Name: the mub40 peptide for use in detecting neutrophil-mediated inflammation events
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) und ANR JCJC gewährt (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).

Alle hier beschriebene Methoden wurden überprüft und genehmigt von den französischen Organisationen CoRC (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) und CNIL (Kommission Nationale Informatique et Liberté).
1. Neutrophile im Histopathologie Gewebe mit Gewebekulturen Färbung gekennzeichnet MUB40
<ol><li>Um das Gewebe für die Histopathologie zu erhalten, befestigen Sie Gewebeentnahme/Abschnitte in einem geeigneten Volumen von 4 % Paraformaldehyd (...

<ol>
	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Nicol&#225;s-&#193;vila, J. &. #. 1. 9. 3. ;., Adrover, J. M., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+Homeostasis,+Immunity,+and+Cancer.">Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer.</a> Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).</li><li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer:+neutral+no+more.">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li><li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases.">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li><li>Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+redox+stress+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+disease.">Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. , (2018).</li><li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granules+of+the+human+neutrophilic+polymorphonuclear+leukocyte.">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li><li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils,+from+marrow+to+microbes.">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li><li>Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Ly6C/Ly6G-based+strategy+to+analyze+the+mouse+splenic+myeloid+compartment.">A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).</li><li>Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6G++neutrophils+are+dispensable+for+defense+against+systemic+Listeria+monocytogenes+infection.">Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection.</a> Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).</li><li>Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+mediate+antibody-induced+antitumor+effects+in+mice.">Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice.</a> Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).</li><li>Anderson, M. C., Chaze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUB40+Binds+to+Lactoferrin+and+Stands+as+a+Specific+Neutrophil+Marker.">MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker.</a> Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).</li><li>Co&#239;c, Y. -. M., Baleux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+specific+colonic+mucus+marker+using+a+human+commensal+bacterium+cell+surface+domain.">Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).</li><li>Roos, S., Jonsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-molecular-mass+cell-surface+protein+from+Lactobacillus+reuteri+1063+adheres+to+mucus+components.">A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components.</a> Microbiology. 148, 433-442 (2002).</li><li>Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+proteins+with+a+mucus-binding+domain+found+exclusively+in+lactic+acid+bacteria.">Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria.</a> Microbiology. 152, 273-280 (2006).</li><li>Mancardi, D. A., J&#246;nsson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+The+murine+high-affinity+IgG+receptor+Fc&#947;RIV+is+sufficient+for+autoantibody-induced+arthritis.">Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor Fc&#947;RIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis.</a> Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).</li><li>Walmsley, S. R., Print, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+neutrophil+survival+is+mediated+by+HIF-1alpha-dependent+NF-kappaB+activity.">Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).</li><li>Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoxia+and+glucose+supplementation+preserve+neutrophil+viability+and+function.">Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function.</a> Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).</li></ol>

Hier sind zwei Tests beschrieben, in denen das MUB40 Peptid verwendet wird, um Neutrophilenzahl Entzündung und Aktivierung zu studieren. Wir zeigen, wie MUB40 offenbaren kann, Neutrophile in Histopathologie Abschnitte oder zeigen ihren Aktivierungsstatus mit live gereinigten Neutrophilen. Die entscheidenden Schritte für die Verwendung von MUB40 als Färbung Reagens sind dasselbe wie mit keiner anderen Methode der Fluoreszenz-Detektion. Vorsicht ist geboten, damit Kompatibilität von flu...

Neutrophile sind eines der primären Waffen des angeborenen Immunsystems und werden routinemäßig zu den Stätten der Entzündung um den Körper angeworben. Die Studie der Neutrophilen wurde weitgehend beeinträchtigt durch ihre kurze Lebensdauer in Vitro (weniger als 8 h) und begrenzte Erkennungs-Tools unter basalen Bedingungen oder nach der Aktivierung. Hier präsentieren wir Ihnen eine erprobte Protokoll für die Breite und spezifische Erkennung von Säugetier-Neutrophils in feste/permeabilized Proben. Wir bieten auch ein detailliertes Protokoll zum Beizen live Neutrophilen mit MUB40. Mit dem live Neutrophilenzahl Färbung Protokoll, können den Zeitpunkt und Ort der Neutrophilen Aktivierung geortet werden. Dieses Protokoll ist ideal für Forscher, die Neutrophilen Aktivierung oder Granulat Release studieren möchten. Jenseits ihrer antimikrobiellen Funktionen werden Neutrophile jetzt als immunmodulatorische Zellen in einer Vielzahl von Krankheiten und Immunreaktionen (angeborene und adaptive)1,2geschätzt. Neutrophile sind im meisten entzündlichen Gewebe, bei hohen Stückzahlen im infizierten Gewebe, entzündliche Tumoren3, während IBS und Morbus Crohn Schübe4, und in Bereichen der nicht-infektiöse Entzündung wie die Synovia der rheumatoiden Arthritis ( RA) Patienten5. Neutrophilen enthalten vier Klassen von vorgeformten Körnchen namens Azurophil (α), spezifische (β1), Tertiär (β2) Granulat und sekretorischen Vesikel (γ)6. Bei der Migration zu einer entzündlichen Site rekrutierte Neutrophilen werden aktiviert und sequenziell sezernieren Granulat Inhalte (bestehend aus Adhäsion, antimikrobielle Substanzen und immunmodulatorischen Molekülen), die fördert weitere Rekrutierung und trägt zur Infektion Auflösung (aber auch zu Host Gewebeschäden)7. Während Neutrophile gelten ein kritischer Aspekt der angeborenen Immunität, bisher gibt es sind einige Nachweisreagenzen zur Verfügung, um sie zu studieren, und noch weniger, die kann verwendet werden, um den Aktivierungsstatus der lebenden Neutrophilen zu beurteilen.
Aktuelle Methoden zur Erkennung von neutrophilen Granulozyten verlassen sich auf monoklonale Antikörper gegen die Zelloberfläche exponierten Antigene, wie Ly - 6 G2 oder Proteine im einzelnen gespeichert in Neutrophilen Granulat unter basalen Bedingungen (z. B. Myeloperoxidase erzeugt Lactoferrin). Vorteile von monoklonalen Antikörpern sind ihre starke Bindung, Empfindlichkeit und Vielseitigkeit unter verschiedenen Assay-Bedingungen. Es gibt jedoch einige Nachteile mit monoklonalen Antikörpern und Anti-Ly - 6G im besonderen. Diese Nachteile sind die Spezifität, Ly - 6G auf der Mehrzahl der myeloischen Zellen im Knochenmark und auf alle einschließlich der eosinophilen Granulozyten vorliegt; Entschlüsselung von Neutrophilen aus eosinophilen mit dieser Marker erfordert daher mehr komplexe Ansätze8. Eine weitere häufige Kompromiss mit monoklonalen Antikörpern ist ihre oft begrenzte Spezifität Wirtsspektrum, Vergleichsstudien mit mehreren Tierarten erschwert. Ein dritter Nachteil der Antikörper Abfragung Methoden, insbesondere bei Verwendung von lebenden Zellen oder in vivo, ist ihr Potenzial Zellfunktionen zu stören oder zu Zellaktivierung führen. Beispielsweise wird die Verwaltung von Anti-Ly - 6 G, Mäuse häufig auf Neutrophilen Erschöpfung und vorübergehende Neutropenie9angewendet. Zudem ist nachgewiesen, dass Antikörper Injektion Neutrophilenzahl Antitumor-Funktion10stimulieren kann. Schließlich verrät Antikörpernachweis der Neutrophilen nicht den Aktivierungsstatus der Zelle.
Wir haben festgestellt, dass eine 40-amino Acid Peptid namens MUB40, die in einer Reihe von Tests zu beschriften Neutrophilen in Vitro oder in Vivo Bedingungen sowie die Aktivierungsstatus des live Neutrophilen11assay verwendet werden können. MUB40 leitet sich vom MUB7012, eine Domäne der Lactobacillus Reuteri Oberfläche Schleim-Bindeprotein ursprünglich für seine Fähigkeit, Schleim13,14binden beschrieben. MUB40 interagiert mit glykosylierten Lactoferrin, das in hohen Konzentrationen in Neutrophilen-spezifischen und tertiären Granulat vorhanden ist. MUB40 können diese Module durch standard Permeabilisierung Schritte in Histopathologie oder Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) Protokolle für robuste Färbung der festen Neutrophilen ausgesetzt werden. Wenn live Neutrophilen in einem inaktivierten Zustand gehalten werden, das MUB40 Peptid ist aus dem Granulat Inhalt ausgeschlossen, und Zellen keine Flecken, positiv mit dem Marker. Nach der Aktivierung können MUB40 binden an exponierten Lactoferrin und zu robusten Färbungen mit das Peptid führen. So kann MUB40 verwendet werden, um den Aktivierungsstatus der gereinigten Neutrophilen, so dass es einen attraktive Marker der infektiösen Prozess folgen bestimmen. Auch Möglichkeit, binden an aktivierte Neutrophilen Leben MUB40 als Werkzeug verwendet werden, um Bereiche der Neutrophilen Entzündung in live Tiermodellen (z. B. einer Maus Arthritis Modell15) zu erkennen. Die Protokolle in diesem Manuskript Detail wie Eindringmittel beschriftet MUB40 einsetzbar, Neutrophile in Histologie Gewebe und wie man die Aktivierung des live gereinigten Neutrophilen in-vitro-Tests zu offenbaren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="894">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">MUB40-Cy5</td>
			<td style="width:123px;">Benoit Marteyn</td>
			<td style="width:344px;">benoit.marteyn@pasteur.fr</td>
			<td style="width:167px;">Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RI-MUB40-Cy5</td>
			<td>Benoit Marteyn</td>
			<td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td>
			<td>Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Parformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">16005</td>
			<td>Fixative for histology</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Solution used to remove excess PFA</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td align="right">4583</td>
			<td>Used to freeze tissue before cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-Methylbutane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M32631</td>
			<td>Used to freeze tissue before cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">1.00974</td>
			<td>Used for dry ice bath to freeze tissue</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Leica Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1520</td>
			<td>Used to section tissues</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass microscopy slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-518-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cover slips</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>CG15CH</td>
			<td>Hi precision coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dako pen&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td>Used to prevent liquid loss during tissue staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">47036</td>
			<td>Used to permeabilize cells for IF staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">10236276001</td>
			<td>Stains DNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa fluor 488 Phalloidin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Binds actin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prolong Gold antifade Mountant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Prolongs IF signal and resistance to photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluorescent microscope</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Used to image IF slides</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anoxic Cabinet</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Used for the purification of live inactivated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Chloride NaCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Washing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MACS BSA buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>Washing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4937</td>
			<td>Gradient for neutrophil purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD235a glycophorin magnetic microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-501</td>
			<td>Used to remove contaminating RBCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used in the removal of RBCs from neutrophils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 without Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8755</td>
			<td>Used for neutrophil assays</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mub40 peptide for use in detecting neutrophil-mediated inflammation events

Hier bieten wir ein Protokoll unter Verwendung von MUB40, ein synthetisiertes Peptid mit der Fähigkeit, glykosylierten Lactoferrin gespeichert in hohen Konzentrationen in bestimmten und tertiäre Körnchen der Neutrophilen zu binden. Dieses Protokolldetails wie MUB40 direkt an ein Fluorophor konjugiert einsetzbar, Neutrophile in feste/permeabilized Geweben sowie zu beflecken, wie Hiermit können live Cell Imaging für die Neutrophilen Aktivierung und de-Granulierung assay. Neutrophilenzahl Nachweismethoden beschränken sich auf Spezies-spezifische monoklonale Antikörper, die nicht immer für bestimmte Anwendungen geeignet sind. MUB40 die Zellmembran nicht durchdringen und ist somit von Lactoferrin gespeichert in nicht-aktiviert/nicht-permeabilized Neutrophilen ausgeschlossen. MUB40 hat den zusätzlichen Vorteil erkennen Lactoferrin aus ein breites Wirtsspektrum, macht es besonders nützlich für den Vergleich der Ergebnisse in Studien mit mehreren Forschungsmodelle, Verringerung der Zahl der doppelte Reagenzien und Vereinfachung der Protokolle durch ein-Schritt-Färbung.

Ergebnisse der MUB40-gefärbten Gewebe von Histopathology Dias zeigen in der Regel einzelne Zellen in das Gewebe verteilt. MUB40 Flecken Lactoferrin, die ist in Neutrophilen Granulat und Abteilen. So gesehen, in der Regel punctata beflecken oder mehrere große getrennte Bereiche des Signals aus einzelnen Neutrophilen (Abbildung 1) kommen. Es ist hilfreich, fügen eine zweite Zelle Markierung wie DAPI zu helfen, das MUB40 Signa...

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The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um das Vorhandensein der Neutrophilen behoben/permeabilized Histologie Abschnitte erkennen und bewerten den Aktivierungsstatus der live gereinigten Neutrophilen. Vor allem bindet MUB40 Peptid Lactoferrin in Neutrophilen-spezifischen und tertiären Granulat vorhanden. Exposition der Granulat-Inhalte durch Permeabilisierung oder Neutrophilen Aktivierung ermöglicht die Kennzeichnung von Neutrophilen.

Das MUB40 Peptid für den Einsatz bei der Aufdeckung von Neutrophilen-vermittelte Entzündung Veranstaltungen

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

MUB40 ist ein neuartiger Neutrophiler Marker, der an Lactoferrin bindet und einen spezifischen Nachweis in menschlichen und allen bisher getesteten Säugetiergewebeproben ermöglicht. Die Etikettierung von Neutrophilen mit MUB40 ist einfach, schnell und spezifisch. Es ist jetzt weit verbreitet in unserem Labor verwendet und die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf die Diagnose von entzündlichen Erkrankungen.Um zu beginnen, bereiten Sie Lösungen eins, zwei und drei nach dem Textprotokoll, und legen Sie sie in einem anoxischen Schrank über Nacht. Zentrifugieren Sie dann die Röhrchen des gesammelten Blutes bei 650 g für 20 Minuten, um die Zellen von der Plasmafraktion zu trennen. Ohne das abgetrennte Blut zu stören, übertragen Sie die Röhrchen in den anoxischen Schrank und übertragen Sie die Plasmafraktionen in eine 50 Milliliter konische Röhre.Danach entfernen Sie die Plasmaröhre aus dem anoxischen Schrank und zentrieren Sie sie 20 Minuten lang bei 2900 g. Achten Sie darauf, die pelletierten Blutplättchen nicht zu stören, übertragen Sie das Rohr in den anoxischen Schrank und Pipette der Thrombozyten arme Plasma in eine frische 50 Milliliter Rohr. Kombinieren Sie die roten Blutkörperchen mit den Blutentnahmeröhrchen in einer konischen 50-Milliliter-Röhre.Dann fügen Sie 0,9% Natriumchlorid-Lösung, bis das Gesamtvolumen erreicht 44 Milliliter, und fügen Sie sechs Milliliter von 6%dextran. Invertieren Sie die Röhre 10 bis 20 Mal, um das Blut und die Dextran-Mischung sanft zu mischen, und lassen Sie das Rohr für mindestens 30 Minuten sedimentieren. Während die Rohrsedimente, bereiten Sie einen Percoll-Gradienten, indem Sie 4,2 Milliliter Percoll-Lösung zu 5,8 Milliliter Plasma hinzufügen, und invertieren Sie die Röhre zu mischen.Als nächstes sammeln Sie die Neutrophilen mit topem Bruch des Dextrans, wobei Sie darauf achten, keine roten Blutkörperchen zu pipette. Ziehen Sie den Schraubverschluss fest, entfernen Sie das Dextran-Rohr aus dem Anoxic-Schrank, und zentrieren Sie das Rohr bei 300 g für 10 Minuten. Achten Sie darauf, die pelletierten Zellen nicht zu stören, legen Sie das Rohr wieder in den anoxischen Schrank.Entfernen Sie dann die Flüssigkeit durch Pipettieren. Das Pellet vorsichtig in einem Milliliter Plasma wieder aufhängen. Fügen Sie die resuspendierten Zellen langsam an die Oberkörper der Percoll-Lösung an.Entfernen Sie das Percoll-Lösungsrohr vorsichtig aus dem anoxischen Schrank und zentrifugieren Sie es 20 Minuten lang bei 800 g, um PBMCs von Neutrophilen zu trennen. Als nächstes bereiten Sie 14 Milliliter Waschpufferlösung nach dem Textprotokoll vor. Legen Sie dann das Percoll-Rohr in den anoxischen Schrank.Verwenden Sie eine Pipette, um die Percoll- und PBMCs zu entfernen und das neutrophil haltige Pellet in einem Milliliter Waschpufferlösung wieder aufzuhängen. Als nächstes fügen Sie den resuspendierten Zellen 200 Mikroliter Magnetperlen hinzu. Die Zellen und Perlen mindestens 15 Minuten lang sanft mischen und bebrüten.Danach eine Trennsäule zweimal mit zwei MilliliterWaschpuffer waschen. Während Sie eine neue, 15 Milliliter konische Röhre unter der Säule halten, pipetten Sie langsam die neutrophile rote Blutkörperchenmischung durch die Säule. Der Durchfluss aus der Säule sollte trüb sein und seine rote Farbe verlieren, was die vollständige Trennung von Neutrophilen von den verbleibenden roten Blutkörperchen bestätigt.Fügen Sie zwei Milliliter Waschpuffer an den oberen Rand der Säule und sammeln Sie den Durchfluss in der gleichen Röhre. Am Ende dieser Wäsche sollte der Durchfluss klar sein. Mischen Sie das Sammelrohr vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Neutrophilen gleichmäßig verteilt sind.Dann sammelten 10 Mikroliter des Durchflusses aus der Zellzählung. Danach entfernen Sie das Neutrophilenrohr aus dem anoxischen Schrank und zentrieren Sie das Rohr bei 300 g für 20 Minuten. Legen Sie die sedimentierten Neutrophilen wieder in den anoxischen Schrank und entfernen Sie den Waschpuffer durch Pipetten.Setzen Sie dann das Pellet im Plasma wieder aus. Fügen Sie einen Mikroliter RI-MUB40-Cy5 zu einem Milliliter RPMI-1640 Medium ohne Phenolrot hinzu und mischen Sie sie über Pipettieren. Fügen Sie dann einen Mikroliter FMLP-Lösung und Pipette zum Mischen hinzu.Übertragen Sie die Mischung auf eine Glasbodenmikroskopieschale. Dann fügen Sie ein entsprechendes Volumen von gereinigten Zellen auf die Schale. Schließlich legen Sie die Schale in ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop und starten Sie die Bildaufnahme.In diesem Protokoll wurde MUB40 auf lebenden Zellen verwendet, um neutrophile Sekretion bei simulation mit FMLP zu erkennen. Die Dynamik der Freisetzung von Granulatgehalt, einschließlich Lactoferrin, kann im Laufe der Zeit visualisiert werden, hier in Magenta. MUB40 kann zusätzlich bei festen Neutrophilen angewendet werden.Hier phagozytisieren fluoreszierende Perlen in einer zeitgezeitierten Serie. Der Inhalt des Neutrophilen Granulats ist hier blau beschriftet. Die Neutrophile zeigten wenig bis gar keine Zellfärbung zu frühen Zeitpunkten und allmählich nahm die RI-MUB40-Etikettierung im Laufe der Zeit zu, sowohl auf der Plasmamembran als auch auf der Perlenoberfläche.MUB40 kann auch auf festen entzündlichen Geweben verwendet werden, um Neutrophile gezielt zu erkennen, wie in den Textabbildungen gezeigt. Wir beschreiben hier das Neutrophilenreinigungsverfahren, das routinemäßig in unserem Labor angewendet wird. Jede andere Methode ist geeignet, MUB40-Cy5 Etikettierung wird immer noch funktionieren.Neutrophil kann nach der Reinigung spezifisch mit MUB40 gekennzeichnet werden oder direkt in entzündetem Gewebe von Patienten oder Tiermodellen. Mehrere MUB40-Derivate wurden entwickelt, um seine Verwendung zu erweitern. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Entzündung, um neutrophile Rekrutierung und Aktivierung bei entzündlichen Erkrankungen zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Biology

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

Der Einsatz von Biofeedback in der klinischen Virtual Reality: Die INTREPID Projekt

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Forschung

Biologie

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Der Einsatz von Chemostate in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Ermittlung von Protein-Protein-Interaktionsstellen unter Verwendung von Peptid-Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Räumlich-zeitliche Analyse von zytokinetischen Events in Spalthefe

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Charakterisierung von Verkalkungen Events Verwendung von Live-optische und Elektronenmikroskopie-Techniken in einem Marine-Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

Nachweis Estrogenic Liganden in Körperpflege-Produkte mit einer Hefe Östrogen Bildschirm optimiert für Undergraduate Teaching Labor

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Das Lyme Krankheit Spirochete, Borrelia Burgdorferiin Zecken mit verschachtelten PCR zu erkennen

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...