub40来源于mub 7012,这是尿尿乳杆菌表面粘液结合蛋白的一个领域, 最初描述的是它具有结合粘液13,14的能力。mub40与糖基化乳铁蛋白相互作用, 在中性粒细胞特异性颗粒和三级颗粒中存在高浓度的糖基化乳铁蛋白。mub40可以通过组织病理学或荧光激活细胞分选 (facs) 协议中的标准渗透步骤暴露在这些颗粒中, 以实现固定中性粒细胞的鲁棒染色。当活中性粒细胞保持在失活状态时, mub40肽被排除在颗粒含量之外, 细胞不会用标记染色呈阳性。激活后, mub40可与暴露的乳铁蛋白结合, 并导致与肽的强染色。因此, mub40可以用来确定纯化中性粒细胞的活化状态, 使其成为跟踪感染过程的一个有吸引力的标记。结合活体激活中性粒细胞的能力还允许 mub40作为工具, 在活体动物模型中检测中性粒细胞炎症区域 (例如,小鼠关节炎模型15)。本手稿中的协议详细说明了如何荧光标记的 mub40可以用来揭示组织中的中性粒细胞, 以及如何检测活体纯化中性粒细胞在体外的激活。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="894">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">MUB40-Cy5</td>
			<td style="width:123px;">Benoit Marteyn</td>
			<td style="width:344px;">benoit.marteyn@pasteur.fr</td>
			<td style="width:167px;">Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RI-MUB40-Cy5</td>
			<td>Benoit Marteyn</td>
			<td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td>
			<td>Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Parformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">16005</td>
			<td>Fixative for histology</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Solution used to remove excess PFA</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td align="right">4583</td>
			<td>Used to freeze tissue before cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-Methylbutane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M32631</td>
			<td>Used to freeze tissue before cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">1.00974</td>
			<td>Used for dry ice bath to freeze tissue</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Leica Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1520</td>
			<td>Used to section tissues</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass microscopy slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-518-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cover slips</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>CG15CH</td>
			<td>Hi precision coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dako pen&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td>Used to prevent liquid loss during tissue staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">47036</td>
			<td>Used to permeabilize cells for IF staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">10236276001</td>
			<td>Stains DNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa fluor 488 Phalloidin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Binds actin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prolong Gold antifade Mountant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Prolongs IF signal and resistance to photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluorescent microscope</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Used to image IF slides</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anoxic Cabinet</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Used for the purification of live inactivated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Chloride NaCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Washing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MACS BSA buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>Washing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4937</td>
			<td>Gradient for neutrophil purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD235a glycophorin magnetic microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-501</td>
			<td>Used to remove contaminating RBCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used in the removal of RBCs from neutrophils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 without Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8755</td>
			<td>Used for neutrophil assays</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mub40 peptide for use in detecting neutrophil-mediated inflammation events

在这里, 我们提供了一个涉及使用 mub40的协议, mub 40 是一种合成肽, 能够将高浓度的糖基化乳铁蛋白结合起来, 储存在中性粒细胞的特定颗粒和三级颗粒中。该协议详细介绍了如何使用 mub40直接与荧光体结合, 以染色固定渗透组织中的中性粒细胞, 以及如何在活细胞成像中使用, 以检测中性粒细胞的活化和去粒化。中性粒细胞检测方法仅限于物种特异性单克隆抗体, 这些抗体并不总是适用于某些应用。mub40不会穿透细胞膜, 因此被排除在储存在非活性无渗透中性粒细胞中的乳铁蛋白中。mub40的额外优点是可以从广泛的宿主范围内识别乳铁蛋白, 这使得它特别适用于比较涉及多个研究模型的研究结果、减少重复试剂的数量和简化协议通过单步染色。

组织病理学幻灯片中 mub40染色组织的结果通常显示分散在组织中的单个细胞。mub40染色乳铁蛋白, 存在于中性粒细胞颗粒和条块分割。因此, 通常看到的是点状染色或来自单个中性粒细胞的几个大的分离区域的信号 (图 1)。添加第二个细胞标记 (如 dapi) 有助于将 mub40信号与染色细胞共定位。检测到的细胞总数取决于视野中存在?...

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The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

在这里, 我们提出了一个协议, 以检测中性粒细胞的存在在固定/渗透组织学切片, 并评估活纯化中性粒细胞的激活状态。特别是, mub40肽结合了存在于中性粒细胞特异性和三级颗粒中的乳铁蛋白。颗粒内容物通过渗透或中性粒细胞活化暴露, 可以标记中性粒细胞。

mub40肽在中性炎症事件检测中的应用

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

MUB40是一种新型的嗜中性粒细胞标记物，与乳铁蛋白结合，允许在人类和所有哺乳动物组织样本中进行特定检测。使用 MUB40 标记嗜中性粒细胞是简单、快速和特定的。它现在在我们的实验室中被广泛使用，这种技术的含义延伸到炎症性疾病的诊断。首先，根据文本协议准备解决方案一、二和三，并把它们放在一个厌氧的柜子中过夜。然后，将采集的血液管在650克下离心20分钟，将细胞从血浆分数分离。在不干扰分离的血液的情况下，将管转移到厌氧柜，然后将血浆分数转移到50毫升锥形管中。在此之后，从厌氧柜中取出等离子体管，并在2900g下离心20分钟。注意不要破坏颗粒血小板，将管子转移到厌氧柜，将血小板劣质血浆移液到新鲜 50 毫升管中。使用血液采集管，将红血球组合在锥形50毫升管中。然后，加入0.9%的氯化钠溶液，直到总体积达到44毫升，并加入6毫升6%的脱氧银糖。倒置管10至20次，轻轻混合血液和葡萄糖混合物，让管沉淀至少30分钟。当管沉积物时，通过向 5.8 毫升等离子体中加入 4.2 毫升的 Percoll 溶液来准备 Percoll 梯度，然后反转管以混合。接下来，收集含有德xtran顶部部分的嗜中性粒细胞，注意不要移液红血球。拧紧螺钉盖，从厌氧柜中拆下离心管，并在 300 g 下离心管 10 分钟。注意不要干扰颗粒细胞，将管子放回厌氧柜中。然后，通过移液去除液体。轻轻将颗粒重新在一毫升血浆中。缓慢地将重新暂停的细胞添加到 Percoll 溶液的顶部。小心地从厌氧柜中取出 Percoll 溶液管，并在 800 g 下将其离心 20 分钟，以将 PBMC 与嗜中性粒细胞分离。接下来，根据文本协议准备14毫升的洗涤缓冲液。然后，将珀科尔管放在厌氧柜中。使用移液器去除 Percoll 和 PBMC，并在一毫升洗涤缓冲液中重新暂停含有颗粒的中性粒。接下来，在重新悬浮的细胞中加入200微升磁珠。轻轻混合和孵育细胞和珠子至少15分钟。在此之后，用两毫升的洗涤缓冲液洗两次分离柱。在柱下拿着一个新的15毫升锥形管时，缓慢移液通过柱状的中性粒细胞红细胞混合物。从柱流应为多云并失去红色，确认嗜中性粒细胞与剩余红血球的总分离。将两毫升洗涤缓冲液添加到柱的顶部，并在同一管中收集流经。到此洗涤结束时，流经应清晰。轻轻混合收集管，确保嗜中性粒细胞均匀分布。然后从细胞计数中收集10微升的流经。在此之后，从厌氧柜中取出中性粒细胞管，并在300克离心管20分钟。将沉淀的中性粒细胞放回厌氧柜，通过移液去除洗涤缓冲液。然后，在等离子体中重新暂停颗粒。将一升 RI-MUB40-Cy5 加入一毫升 RPMI-1640 介质中，不带酚红色，通过移液混合。然后，添加一个微升的 FMLP 溶液和移液器混合。将混合物转移到玻璃底显微镜盘中。然后向菜中加入适当体积的纯化细胞。最后，将盘子放入倒置荧光显微镜中，开始图像采集。在此协议中，MUB40用于活细胞，在使用 FMLP 进行模拟时检测嗜中性粒细胞分泌物。颗粒含量（包括乳铁蛋白）释放的动力学可以随着时间的推移而可视化，这里用品红色显示。MUB40 可额外用于固定嗜中性粒细胞。在这里，在一个时数序列中吞噬荧光珠。中性粒的内容被标为蓝色。中性粒细胞在早期点很少或没有细胞染色，并且逐渐，RI-MUB40标签随着时间的推移而增加，在等离子膜和珠表面。MUB40也可用于固定炎症组织，以检测嗜中性粒细胞，如文本数字所示。我们在这里描述中性粒细胞纯化程序，在我们的实验室中常规应用。任何其他方法都适用，MUB40-Cy5 标签仍将有效。中性粒细胞在纯化后可专门用MUB40标记，或直接在患者或动物模型中的发炎组织中。若干MUB40衍生工具被设计成扩大其用途。该技术开发后，为炎症领域的研究人员探索炎症性疾病的嗜中性粒细胞和活化铺平了道路。

Research

JoVE Journal

Biology

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