Name: the mub40 peptide for use in detecting neutrophil-mediated inflammation events
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) en ANR JCJC verleent (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).

Alle methoden die hier worden beschreven zijn herzien en goedgekeurd door de Franse organisaties CoRC (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) en CNIL (Commissie Nationale Informatique et Liberté).
1. vlekken neutrofielen in histopathologie weefsel met Fluorescently geëtiketteerd MUB40
<ol><li>Voor het verkrijgen van het weefsel voor histopathologisch onderzoek, vast weefsel/biopsie secties in een geschikt volume van 4% paraformaldehyde (PFA) ge...

<ol>
	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Nicol&#225;s-&#193;vila, J. &. #. 1. 9. 3. ;., Adrover, J. M., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+Homeostasis,+Immunity,+and+Cancer.">Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer.</a> Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).</li><li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer:+neutral+no+more.">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li><li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases.">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li><li>Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+redox+stress+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+disease.">Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. , (2018).</li><li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granules+of+the+human+neutrophilic+polymorphonuclear+leukocyte.">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li><li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils,+from+marrow+to+microbes.">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li><li>Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Ly6C/Ly6G-based+strategy+to+analyze+the+mouse+splenic+myeloid+compartment.">A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).</li><li>Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6G++neutrophils+are+dispensable+for+defense+against+systemic+Listeria+monocytogenes+infection.">Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection.</a> Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).</li><li>Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+mediate+antibody-induced+antitumor+effects+in+mice.">Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice.</a> Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).</li><li>Anderson, M. C., Chaze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUB40+Binds+to+Lactoferrin+and+Stands+as+a+Specific+Neutrophil+Marker.">MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker.</a> Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).</li><li>Co&#239;c, Y. -. M., Baleux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+specific+colonic+mucus+marker+using+a+human+commensal+bacterium+cell+surface+domain.">Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).</li><li>Roos, S., Jonsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-molecular-mass+cell-surface+protein+from+Lactobacillus+reuteri+1063+adheres+to+mucus+components.">A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components.</a> Microbiology. 148, 433-442 (2002).</li><li>Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+proteins+with+a+mucus-binding+domain+found+exclusively+in+lactic+acid+bacteria.">Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria.</a> Microbiology. 152, 273-280 (2006).</li><li>Mancardi, D. A., J&#246;nsson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+The+murine+high-affinity+IgG+receptor+Fc&#947;RIV+is+sufficient+for+autoantibody-induced+arthritis.">Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor Fc&#947;RIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis.</a> Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).</li><li>Walmsley, S. R., Print, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+neutrophil+survival+is+mediated+by+HIF-1alpha-dependent+NF-kappaB+activity.">Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).</li><li>Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoxia+and+glucose+supplementation+preserve+neutrophil+viability+and+function.">Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function.</a> Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).</li></ol>

Hier zijn twee tests beschreven waarin de MUB40 peptide wordt gebruikt om te studeren neutrofiele ontsteking en activering. Laten we zien hoe MUB40 kan onthullen neutrofielen presenteren in histopathologie secties of hun activeringsstatus met behulp van live gezuiverde neutrofielen weergeven. De kritische stappen voor het gebruik van MUB40 als een kleuring reagens zijn hetzelfde als met elke andere tl detectiemethode. Zorg moet men zich ervan vergewissen van de compatibiliteit van fluores...

Neutrofielen zijn een van de belangrijkste takken van het aangeboren immuunsysteem en routinematig worden gerekruteerd voor de sites van ontsteking rond het lichaam. De studie van neutrofielen heeft geschaad grotendeels door hun korte levensduur in vitro (minder dan 8 h) en beperkte detectieprogramma's onder basale omstandigheden of na activering. Hier presenteren we een uitgebreid geteste protocol voor de brede en specifieke detectie van zoogdieren neutrofielen in vaste/permeabel monsters. We bieden ook een gedetailleerd protocol voor live neutrofiele granulocyten met MUB40kleuring. Met behulp van de live neutrofiele kleuring protocol, kunnen het tijdstip en de locatie van neutrofiele activering worden gelokaliseerd. Dit protocol is ideaal voor onderzoekers die willen studeren neutrofiele activering of submodule release. Buiten hun antimicrobiële functies, worden neutrofielen nu gewaardeerd als immunomodulerende cellen betrokken bij een breed scala van ziekten en immuunrespons (aangeboren en adaptief)1,2. Neutrofielen zijn aanwezig in de meest opruiende weefsels, op hoge aantallen in geïnfecteerde weefsels, inflammatoire tumoren3, tijdens IBS en ziekte van Crohn flare-ups4, en op gebied van niet-infectieuze ontstekingen zoals de synovia van reumatoïde artritis ( RA) patiënten5. Neutrofielen bevatten vier klassen van pre-gevormde korrels genaamd azurophil (α), specifieke (β1), tertiaire (β2) korrels en secretoire blaasjes (γ)6. Na de migratie naar een inflammatoire site, aangeworven neutrofielen worden geactiveerd en opeenvolgend afscheiden submodule inhoud (samengesteld uit hechting, antimicrobiële verbindingen en immunomodulerende moleculen), die bevordert verder werving en draagt bij aan infectie resolutie (maar ook voor host weefselschade)7. Terwijl neutrofielen worden beschouwd als een kritiek aspect van aangeboren immuniteit, tot op heden er zijn paar detectie reagentia beschikbaar voor deze bestuderen, en nog minder dat kan worden gebruikt voor het beoordelen van de activeringsstatus van levende neutrofiele granulocyten.
Huidige methoden voor het opsporen van neutrofielen afhankelijk van monoklonale antilichamen tegen celoppervlak blootgestelde antigenen, zoals Ly - 6 G2 of eiwitten specifiek opgeslagen in neutrofiele korrels onder basale omstandigheden (bijvoorbeeld myeloperoxidase gegenereerd Lactoferrine). Voordelen van monoclonal antilichamen zijn hun sterke bindende, gevoeligheid en veelzijdigheid onder verschillende omstandigheden van de test. Er zijn echter ook verschillende nadelen aan het gebruik van monoklonale antilichamen en anti-Ly - 6G in het bijzonder. Deze nadelen zijn de specificiteit, zoals Ly - 6G is aanwezig op een meerderheid van myeloïde cellen in het beenmerg en op alle granulocyten met inbegrip van de eosinofielen; zo, neutrofielen van eosinofielen ontcijferen met deze markering vereist meer complexen benaderingen8. Een andere frequente afweging met monoklonale antilichamen is hun vaak beperkte host gastheerspecificiteit, waardoor vergelijking studies met meer dan één diersoort omvat moeilijk. Een derde nadeel van antilichaam detectiemethoden, vooral bij het gebruik van levende cellen of in vivo, is hun potentieel voor het verstoren van de functie cel of leiden tot cel activatie. Bijvoorbeeld, is de administratie van anti-Ly - 6G te muizen vaak toegepast op neutrofiele uitputting en voorbijgaande neutropenie9. Bovendien is gebleken dat antilichaam injectie neutrofiele antitumorale functie10kan stimuleren. Tot slot, de opsporing van antilichamen van neutrofielen niet onthullen de activeringsstatus van de cel.
We hebben een 40-amino acid peptide genaamd MUB40, die kan worden gebruikt in een aantal testen om label neutrofielen in vitro of in vivo voorwaarden evenals de activeringsstatus van levende neutrofielen11assay aangemerkt. MUB40 is afgeleid van de MUB7012, een domein van de Lactobacillus reuteri oppervlakte slijm-bindend-proteïne oorspronkelijk beschreven voor haar vermogen om te binden slijm13,14. MUB40 interageert met geglycosyleerde lactoferrine die aanwezig is bij hoge concentraties in neutrofiele-specifieke en tertiaire korrels. MUB40 kunt worden blootgesteld aan deze submodules standaard permeabilization stapsgewijs aanwezig in histopathologie of fluorescentie-activated cell sorting (FACS) protocollen voor robuuste kleuring van vaste neutrofiele granulocyten. Wanneer live neutrofielen in een geïnactiveerd staat worden gehouden, de MUB40 peptide is uitgesloten van de inhoud van de submodule en cellen doen geen positieve vlekken met de markering. Na activatie, kan MUB40 binden aan blootgestelde lactoferrine en leiden tot robuuste kleuring met de peptide. Dus, MUB-40 mag worden gebruikt om de activeringsstatus van gezuiverde neutrofiele granulocyten, waardoor het een aantrekkelijke marker om de besmettelijke proces te volgen. Het vermogen om te binden aan het leven van geactiveerde neutrofiele granulocyten kan ook MUB40 worden gebruikt als een instrument om te controleren op gebieden van neutrofiele ontsteking in levende dierlijke modellen (bijvoorbeeld een muis artritis model15). De protocollen in dit manuscript detail hoe fluorescently label MUB40 kunnen worden gebruikt om te onthullen van de neutrofielen in histologie weefsels en hoe de activering van levende gezuiverde neutrofielen in vitroassay.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="894">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">MUB40-Cy5</td>
			<td style="width:123px;">Benoit Marteyn</td>
			<td style="width:344px;">benoit.marteyn@pasteur.fr</td>
			<td style="width:167px;">Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RI-MUB40-Cy5</td>
			<td>Benoit Marteyn</td>
			<td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td>
			<td>Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Parformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">16005</td>
			<td>Fixative for histology</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Solution used to remove excess PFA</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td align="right">4583</td>
			<td>Used to freeze tissue before cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-Methylbutane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M32631</td>
			<td>Used to freeze tissue before cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">1.00974</td>
			<td>Used for dry ice bath to freeze tissue</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Leica Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1520</td>
			<td>Used to section tissues</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass microscopy slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-518-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cover slips</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>CG15CH</td>
			<td>Hi precision coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dako pen&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td>Used to prevent liquid loss during tissue staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">47036</td>
			<td>Used to permeabilize cells for IF staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">10236276001</td>
			<td>Stains DNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa fluor 488 Phalloidin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Binds actin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prolong Gold antifade Mountant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Prolongs IF signal and resistance to photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluorescent microscope</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Used to image IF slides</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anoxic Cabinet</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Used for the purification of live inactivated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Chloride NaCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Washing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MACS BSA buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>Washing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4937</td>
			<td>Gradient for neutrophil purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD235a glycophorin magnetic microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-501</td>
			<td>Used to remove contaminating RBCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used in the removal of RBCs from neutrophils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 without Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8755</td>
			<td>Used for neutrophil assays</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mub40 peptide for use in detecting neutrophil-mediated inflammation events

Wij bieden hier een protocol met betrekking tot het gebruik van MUB40, een gesynthetiseerde peptide met de mogelijkheid om het binden van geglycosyleerde lactoferrine opgeslagen in hoge concentraties in specifieke en tertiaire korrels van neutrofiele granulocyten. De gegevens van dit protocol hoe MUB40 geconjugeerd rechtstreeks met een fluorophore kunnen worden gebruikt om vlek neutrofielen in vaste/permeabel weefsels zo goed hoe dit kan worden gebruikt in het leven-cel imaging om assay voor neutrofiele activering en ambtshalve korreling. Neutrofiele detectiemethoden zijn beperkt tot soortspecifieke monoclonal antilichamen, die niet altijd geschikt voor bepaalde toepassingen zijn. MUB40 doet niet doordringen in het celmembraan en is dus uitgesloten van lactoferrine opgeslagen in niet-geactiveerd/niet-permeabel neutrofiele granulocyten. MUB40 heeft het extra voordeel van de erkenning van lactoferrine uit een brede gastheer, waardoor het vooral handig voor het vergelijken van resultaten in studies meerdere onderzoeksmodellen, waarbij het aantal dubbele reagentia te verminderen, en vereenvoudiging van de protocollen via-voor-stapmodus kleuring.

Resultaten van de MUB40-gebeitst weefsels van een histopathologisch onderzoek dia's onthullen meestal afzonderlijke cellen verspreid over het weefsel. MUB40 vlekken lactoferrine, die aanwezig is in neutrofiele korrels en verzuilde. Dus meestal gezien punctate kleuring of verschillende grote gescheiden gebieden van signaal afkomstig zijn uit afzonderlijke neutrofiele granulocyten (Figuur 1). Het is handig om een tweede cel markering zoals...

Watch this Scientific Journal Video about The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events at JoVE.com

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

Hier presenteren we een protocol voor het detecteren van de aanwezigheid van neutrofielen in secties van de histologie vaste/permeabel en beoordelen van de activeringsstatus van levende gezuiverde neutrofielen. In het bijzonder de MUB40 peptide gebonden Lactoferrine in submodules neutrofiele-specifieke en tertiaire aanwezig. Blootstelling van de submodule inhoud via permeabilization of neutrofiele activering zorgt voor de markering van de neutrofielen.

De MUB40 Peptide voor gebruik bij de opsporing van ontsteking neutrofiele-gemedieerde gebeurtenissen

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

MUB40 is een nieuwe neutrofiele marker, die zich bindt aan lactoferrine en maakt een specifieke detectie in de menselijke en alle zoogdier weefsel monster tot nu toe getest. Het labelen van neutrofielen met MUB40 is eenvoudig, snel en specifiek. Het wordt nu veel gebruikt in ons lab en de implicatie van deze techniek strekt zich uit tot de diagnose van ontstekingsziekten.Om te beginnen, oplossingen een, twee en drie volgens het tekstprotocol, en plaats ze in een anoxische kast 's nachts. Vervolgens centrifugeren de buizen van verzameld bloed op 650 g gedurende 20 minuten om de cellen te scheiden van de plasma-fractie. Zonder het gescheiden bloed te verstoren, breng je de buizen over naar de anoxische kast en breng je de plasmafracties over op een conische buis van 50 milliliter.Verwijder hierna de buis van plasma uit de anoxische kast en vercentrifuge het gedurende 20 minuten op 2900 g. Zorg ervoor dat de pelleted bloedplaatjes niet verstoren, breng de buis naar de anoxische kast en pipette de bloedplaatjes slecht plasma in een verse 50 milliliter buis. Met behulp van de bloedafname buizen, combineren de rode bloedcellen in een conische 50 milliliter buis.Voeg vervolgens 0,9% natriumchlorideoplossing toe tot het totale volume 44 milliliter bereikt en voeg zes milliliter van 6% dextran toe. Keer de buis 10 tot 20 keer om het bloed en het dextranmengsel voorzichtig te mengen en laat de buis minstens 30 minuten sedimenteren. Terwijl de buis sedimenten, bereiden een Percoll gradiënt door het toevoegen van 4,2 milliliter Percoll oplossing tot 5,8 milliliter plasma, en omkeren de buis te mengen.Verzamel vervolgens de neutrofiele met de bovenste fractie van de dextran, waarbij u ervoor zorgt dat ze geen rode bloedcellen pipette. Draai de schroefdop aan, haal de dextranbuis uit de anoxische kast en vercentrifuge de buis gedurende 10 minuten op 300 g. Zorg ervoor dat de gepelde cellen niet worden verstoord, plaats de buis terug in de anoxische kast.Verwijder vervolgens de vloeistof door te pipetten. Voorzichtig resuspend de pellet in een milliliter plasma. Voeg langzaam de geresuspendeerde cellen toe aan de toppen van de Percoll-oplossing.Verwijder de Percoll-oplossingsbuis voorzichtig uit de anoxische kast en vercentrifugeren 20 minuten lang met 800 g om PBMCs van neutrofielen te scheiden. Bereid vervolgens 14 milliliter wasbufferoplossing volgens het tekstprotocol. Plaats vervolgens de Percoll buis in de anoxische kast.Gebruik een pipet om de Percoll en PBMCs te verwijderen en de neutrofiele bevattende pellet opnieuw op te plaatsen in één milliliter wasbufferoplossing. Voeg vervolgens 200 microliter magnetische kralen toe aan de geresuspendeerde cellen. Meng en ontcubeer de cellen en kralen gedurende ten minste 15 minuten.Was hierna twee maal een scheidingskolom, met twee milliliter wasbuffer. Terwijl u een nieuwe, 15 milliliter conische buis onder de kolom, langzaam pipette de neutrophil rode bloedcel mengsel door de kolom. De doorstroom van de kolom moet troebel zijn en zijn rode kleur verliezen, wat de totale scheiding van neutrofielen van de resterende rode bloedcellen bevestigt.Voeg twee milliliter wasbuffer toe aan de bovenkant van de kolom en verzamel de doorstroom in dezelfde buis. Tegen het einde van deze wasbeurt moet de doorstroming duidelijk zijn. Meng voorzichtig de opvangbuis om ervoor te zorgen dat de neutrofielen gelijkmatig worden verdeeld.Vervolgens verzamelde 10 microliter van de flow-through van celtelling. Verwijder hierna de neutrofiele buis uit de anoxische kast en vercentrifuge de buis gedurende 20 minuten op 300 g. Plaats de gesedimenteerde neutrofielen terug in de anoxische kast en verwijder de wasbuffer via pipetting.Dan, resuspend de pellet in plasma. Voeg een microliter RI-MUB40-Cy5 toe aan een milliliter RPMI-1640 medium, zonder fenolrood, en meng via pipetting. Voeg vervolgens een microliter FMLP-oplossing en pipet toe om te mengen.Breng het mengsel naar een glazen bodem microscopie schotel. Voeg vervolgens een passend volume gezuiverde cellen toe aan de schotel. Tot slot, plaats het gerecht in een omgekeerde fluorescerende microscoop en start beeldverwerving.In dit protocol werd MUB40 gebruikt op levende cellen om neutrofiele afscheiding te detecteren bij simulatie met FMLP. De dynamiek van de afgifte van korrelgehalte, met inbegrip van lactoferrine, kan worden gevisualiseerd na verloop van tijd, hier in magenta. MUB40 kan bovendien worden gebruikt op vaste neutrofielen.Hier, fagocytiserende fluorescerende kralen in een getimede serie. De inhoud van Neutrophil granulaat is hier in het blauw gelabeld. De neutrofielen toonden weinig tot geen cel vlekken op vroege punten en geleidelijk, RI-MUB40 etikettering toegenomen na verloop van tijd, zowel op het plasmamembraan en kraal oppervlak.MUB40 kan ook worden gebruikt op vaste ontstekingsweefsels om neutrofielen specifiek te detecteren, zoals blijkt uit de tekstcijfers. We beschrijven hier de neutrofiele zuiveringsprocedure, routinematig toegepast in ons lab. Elke andere methode is geschikt, MUB40-Cy5 etikettering zal nog steeds werken.Neutrophil kan specifiek worden gelabeld met MUB40 na zuivering, of direct in ontstoken weefsel van patiënten of dierlijke modellen. Verschillende MUB40 derivaten zijn ontworpen om het gebruik ervan te verbreden. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van ontsteking, om neutrofiele rekrutering en activering bij ontstekingsziekten te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Biology

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

Het gebruik van biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET microscopie voor Real-time monitoring van Signalering Evenementen in levende cellen met behulp Unimoleculaire Biosensoren

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Het gebruik van chemostaten in Microbiële Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Live cell imaging van Vroege Autophagy Evenementen: Omegasomes en Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Het identificeren van eiwit-eiwit interacties sites maken met Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Spatiotemporele analyse van Cytokinetic Evenementen in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Karakterisering van calcificatie Events met Live optische en elektronenmicroscopie technieken in een Marine tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

Opsporen van oestrogene liganden in verzorgingsproducten met behulp van een gist oestrogeen scherm geoptimaliseerd voor het Undergraduate Onderwijs laboratorium

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Opsporen van de ziekte van Lyme-spirocheet, Borrelia Burgdorferi, in teken met behulp van genestelde PCR

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...