Name: the mub40 peptide for use in detecting neutrophil-mediated inflammation events
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) og ANR JCJC tilskud (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).

Alle metoder, der beskrives her har gennemgået og godkendt af de franske organisationer CoRC (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) og CNIL (Kommissionen Nationale Informatique et Liberté).
1. farvning neutrofiler i histopatologi væv med Fluorescently mærket MUB40
<ol><li>For at få væv til histopatologisk undersøgelse, lave væv/biopsi sektioner i en passende mængde af 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 30 min op til 4 h afhængigt af tykkelsen ...

<ol>
	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Nicol&#225;s-&#193;vila, J. &. #. 1. 9. 3. ;., Adrover, J. M., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+Homeostasis,+Immunity,+and+Cancer.">Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer.</a> Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).</li><li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer:+neutral+no+more.">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li><li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases.">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li><li>Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+redox+stress+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+disease.">Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. , (2018).</li><li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granules+of+the+human+neutrophilic+polymorphonuclear+leukocyte.">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li><li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils,+from+marrow+to+microbes.">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li><li>Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Ly6C/Ly6G-based+strategy+to+analyze+the+mouse+splenic+myeloid+compartment.">A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).</li><li>Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6G++neutrophils+are+dispensable+for+defense+against+systemic+Listeria+monocytogenes+infection.">Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection.</a> Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).</li><li>Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+mediate+antibody-induced+antitumor+effects+in+mice.">Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice.</a> Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).</li><li>Anderson, M. C., Chaze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUB40+Binds+to+Lactoferrin+and+Stands+as+a+Specific+Neutrophil+Marker.">MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker.</a> Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).</li><li>Co&#239;c, Y. -. M., Baleux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+specific+colonic+mucus+marker+using+a+human+commensal+bacterium+cell+surface+domain.">Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).</li><li>Roos, S., Jonsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-molecular-mass+cell-surface+protein+from+Lactobacillus+reuteri+1063+adheres+to+mucus+components.">A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components.</a> Microbiology. 148, 433-442 (2002).</li><li>Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+proteins+with+a+mucus-binding+domain+found+exclusively+in+lactic+acid+bacteria.">Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria.</a> Microbiology. 152, 273-280 (2006).</li><li>Mancardi, D. A., J&#246;nsson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+The+murine+high-affinity+IgG+receptor+Fc&#947;RIV+is+sufficient+for+autoantibody-induced+arthritis.">Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor Fc&#947;RIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis.</a> Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).</li><li>Walmsley, S. R., Print, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+neutrophil+survival+is+mediated+by+HIF-1alpha-dependent+NF-kappaB+activity.">Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).</li><li>Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoxia+and+glucose+supplementation+preserve+neutrophil+viability+and+function.">Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function.</a> Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).</li></ol>

Her beskrives to assays hvor MUB40 peptid er brugt til at studere neutrofile betændelse og aktivering. Vi viser, hvordan MUB40 kan afsløre neutrofiler i histopatologi sektioner eller vise deres aktivering staten bruger live renset neutrofiler. De kritiske trin til brug af MUB40 som en farvning reagens er den samme som med enhver anden fluorescerende påvisningsmetode. Skal sørges for at sikre kompatibilitet af fluorescerende signaler og at have taget tilstrækkelig vask skridt til at f...

Neutrofile er en af de primære våben af den medfødte immunsystem og rekrutteres rutinemæssigt at lokaliteter af betændelse omkring kroppen. Studiet af neutrofiler har været i høj grad svækket af deres korte levetid i vitro (mindre end 8 h) og af begrænset registreringsværktøjer basal betingelser eller efter aktivering. Vi præsenterer her, en velafprøvet protokol for den brede og specifik påvisning af pattedyr neutrofiler i fast/permeabilized prøver. Vi tilbyder også en detaljeret protokol for farvning live neutrofiler med MUB40. Ved hjælp af live neutrofile farvnings-protokollen, kan timing og placering af neutrofile aktivering være identificeret. Denne protokol er ideel til forskere, der ønsker at studere neutrofile aktivering eller granula frigivelse. Ud over deres antimikrobielle funktioner, er neutrofile nu værdsat som immunmodulerende celler involveret i en bred vifte af sygdomme og immunrespons (medfødte og adaptive)1,2. Neutrofiler er til stede i de fleste inflammatorisk væv, på høje tal i inficeret væv, i inflammatoriske tumorer3, under IBS og Crohns flare-ups4, og i områder af ikke-infektiøs inflammation som Gunnbjørn af leddegigt ( RA) patienter5. Neutrofiler indeholder fire klasser af præformerede granulat opkaldt azurophil (α), specifikke (B1), tertiær (β2) granulat og sekretoriske vesikler (γ)6. Ved overflytning til en inflammatorisk websted, rekrutterede neutrofiler blive aktiveret og udskiller sekventielt granulet indholdet (sammensat af adhæsion, antimikrobielle forbindelser og immunmodulerende molekyler), der fremmer yderligere rekruttering og bidrager til infektion opløsning (men også til værten vævsskader)7. Mens neutrofiler betragtes et kritisk aspekt af medfødt immunitet, indtil der er par påvisning reagenser tilgængelige at studere dem, og endnu færre der kan bruges til at vurdere aktiveringstilstand for levende neutrofiler.
Nuværende metoder til påvisning af neutrofiler stole på monoklonale antistoffer dannet mod celle-overflade udsat antigener, såsom Ly - 6 G2 eller proteiner specifikt gemt i neutrofile granulat under basale forhold (f.eks. myeloperoxidase lactoferrin). Fordele af monoklonale antistoffer omfatter deres stærke binding, følsomhed og alsidighed under forskellige assay. Der er dog flere ulemper ved at bruge monoklonale antistoffer og anti-Ly - 6G i særdeleshed. Disse ulemper omfatter specificitet, som Ly - 6G er til stede på et flertal af myeloide celler i knoglemarven og på alle granulocytter herunder eosinofile; således er kræver decifrere neutrofiler fra eosinofile med denne markør mere komplekser tilgange8. En anden hyppig afvejning med monoklonale antistoffer er deres ofte begrænsede vært værtsspecificitet, vanskeliggør sammenligning undersøgelser med mere end én dyreart. En tredje ulempe af antistof påvisningsmetoder, især når du bruger levende celler eller in vivo, er deres potentiale til at forstyrre cellefunktion eller føre til celle aktivering. For eksempel, er administration af anti-Ly - 6G til mus almindeligvis anvendes til neutrofile udtynding og forbigående neutropeni9. Det er desuden påvist, at antistof injektion kan stimulere neutrofile antitumor funktion10. Påvisning af antistof af neutrofiler afslører endelig ikke aktiveringstilstand for cellen.
Vi har identificeret en 40-amino syre peptid kaldet MUB40, som kan bruges i en række af assays til label neutrofiler i in vitro eller vivo betingelser samt assay aktivisering statussen af levende neutrofiler11. MUB40 er afledt fra MUB7012, et domæne af Lactobacillus reuteri overflade Slim-bindende protein oprindeligt beskrevet for sin evne til at binde Slim13,14. MUB40 interagerer med glykosyleret Laktoferrin, der er til stede i høje koncentrationer i neutrofile-specifikke og tertiære granulat. MUB40 kan blive udsat for disse granulatet gennem standard permeabilization trin i histopatologi eller fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) protokoller for robust farvning af faste neutrofiler. Når levende neutrofiler holdes i en inaktiveret stat, MUB40 peptid er udelukket fra granulet indholdet, og celler pletter ikke positivt med markøren. Ved aktivering, kan MUB40 binde til udsatte lactoferrin og føre til robust farvning med peptid. MUB40 kan således bruges til at bestemme aktiveringstilstand for renset neutrofiler, hvilket gør det til et attraktivt markør til at følge den infektiøse proces. Evnen til at binde til live aktiveret neutrofiler tillader også MUB40 skal bruges som et redskab til at opdage områder af neutrofile betændelse i live dyremodeller (f.eks. en mus gigt model15). Protokoller i dette manuskript detaljer hvordan fluorescently mærket MUB40 kan bruges til at afsløre neutrofiler i histologi væv og sådan assay aktivering af levende renset neutrofiler i vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="894">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">MUB40-Cy5</td>
			<td style="width:123px;">Benoit Marteyn</td>
			<td style="width:344px;">benoit.marteyn@pasteur.fr</td>
			<td style="width:167px;">Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RI-MUB40-Cy5</td>
			<td>Benoit Marteyn</td>
			<td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td>
			<td>Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Parformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">16005</td>
			<td>Fixative for histology</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Solution used to remove excess PFA</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td align="right">4583</td>
			<td>Used to freeze tissue before cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-Methylbutane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M32631</td>
			<td>Used to freeze tissue before cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">1.00974</td>
			<td>Used for dry ice bath to freeze tissue</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Leica Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1520</td>
			<td>Used to section tissues</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass microscopy slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-518-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cover slips</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>CG15CH</td>
			<td>Hi precision coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dako pen&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td>Used to prevent liquid loss during tissue staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">47036</td>
			<td>Used to permeabilize cells for IF staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">10236276001</td>
			<td>Stains DNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa fluor 488 Phalloidin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Binds actin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prolong Gold antifade Mountant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Prolongs IF signal and resistance to photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluorescent microscope</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Used to image IF slides</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anoxic Cabinet</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Used for the purification of live inactivated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Chloride NaCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Washing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MACS BSA buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>Washing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4937</td>
			<td>Gradient for neutrophil purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD235a glycophorin magnetic microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-501</td>
			<td>Used to remove contaminating RBCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used in the removal of RBCs from neutrophils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 without Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8755</td>
			<td>Used for neutrophil assays</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mub40 peptide for use in detecting neutrophil-mediated inflammation events

Her, leverer vi en protokol, der involverer brugen af MUB40, en syntetiseret peptid med evnen til at binde glykosyleret lactoferrin gemt i høje koncentrationer i specifikke og tertiære granulat af neutrofiler. Denne protokol detaljer hvordan MUB40 konjugeret direkte til en fluorophore kan bruges til at plette neutrofiler i fast/permeabilized væv samt, hvordan dette kan bruges i live-celle imaging til assay for neutrofile aktivering og deaktivering sker en granulering tørrer. Neutrofile påvisningsmetoderne er begrænset til artsspecifikke monoklonale antistoffer, som ikke altid er egnet til visse anvendelser. MUB40 trænge ind ikke i cellemembranen og er dermed udelukket fra lactoferrin gemt i ikke-aktiveret/ikke-permeabilized neutrofiler. MUB40 har den ekstra fordel af anerkende lactoferrin fra en bred værtsspektrum, gør det især nyttig for at sammenligne resultater i undersøgelser, hvor flere forskning modeller, at reducere antallet af dublerede reagenser, og forenkle protokoller gennem trinvis farvning.

Resultaterne af MUB40-farvede væv fra histopatologi dias typisk afsløre individuelle celler spredt over hele væv. MUB40 pletter Laktoferrin, som er til stede i neutrofile granulat og opdelte. Således ses typisk punktformet farvning eller flere store adskilte områder af signalet kommer fra individuelle neutrofile (figur 1). Det er nyttigt at tilføje en anden celle markør som DAPI at hjælpe Co lokalisere MUB40 signal med...

Watch this Scientific Journal Video about The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events at JoVE.com

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

Vi præsenterer her, en protokol for at påvise tilstedeværelsen af neutrofiler i fast/permeabilized histologi sektioner og vurdere aktiveringstilstand for levende renset neutrofiler. Især binder MUB40 peptid lactoferrin stede i neutrofile-specifikke og tertiære granulat. Eksponering af granulet indholdet gennem enten permeabilization eller neutrofile aktivering giver mulighed for mærkning af neutrofiler.

MUB40 peptid til brug i forbindelse med afsløring neutrofile-medieret betændelse begivenheder

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

MUB40 er en ny neutrofil markør, som binder sig til lactoferrin og giver mulighed for en specifik påvisning i humant og alle pattedyr væv prøve testet hidtil. Mærkning neutrofiler med MUB40 er nemt, hurtigt og specifikt. Det er nu brugt bredt i vores laboratorium og konsekvenserne af denne teknik strækker sig i retning af diagnosticering af inflammatoriske sygdomme.Til at begynde, forberede løsninger en, to og tre i henhold til tekstprotokollen, og placere dem i en anoxisk kabinet natten over. Derefter centrifuges rør af opsamlet blod ved 650 g i 20 minutter for at adskille cellerne fra plasmafraktionen. Uden at forstyrre det adskilte blod overføres rørene til det anoxiske skab, og plasmafraktionerne overføres til et konisk rør på 50 milliliter.Herefter fjernes plasmarøret fra det anoxiske kabinet og centrifugeres ved 2900 g i 20 minutter. Pas på ikke at forstyrre de pelleterede blodplader, overføre røret til det anoxiske kabinet og pipette blodpladens dårlige plasma til et frisk 50 milliliterrør. Brug blodopsamlingsrørene til at kombinere de røde blodlegemer i et konisk 50 milliliterrør.Derefter tilsættes 0,9% natriumchloridopløsning, indtil det samlede volumen når 44 milliliter, og der tilsættes seks milliliter 6% dextran. Inverter røret 10 til 20 gange for forsigtigt at blande blod- og dextranblandingen og lade røret sedimentere i mindst 30 minutter. Mens røret sedimenter, forberede en Percoll gradient ved at tilføje 4,2 milliliter Percoll opløsning til 5,8 milliliter plasma, og invertere røret til at blande.Dernæst indsamle neutrofil indeholder øverste brøkdel af dextran, passe på ikke at pipette røde blodlegemer. Stram skruehætten, fjern dextranrøret fra det anoxiske skab, og centrifuge røret ved 300 g i 10 minutter. Pas på ikke at forstyrre de pelleterede celler, læg røret tilbage i det anoxiske kabinet.Fjern derefter væsken ved at pipettere. Forsigtigt resuspend pellet i en milliliter plasma. Tilsæt langsomt de resuspenderede celler til toppen af Percoll-løsningen.Fjern forsigtigt Percoll-opløsningsrøret fra det anoxiske kabinet og centrifugeres ved 800 g i 20 minutter for at adskille PBFC'er fra neutrofiler. Derefter forberedes 14 milliliter vaskebufferopløsning i henhold til tekstprotokollen. Derefter placere Percoll røret i anoxiske kabinet.Brug en pipette til at fjerne Percoll og PBMCs og resuspend den neutroil, der indeholder pellet i en milliliter vask buffer løsning. Dernæst tilsættes 200 mikroliter af magnetiske perler til de opsbrugte celler. Bland og inkuber forsigtigt cellerne og perlerne i mindst 15 minutter.Derefter vaskes en skillesøjle to gange med to milliliter vaskebuffer. Mens du holder en ny, 15 milliliter konisk rør under kolonnen, langsomt pipette neutrofil røde blodlegemer blandingen gennem kolonnen. Flow-through fra kolonnen skal være overskyet og miste sin røde farve, bekræfter den totale adskillelse af neutrofiler fra de resterende røde blodlegemer.Tilføj to milliliter vaskebuffer til toppen af kolonnen og opsaml flow-through i samme rør. Ved afslutningen af denne vask, bør flow-through være klar. Bland forsigtigt opsamlingsrøret for at sikre, at neutrofilerne fordeles jævnt.Derefter indsamles 10 mikroliter af flow-through fra celletælling. Derefter fjernes neutrofilrøret fra det anoxiske skab og centrifuge røret ved 300 g i 20 minutter. Placer de sedimenterede neutrofiler tilbage i det anoxiske kabinet og fjern vaskebufferen via pipettering.Derefter resuspend pellet i plasma. Tilsæt en mikroliter RI-MUB40-Cy5 til en milliliter RPMI-1640 medium, uden phenol rød, og bland via pipettering. Derefter tilsættes en mikroliter af FMLP-opløsning og pipette til at blande.Overfør blandingen til en glasbundsmikroskopiskål. Derefter tilsættes et passende volumen af rensede celler til skålen. Endelig placere parabol i en omvendt fluorescerende mikroskop og start billedet erhvervelse.I denne protokol blev MUB40 brugt på levende celler til at detektere neutrofil sekretion ved simulering med FMLP. Dynamikken i frigivelsen af granulatindhold, herunder lactoferrin, kan visualiseres over tid, her i magenta. MUB40 kan desuden anvendes på faste neutrofiler.Her fagocytizing fluorescerende perler i en timet serie. Neutrofil granulat indhold er mærket her i blåt. Neutrofilerne viste lidt at ingen cellefarvning på tidlige tidspunkter, og gradvist steg RI-MUB40-mærkningen over tid, både på plasmamembranen og perleoverfladen.MUB40 kan også anvendes på faste inflammatoriske væv til at detektere neutrofiler specifikt, som vist i teksttallene. Vi beskriver her neutrofil rensning procedure, anvendes rutinemæssigt i vores laboratorium. Enhver anden metode er egnet, MUB40-Cy5 mærkning vil stadig arbejde.Neutrofier kan mærkes specifikt med MUB40 efter rensning eller direkte i betændt væv fra patienter eller dyremodeller. Flere MUB40 derivater er designet til at udvide dens anvendelse. Efter sin udvikling, denne teknik banede vejen for forsker inden for inflammation, at udforske neutrofil rekruttering og aktivering i inflammatoriske sygdomme.

Research

JoVE Journal

Biology

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET mikroskopi af Real-time overvågning af signalering begivenheder i levende celler Brug unimolekylær Biosensorer

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Brug af kemostater i Mikrobiel Systembiologi

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Levende Cell Imaging af Early Autophagy begivenheder: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Identifikation af protein-protein-interaktion websteder anvendelse af peptid Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Spatiotemporal Analyse af Cytokinetic Begivenheder i Fission Gær

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Karakterisering af Forkalkning Events med Live Optiske og elektronmikroskopi teknikker i en Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

Påvisning af østrogene ligander i produkter til personlig pleje ved hjælp af en gær østrogen skærm optimeret for Undergraduate undervisning laboratorium

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Opdage Lyme sygdom Spirochete, Borrelia Burgdorferi, i flåter bruge indlejrede PCR

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...