Name: the mub40 peptide for use in detecting neutrophil-mediated inflammation events
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events at JoVE.com

इस काम के शौकीनों लौरेट Fugain (वामो-2015-15) (B.S.M.) और ANR JCJC पलाश (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.) द्वारा समर्थित किया गया था ।

यहां वर्णित सभी तरीकों की समीक्षा की गई और फ्रांसीसी संगठनों CoRC (Comité de सभ्य Clinique), CPP (Comité de protection des Personnes), और CNIL (आयोग के राष्ट्रीयकरण Informatique एट Liberté) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
1. Histopathology ऊतक में न्यूट्रोफिल क?...

<ol>
	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Nicol&#225;s-&#193;vila, J. &. #. 1. 9. 3. ;., Adrover, J. M., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+Homeostasis,+Immunity,+and+Cancer.">Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer.</a> Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).</li><li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer:+neutral+no+more.">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li><li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases.">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li><li>Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+redox+stress+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+disease.">Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. , (2018).</li><li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granules+of+the+human+neutrophilic+polymorphonuclear+leukocyte.">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li><li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils,+from+marrow+to+microbes.">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li><li>Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Ly6C/Ly6G-based+strategy+to+analyze+the+mouse+splenic+myeloid+compartment.">A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).</li><li>Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6G++neutrophils+are+dispensable+for+defense+against+systemic+Listeria+monocytogenes+infection.">Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection.</a> Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).</li><li>Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+mediate+antibody-induced+antitumor+effects+in+mice.">Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice.</a> Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).</li><li>Anderson, M. C., Chaze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUB40+Binds+to+Lactoferrin+and+Stands+as+a+Specific+Neutrophil+Marker.">MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker.</a> Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).</li><li>Co&#239;c, Y. -. M., Baleux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+specific+colonic+mucus+marker+using+a+human+commensal+bacterium+cell+surface+domain.">Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).</li><li>Roos, S., Jonsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-molecular-mass+cell-surface+protein+from+Lactobacillus+reuteri+1063+adheres+to+mucus+components.">A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components.</a> Microbiology. 148, 433-442 (2002).</li><li>Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+proteins+with+a+mucus-binding+domain+found+exclusively+in+lactic+acid+bacteria.">Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria.</a> Microbiology. 152, 273-280 (2006).</li><li>Mancardi, D. A., J&#246;nsson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+The+murine+high-affinity+IgG+receptor+Fc&#947;RIV+is+sufficient+for+autoantibody-induced+arthritis.">Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor Fc&#947;RIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis.</a> Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).</li><li>Walmsley, S. R., Print, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+neutrophil+survival+is+mediated+by+HIF-1alpha-dependent+NF-kappaB+activity.">Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).</li><li>Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoxia+and+glucose+supplementation+preserve+neutrophil+viability+and+function.">Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function.</a> Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).</li></ol>

यहां, दो परख वर्णित है जिसमें MUB४० पेप्टाइड न्युट्रोफिल सूजन और सक्रियण अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हम बताएंगे कि कैसे MUB४० histopathology वर्गों में मौजूद न्यूट्रोफिल प्रकट कर सकते हैं या उन...

न्यूट्रोफिल जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के प्राथमिक हथियारों में से एक है और नियमित रूप से शरीर के आसपास सूजन की साइटों के लिए भर्ती कर रहे हैं । न्यूट्रोफिल का अध्ययन काफी हद तक इन विट्रो (8 ज से कम) और बेसल शर्तों के तहत सीमित पता लगाने के उपकरणों के द्वारा या सक्रियण के बाद से ख़राब किया गया है । यहां, हम निश्चित/permeabilized नमूनों में स्तनधारी न्यूट्रोफिल का व्यापक और विशिष्ट पता लगाने के लिए एक अच्छी तरह से परीक्षण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम भी MUB४०के साथ लाइव न्यूट्रोफिल धुंधला के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । लाइव न्युट्रोफिल दाग प्रोटोकॉल का उपयोग करना, समय और न्युट्रोफिल सक्रियण के स्थान को इंगित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं जो न्युट्रोफिल सक्रियकरण या दाना रिहाई का अध्ययन करना चाहते है के लिए आदर्श है । उनके रोगाणुरोधी कार्यों के अलावा, न्यूट्रोफिल अब रोगों और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में शामिल इम्यूनोमॉड्यूलेटरी कोशिकाओं के रूप में सराहना कर रहे हैं (सहज और अनुकूली)1,2. न्यूट्रोफिल सबसे भड़काऊ ऊतकों में मौजूद हैं, संक्रमित ऊतकों में उच्च संख्या में, भड़काऊ ट्यूमर3में, आईबीएस और Crohn भड़क अप4के दौरान, और गैर संक्रामक सूजन के क्षेत्रों में ऐसे रुमेटी गठिया के synovia के रूप में ( रा) रोगियों5. न्यूट्रोफिल में azurophil (α), विशिष्ट (β1), तृतीयक (β2) granules, और स्रावी बुलबुले (γ)6नामक पूर्व-निर्मित granules की चार कक्षाएं शामिल हैं । एक भड़काऊ साइट के लिए प्रवास पर, भर्ती न्यूट्रोफिल सक्रिय हो जाते हैं और क्रमिक रूप से granules सामग्री (आसंजन, रोगाणुरोधी यौगिकों और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी अणुओं से बना), जो आगे भर्ती को बढ़ावा देता है और योगदान करने के लिए संक्रमण संकल्प (लेकिन यह भी ऊतक क्षति होस्ट करने के लिए)7. जबकि न्यूट्रोफिल जन्मजात प्रतिरक्षा का एक महत्वपूर्ण पहलू माना जाता है, तारीख करने के लिए वहां कुछ पता लगाने के लिए उंहें अध्ययन उपलब्ध एजेंट हैं, और भी कम है कि न्यूट्रोफिल रहने वाले सक्रियण राज्य का आकलन किया जा सकता है ।
न्यूट्रोफिल का पता लगाने के वर्तमान तरीकों मोनोक्लोनल एंटीबॉडी सेल के खिलाफ उत्पन्न-सतह उजागर एंटीजन, जैसे कि 6G2 या प्रोटीन विशेष रूप से बेसल शर्तों के तहत न्युट्रोफिल granules में संग्रहीत (जैसे, myeloperoxidase , लैक्टोफेरिन) । मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लाभ उनके मजबूत बाध्यकारी, संवेदनशीलता, और विभिंन परख शर्तों के तहत बहुमुखी प्रतिभा शामिल हैं । हालांकि, विशेष रूप से मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और विरोधी-6G का उपयोग करने के लिए कई नकारात्मक पक्ष हैं । इन नकारात्मक पक्ष विशिष्टता शामिल हैं, के रूप में 6G अस्थि मज्जा में माइलॉयड कोशिकाओं के बहुमत पर मौजूद है और इयोस्नोफिल्स सहित सभी granulocytes पर उपस्थित है; इस प्रकार, इस मार्कर के साथ इयोस्नोफिल्स से न्यूट्रोफिल गूढ़ और अधिक परिसरों8दृष्टिकोण की आवश्यकता है । मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ एक और लगातार tradeoff अपने अक्सर सीमित मेजबान विशिष्टता रेंज है, एक से अधिक पशु प्रजातियों के साथ तुलना अध्ययन मुश्किल बना । एंटीबॉडी का पता लगाने के तरीकों का एक तीसरा दोष, विशेष रूप से जब जीवित कोशिकाओं का उपयोग या vivo में, उनके सेल समारोह को बाधित या सेल सक्रियण के लिए नेतृत्व करने की क्षमता है । उदाहरण के लिए, एंटी-6G के प्रशासन चूहों को आमतौर पर न्युट्रोफिल कमी और क्षणिक न्यूट्रोपेनिया9करने के लिए लागू किया जाता है. यह इसके अतिरिक्त प्रदर्शन किया गया है कि एंटीबॉडी इंजेक्शन न्युट्रोफिल अर्बुदरोधी10समारोह को उत्तेजित कर सकते हैं । अंतत:, न्यूट्रोफिल के एंटीबॉडी डिटेक्शन कक्ष की सक्रियण स्थिति प्रकट नहीं होता है ।
हम एक ४०-एमिनो एसिड पेप्टाइड की पहचान की है बुलाया MUB४०, जो एक संख्या में इस्तेमाल किया जा सकता है परख के तहत न्यूट्रोफिल में इन विट्रो या vivo स्थितियों में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जी न्यूट्रोफिल11के सक्रियकरण स्थिति परख । MUB४० MUB७०12से व्युत्पंन है, लैक्टोबैसिलस reuteri सतह बलगम के एक डोमेन-बाध्यकारी प्रोटीन मूल रूप से अपने बलगम13,14बांध करने की क्षमता के लिए वर्णित है । MUB४० न्युट्रोफिल-विशिष्ट और तृतीयक granules में उच्च सांद्रता पर मौजूद है कि ग्लाइकोसिलेटेड लैक्टोफेरिन के साथ इंटरैक्ट करता है । MUB४० मानक permeabilization histopathology या प्रतिदीप्ति में मौजूद कदम के माध्यम से इन granules को उजागर किया जा सकता है-सक्रिय सेल छंटाई (FACS) स्थिर न्यूट्रोफिल के मजबूत धुंधला के लिए प्रोटोकॉल । जब लाइव न्यूट्रोफिल एक निष्क्रिय राज्य में रखा जाता है, MUB४० पेप्टाइड granules सामग्री से बाहर कर दिया है, और कोशिकाओं मार्कर के साथ सकारात्मक दाग नहीं है । सक्रियण पर, MUB४० उजागर लैक्टोफेरिन को बांध और पेप्टाइड के साथ मजबूत धुंधला करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस प्रकार, MUB४० शुद्ध न्यूट्रोफिल के सक्रियकरण राज्य निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह एक आकर्षक मार्कर के लिए संक्रामक प्रक्रिया का पालन कर । सक्रिय न्यूट्रोफिल जीने के लिए बांध करने की क्षमता भी MUB४० एक उपकरण के लिए जीवित पशु मॉडल में न्युट्रोफिल सूजन के क्षेत्रों का पता लगाने के रूप में इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देता है (जैसे, एक माउस गठिया मॉडल15) । इस पांडुलिपि विस्तार में प्रोटोकॉल कैसे फ्लोरोसेंट MUB४० लेबल प्रोटोकॉल ऊतकों में न्यूट्रोफिल प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और कैसे परख करने के लिए रहते है इन विट्रो मेंशुद्ध न्यूट्रोफिल के सक्रियकरण ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="894">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">MUB40-Cy5</td>
			<td style="width:123px;">Benoit Marteyn</td>
			<td style="width:344px;">benoit.marteyn@pasteur.fr</td>
			<td style="width:167px;">Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RI-MUB40-Cy5</td>
			<td>Benoit Marteyn</td>
			<td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td>
			<td>Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Parformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">16005</td>
			<td>Fixative for histology</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Solution used to remove excess PFA</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td align="right">4583</td>
			<td>Used to freeze tissue before cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-Methylbutane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M32631</td>
			<td>Used to freeze tissue before cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">1.00974</td>
			<td>Used for dry ice bath to freeze tissue</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Leica Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1520</td>
			<td>Used to section tissues</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass microscopy slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-518-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cover slips</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>CG15CH</td>
			<td>Hi precision coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dako pen&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td>Used to prevent liquid loss during tissue staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">47036</td>
			<td>Used to permeabilize cells for IF staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">10236276001</td>
			<td>Stains DNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa fluor 488 Phalloidin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Binds actin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prolong Gold antifade Mountant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Prolongs IF signal and resistance to photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluorescent microscope</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Used to image IF slides</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anoxic Cabinet</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Used for the purification of live inactivated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Chloride NaCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Washing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MACS BSA buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>Washing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4937</td>
			<td>Gradient for neutrophil purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD235a glycophorin magnetic microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-501</td>
			<td>Used to remove contaminating RBCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used in the removal of RBCs from neutrophils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 without Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8755</td>
			<td>Used for neutrophil assays</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mub40 peptide for use in detecting neutrophil-mediated inflammation events

यहां, हम एक MUB४०, न्यूट्रोफिल के विशिष्ट और तृतीयक granules में उच्च सांद्रता पर संग्रहीत ग्लाइकोसिलेटेड लैक्टोफेरिन बांध करने की क्षमता के साथ एक संश्लेषित पेप्टाइड के उपयोग को शामिल प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । यह प्रोटोकॉल विवरण कैसे MUB४० सीधे एक fluorophore करने के लिए संयुग्मित निश्चित/permeabilized ऊतकों में न्यूट्रोफिल दाग के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से कैसे इस रहते सेल इमेजिंग में न्युट्रोफिल सक्रियकरण और de-दानेदार के लिए परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । न्युट्रोफिल पता लगाने के तरीकों प्रजातियों विशेष मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, जो हमेशा कुछ अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हैं करने के लिए सीमित कर रहे हैं । MUB४० कोशिका झिल्ली घुसना नहीं है और इस प्रकार गैर में संग्रहीत लैक्टोफेरिन से बाहर रखा गया है-सक्रिय/गैर permeabilized न्यूट्रोफिल । MUB४० एक व्यापक मेजबान रेंज से लैक्टोफेरिन पहचानने का जोड़ा लाभ है, यह विशेष रूप से कई शोध मॉडल को शामिल करने के अध्ययन में परिणामों की तुलना के लिए उपयोगी बनाने, डुप्लिकेट रिएजेंट की संख्या को कम करने, और प्रोटोकॉल सरल बनाना एकल कदम के माध्यम से धुंधला ।

MUB४०-histopathology स्लाइड से सना हुआ ऊतकों के परिणाम आम तौर पर व्यक्तिगत ऊतक भर में बिखरे हुए कोशिकाओं से पता चलता है । MUB४० दाग लैक्टोफेरिन, जो न्युट्रोफिल granules और compartmentalized में मौजूद है । इस प्रक?...

Watch this Scientific Journal Video about The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events at JoVE.com

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

यहाँ, हम निश्चित/permeabilized प्रोटोकॉल अनुभागों में न्यूट्रोफिल की उपस्थिति का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और लाइव शुद्ध न्यूट्रोफिल की सक्रियण स्थिति का आकलन करते हैं. विशेष रूप से, MUB४० पेप्टाइड बांधों लैक्टोफेरिन में मौजूद न्युट्रोफिल-विशिष्ट और तृतीयक granules । या तो permeabilization या न्युट्रोफिल सक्रियण के माध्यम से दाना सामग्री के जोखिम न्यूट्रोफिल के अंकन के लिए अनुमति देता है ।

MUB४० पेप्टाइड का पता लगाने में उपयोग के लिए न्युट्रोफिल-मध्यस्थता सूजन की घटनाओं

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

MUB40 एक उपन्यास न्यूट्रोफिल मार्कर है, जो लैक्टोफेरिन से बांधता है और अब तक परीक्षण किए गए मानव और सभी स्तनपायी ऊतक नमूने में एक विशिष्ट पहचान की अनुमति देता है। MUB40 के साथ न्यूट्रोफिल लेबलिंग आसान, त्वरित और विशिष्ट है। यह अब हमारी प्रयोगशाला में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया है और इस तकनीक के निहितार्थ भड़काऊ रोगों के निदान की दिशा में विस्तार ।शुरू करने के लिए, पाठ प्रोटोकॉल के अनुसार समाधान एक, दो और तीन तैयार करें, और उन्हें रातोंरात एक एनोक्सिक कैबिनेट में रखें। फिर, प्लाज्मा अंश से कोशिकाओं को अलग करने के लिए 20 मिनट के लिए 650 ग्राम पर एकत्र रक्त की ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें। अलग रक्त को परेशान किए बिना, ट्यूबों को एनोक्सिक कैबिनेट में स्थानांतरित करें और प्लाज्मा अंशों को 50 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें।इसके बाद एनोक्सिक कैबिनेट से प्लाज्मा की ट्यूब को हटा दें और इसे 20 मिनट के लिए 2900 ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। पैलेट प्लेटलेट्स को बाधित न करने का ध्यान रखते हुए, ट्यूब को एनोक्सिक कैबिनेट में स्थानांतरित करें और प्लेटलेट खराब प्लाज्मा को एक ताजा 50 मिलीलीटर ट्यूब में पिपेट करें। रक्त संग्रह ट्यूबों का उपयोग करके, लाल रक्त कोशिकाओं को शंकु 50 मिलीलीटर ट्यूब में मिलाएं।फिर, कुल मात्रा 44 मिलीलीटर तक पहुंचने तक 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान जोड़ें, और 6% डेक्सट्रान के छह मिलीलीटर जोड़ें। ट्यूब को 10 से 20 बार उलटा करने के लिए धीरे से रक्त और डेक्सट्रान मिश्रण मिश्रण मिश्रण है, और ट्यूब कम से कम 30 मिनट के लिए तलछट करने के लिए अनुमति देते हैं। जबकि ट्यूब तलछट, प्लाज्मा के 5.8 मिलीलीटर के लिए Percoll समाधान के 4.2 मिलीलीटर जोड़कर एक Percoll ढाल तैयार करते हैं, और मिश्रण करने के लिए ट्यूब उलटा।इसके बाद, डेक्सट्रान के शीर्ष अंश वाले न्यूट्रोफिल को इकट्ठा करें, लाल रक्त कोशिकाओं को पिपेट न करने का ध्यान रखें। स्क्रू कैप को कस लें, एक्सक्सिक कैबिनेट से डेक्सट्रान ट्यूब को हटा दें, और 10 मिनट के लिए 300 ग्राम पर ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें। इस बात का ध्यान रखते हुए कि पेलेट कोशिकाओं को परेशान न किया जाए, ट्यूब को वापस एनोक्सिक कैबिनेट में रखें।इसके बाद पिपिंग करके लिक्विड निकाल लें। धीरे-धीरे प्लाज्मा के एक मिलीलीटर में गोली को फिर से रखें। धीरे-धीरे पर्कोल समाधान के शीर्ष पर पुनर्नसंरित कोशिकाओं को जोड़ें।एनोक्सिक कैबिनेट से परकोल समाधान ट्यूब को ध्यान से हटा दें और इसे न्यूट्रोफिल से पीबीएमसी को अलग करने के लिए 20 मिनट के लिए 800 ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। इसके बाद, टेक्स्ट प्रोटोकॉल के अनुसार 14 मिलीलीटर वाशिंग बफर समाधान तैयार करें। इसके बाद परकोल ट्यूब को एनोक्सिक कैबिनेट में रखें।परकोल और पीबीएमसी को हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें और वाशिंग बफर समाधान के एक मिलीलीटर में गोली युक्त न्यूट्रोफिल को फिर से खर्च करें। इसके बाद, पुनर्न), पुनर् निलंबित कोशिकाओं में चुंबकीय मोतियों के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। धीरे-धीरे कोशिकाओं और मोतियों को कम से कम 15 मिनट के लिए मिलाएं और इनक्यूबेट करें।इसके बाद, दो बार एक जुदाई कॉलम धोएं, जिसमें दो मिलीलीटर वाशिंग बफर है। कॉलम के नीचे एक नई, 15 मिलीलीटर शंकु नली धारण करते समय, कॉलम के माध्यम से न्यूट्रोफिल लाल रक्त कोशिका मिश्रण को धीरे-धीरे पिपेट करें। कॉलम से प्रवाह के माध्यम से बादल छाए रहना चाहिए और अपना लाल रंग खोना चाहिए, शेष लाल रक्त कोशिकाओं से न्यूट्रोफिल के कुल अलगाव की पुष्टि करता है।कॉलम के शीर्ष पर वाशिंग बफर के दो मिलीलीटर जोड़ें और एक ही ट्यूब में प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा करें। इस धोने के अंत तक, प्रवाह के माध्यम से स्पष्ट होना चाहिए। न्यूट्रोफिल समान रूप से वितरित किए जाते हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए संग्रह ट्यूब को धीरे-धीरे मिलाएं।फिर सेल काउंटिंग से फ्लो-थ्रिक के 10 माइक्रोलीटर एकत्र किए। इसके बाद न्यूट्रोफिल ट्यूब को एनोक्सिक कैबिनेट से हटा दें और 20 मिनट तक 300 ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रलाइज करें। तलछट न्यूट्रोफिल को वापस एनोक्सिक कैबिनेट में रखें और पाइपिंग के माध्यम से वाशिंग बफर को हटा दें।इसके बाद प्लाज्मा में गोली को रिसेल करें। आरआई-MUB40-Cy5 का एक माइक्रोलीटर आरएमआई-1640 माध्यम के एक मिलीलीटर में जोड़ें, बिना फिनॉल लाल के, और पिपटिंग के माध्यम से मिलाएं। फिर, मिश्रण करने के लिए एफएमएलपी समाधान और पिपेट का एक माइक्रोलीटर जोड़ें।मिश्रण को ग्लास बॉटम माइक्रोस्कोपी डिश में स्थानांतरित करें। फिर पकवान में शुद्ध कोशिकाओं की एक उपयुक्त मात्रा जोड़ें। अंत में, पकवान को एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप में रखें और छवि अधिग्रहण शुरू करें।इस प्रोटोकॉल में, MUB40 का उपयोग एफएमएलपी के साथ सिमुलेशन पर न्यूट्रोफिल स्राव का पता लगाने के लिए जीवित कोशिकाओं पर किया गया था। लैक्टोफेरिन सहित कणिका सामग्री की रिहाई की गतिशीलता, समय के साथ कल्पना की जा सकती है, यहां मजेंटा में। MUB40 अतिरिक्त रूप से निश्चित न्यूट्रोफिल पर इस्तेमाल किया जा सकता है।यहां, एक समय पर श्रृंखला में फ्लोरोसेंट मोतियों को फागोसिटाइज करना। न्यूट्रोफिल कणिका की सामग्री यहां नीले रंग में लेबल की गई है। न्यूट्रोफिल्स ने शुरुआती समय बिंदुओं पर कोई सेल धुंधला नहीं दिखाया और धीरे-धीरे, आरआई-MUB40 लेबलिंग प्लाज्मा झिल्ली और मनका सतह दोनों पर समय के साथ बढ़ी।MUB40 का उपयोग विशेष रूप से न्यूट्रोफिल का पता लगाने के लिए निश्चित भड़काऊ ऊतकों पर भी किया जा सकता है, जैसा कि पाठ के आंकड़ों में दिखाया गया है। हम यहां न्यूट्रोफिल शुद्धिकरण प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, जो हमारी प्रयोगशाला में नियमित रूप से लागू होता है। कोई अन्य विधि उपयुक्त है, MUB40-Cy5 लेबलिंग अभी भी काम करेगी।न्यूट्रोफिल को विशेष रूप से शुद्धिकरण के बाद MUB40 के साथ लेबल किया जा सकता है, या सीधे रोगियों या पशु मॉडल से सूजन ऊतक में। इसके उपयोग को व्यापक बनाने के लिए कई MUB40 डेरिवेटिव डिजाइन किए गए हैं। इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने सूजन के क्षेत्र में शोधकर्ता के लिए मार्ग प्रशस्त किया, भड़काऊ बीमारियों में न्यूट्रोफिलिक भर्ती और सक्रियण का पता लगाने के लिए।

Research

JoVE Journal

Biology

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

नैदानिक ​​आभासी वास्तविकता में Biofeedback का उपयोग: निडर परियोजना

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenesis और आयन चैनल के कार्यात्मक विश्लेषण Heterologously स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

जीवित कोशिकाओं में घटनाओं संकेत Unimolecular Biosensors की वास्तविक समय की निगरानी के लिए माइक्रोस्कोपी झल्लाहट

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

माइक्रोबियल सिस्टम्स बायोलॉजी में Chemostats का प्रयोग करें

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

प्रारंभिक भोजी घटनाक्रम की सेल इमेजिंग लाइव: Omegasomes और परे

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

पेप्टाइड arrays का उपयोग प्रोटीन-प्रोटीन सहभागिता वाली साइटों की पहचान

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

विखंडन खमीर में Cytokinetic घटनाक्रम spatiotemporal विश्लेषण

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

कड़ा हो जाना घटनाओं की विशेषता एक मरीन Tubeworm लाइव ऑप्टिकल और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक का प्रयोग

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

एक खमीर एस्ट्रोजन स्क्रीन स्नातक शिक्षण प्रयोगशाला के लिए अनुकूलित का उपयोग कर व्यक्तिगत देखभाल उत्पादों में एस्ट्रोजन लाइगैंडों का पता लगाने

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

लाइम रोग Spirochete, अरै Burgdorferiका पता लगाने में, नेस्टेड पीसीआर का उपयोग टिक में

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...