Name: the mub40 peptide for use in detecting neutrophil-mediated inflammation events
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dalla Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) e ANR JCJC concede (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).

Tutti i metodi descritti qui sono stati esaminati e approvati dalle organizzazioni francese Zinebsbai (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) e CNIL (Commission Nationale Informatique et Liberté).
1. colorazione fluorescente neutrofili nel tessuto di istopatologia con etichettati MUB40
<ol><li>Per ottenere il tessuto per l'istopatologia, Difficoltà sezioni di biopsia del tessuto in un volume adeguato di paraformaldeide al 4% (PFA) per 30 min fi...

<ol>
	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Nicol&#225;s-&#193;vila, J. &. #. 1. 9. 3. ;., Adrover, J. M., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+Homeostasis,+Immunity,+and+Cancer.">Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer.</a> Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).</li><li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer:+neutral+no+more.">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li><li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases.">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li><li>Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+redox+stress+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+disease.">Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. , (2018).</li><li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granules+of+the+human+neutrophilic+polymorphonuclear+leukocyte.">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li><li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils,+from+marrow+to+microbes.">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li><li>Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Ly6C/Ly6G-based+strategy+to+analyze+the+mouse+splenic+myeloid+compartment.">A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).</li><li>Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6G++neutrophils+are+dispensable+for+defense+against+systemic+Listeria+monocytogenes+infection.">Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection.</a> Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).</li><li>Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+mediate+antibody-induced+antitumor+effects+in+mice.">Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice.</a> Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).</li><li>Anderson, M. C., Chaze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUB40+Binds+to+Lactoferrin+and+Stands+as+a+Specific+Neutrophil+Marker.">MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker.</a> Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).</li><li>Co&#239;c, Y. -. M., Baleux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+specific+colonic+mucus+marker+using+a+human+commensal+bacterium+cell+surface+domain.">Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).</li><li>Roos, S., Jonsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-molecular-mass+cell-surface+protein+from+Lactobacillus+reuteri+1063+adheres+to+mucus+components.">A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components.</a> Microbiology. 148, 433-442 (2002).</li><li>Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+proteins+with+a+mucus-binding+domain+found+exclusively+in+lactic+acid+bacteria.">Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria.</a> Microbiology. 152, 273-280 (2006).</li><li>Mancardi, D. A., J&#246;nsson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+The+murine+high-affinity+IgG+receptor+Fc&#947;RIV+is+sufficient+for+autoantibody-induced+arthritis.">Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor Fc&#947;RIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis.</a> Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).</li><li>Walmsley, S. R., Print, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+neutrophil+survival+is+mediated+by+HIF-1alpha-dependent+NF-kappaB+activity.">Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).</li><li>Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoxia+and+glucose+supplementation+preserve+neutrophil+viability+and+function.">Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function.</a> Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).</li></ol>

Qui, due analisi sono descritti in cui il peptide di40 MUB è usato per studiare l'attivazione e l'infiammazione del neutrofilo. Vi mostriamo come MUB40 può rivelare neutrofili presentano nelle sezioni di istopatologia o mostrano il loro stato di attivazione utilizzando neutrofili purificati dal vivo. I passaggi critici per l'utilizzo di MUB40 come reagente di colorazione sono lo stesso come con qualsiasi altro metodo di rilevazione fluorescente. Cura deve essere presa per assicurare la ...

I neutrofili sono una delle armi primarie del sistema immunitario innato e ordinariamente sono reclutati ai siti di infiammazione intorno al corpo. Lo studio dei neutrofili è stato in gran parte alterato dalla loro durata di vita breve in vitro (meno di 8 h) e dagli strumenti di rilevazione limitata in condizioni basali o dopo l'attivazione. Qui, presentiamo un protocollo ben collaudato per la rilevazione di ampio e specifico dei mammiferi neutrofili nei campioni fissati/permeabilizzate. Forniamo anche un protocollo dettagliato per la macchiatura diretta neutrofili con MUB40. Utilizzando il protocollo di colorazione del neutrofilo dal vivo, la tempistica e la posizione dell'attivazione dei neutrofili può essere individuati. Questo protocollo è ideale per i ricercatori che desiderano studiare il rilascio dei neutrofili di attivazione o granello. Di là di loro funzioni antimicrobiche, neutrofili sono ora apprezzati come immunomodulatori cellule coinvolte in una vasta gamma di malattie e le risposte immunitarie (innato e adattivo)1,2. I neutrofili sono presenti in tessuti più infiammatori, agli alti numeri nei tessuti infetti, i tumori infiammatori3, durante IBS e di Crohn flare-up4e nelle aree di infiammazione non infettiva quali synovia di artrite reumatoide ( RA) pazienti5. Neutrofili contengono quattro classi di granuli preformati denominato azurophil (α), specifiche (β1), granuli di terziario (β2) e vescicole secretorie (γ)6. Durante la migrazione di un sito infiammatorio, reclutati neutrofili attivati e in sequenza secernono contenuto granello (composto da molecole di immunomodulatori, di adesione e di composti antimicrobici), che promuove ulteriormente reclutamento e contribuisce alla infezione ad alta risoluzione (ma anche a danno di tessuto host)7. Mentre i neutrofili sono considerati un aspetto critico dell'immunità innata, ad oggi vi sono alcuni reagenti di rilevamento disponibili per studiarli, e ancor meno che può essere utilizzato per valutare lo stato di attivazione dei neutrofili vivente.
Attuali metodi di rilevazione dei neutrofili si basano su anticorpi monoclonali generati contro gli antigeni esposti cellula-superficie, ad esempio Ly - 6 G2 o proteine in particolare memorizzati in granuli neutrofili in condizioni basali (ad es., mieloperossidasi lattoferrina). Anticorpi monoclonali vantaggi loro forte legame, sensibilità e versatilità in diverse condizioni di dosaggio. Tuttavia, ci sono diversi aspetti negativi all'utilizzo di anticorpi monoclonali e anti-Ly - 6G in particolare. Questi aspetti negativi includono la specificità, come Ly - 6G è presente sulla maggior parte delle cellule mieloidi nel midollo osseo e su tutti i granulociti compresi gli eosinofilo; decifrare i neutrofili da eosinofilo con questo marcatore richiede pertanto più complessi si avvicina a8. Un altro frequente compromesso con gli anticorpi monoclonali è il loro range di specificità spesso limitata host, rendendo difficili gli studi di confronto con più di una specie animale. Un terzo inconveniente di metodi di rilevazione dell'anticorpo, specialmente quando si utilizzano celle in tensione o in vivo, è il loro potenziale per disturbare la funzione delle cellule o portare alla attivazione delle cellule. Ad esempio, la somministrazione di anti-Ly - 6g ai topi è comunemente applicata allo svuotamento del neutrofilo e neutropenia transitoria9. Inoltre è stato dimostrato che l'iniezione di anticorpi può stimolare funzione antitumorale del neutrofilo10. Infine, rilevazione dell'anticorpo dei neutrofili non rivela lo stato di attivazione della cellula.
Abbiamo identificato un peptide di 40 aminoacidi chiamato MUB40, che può essere utilizzato in un certo numero di saggi per etichettare i neutrofili in condizioni in vitro o in vivo , nonché di analizzare lo stato di attivazione dei neutrofili live11. MUB40 è derivato da MUB7012, un dominio della superficie Lactobacillus reuteri muco-binding protein originariamente descritto per la sua capacità di legare il muco13,14. MUB40 interagisce con lattoferrina glicosilata che è presente in alte concentrazioni nei granuli specifici del neutrofilo e terziari. MUB40 possono essere esposti a questi granuli attraverso passi di permeabilizzazione standard presenti in istopatologia o fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento protocolli (FACS) per la macchiatura robusta dei neutrofili fissi. Quando i neutrofili dal vivo sono tenuti in uno stato inattivato, il peptide di40 MUB è escluso dal contenuto del granello, e cellule non macchia positive con il marcatore. Al momento dell'attivazione, MUB40 possono associare alla lattoferrina esposta e portare a macchiatura robusta con il peptide. Così, MUB40 può essere utilizzato per determinare lo stato di attivazione dei neutrofili purificati, che lo rende un marcatore attraente di seguire il processo contagioso. La capacità di legarsi a vivere neutrofili attivati consente inoltre MUB40 essere utilizzato come uno strumento per rilevare le aree di infiammazione del neutrofilo nei modelli animali dal vivo (ad esempio, un mouse artrite modello15). I protocolli in questo dettaglio del manoscritto come fluorescente etichettati MUB40 utilizzabile per rivelare i neutrofili in istologia tessuti e come analizzare l'attivazione dei neutrofili purificati dal vivo in vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="894">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">MUB40-Cy5</td>
			<td style="width:123px;">Benoit Marteyn</td>
			<td style="width:344px;">benoit.marteyn@pasteur.fr</td>
			<td style="width:167px;">Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RI-MUB40-Cy5</td>
			<td>Benoit Marteyn</td>
			<td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td>
			<td>Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Parformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">16005</td>
			<td>Fixative for histology</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Solution used to remove excess PFA</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td align="right">4583</td>
			<td>Used to freeze tissue before cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-Methylbutane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M32631</td>
			<td>Used to freeze tissue before cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">1.00974</td>
			<td>Used for dry ice bath to freeze tissue</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Leica Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1520</td>
			<td>Used to section tissues</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass microscopy slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-518-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cover slips</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>CG15CH</td>
			<td>Hi precision coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dako pen&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td>Used to prevent liquid loss during tissue staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">47036</td>
			<td>Used to permeabilize cells for IF staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">10236276001</td>
			<td>Stains DNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa fluor 488 Phalloidin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Binds actin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prolong Gold antifade Mountant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Prolongs IF signal and resistance to photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluorescent microscope</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Used to image IF slides</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anoxic Cabinet</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Used for the purification of live inactivated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Chloride NaCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Washing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MACS BSA buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>Washing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4937</td>
			<td>Gradient for neutrophil purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD235a glycophorin magnetic microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-501</td>
			<td>Used to remove contaminating RBCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used in the removal of RBCs from neutrophils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 without Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8755</td>
			<td>Used for neutrophil assays</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mub40 peptide for use in detecting neutrophil-mediated inflammation events

Qui, forniamo un protocollo che prevedono l'uso di MUB40, un peptide sintetizzato con la capacità di legare la lattoferrina glicosilata memorizzata ad alte concentrazioni nei granuli specifici e terziari dei neutrofili. Dettagli di questo protocollo come MUB40 coniugato direttamente a un fluoroforo possono essere utilizzato a macchiare i neutrofili in fissa/permeabilizzate tessuti pure come questo possa essere utilizzato in cellule vive di imaging analizzare per-granulazione e attivazione dei neutrofili. Metodi di rilevazione dei neutrofili sono limitati a specie-specifici anticorpi monoclonali, che non sono sempre adatti per determinate applicazioni. MUB40 non penetrare la membrana cellulare e quindi è escluso dalla lattoferrina memorizzata nei neutrofili non-attivato/non-permeabilized. MUB40 ha il beneficio aggiunto di riconoscere lattoferrina da una gamma vasta host, che lo rende particolarmente utile per confrontare i risultati di studi condotti su diversi modelli di ricerca, riducendo il numero di duplicati reagenti e semplificando i protocolli attraverso passo singolo di colorazione.

Risultati di MUB40-tessuti macchiati da diapositive di istopatologia tipicamente rivelano cellule singole sparse in tutto il tessuto. MUB40 macchie lattoferrina, che è presente in granuli neutrofili e compartimenti stagni. Così, in genere visto punctate macchiatura o diverse grandi aree separate del segnale proviene da singoli neutrofili (Figura 1). È utile aggiungere un secondo indicatore di cella come DAPI per aiutare co-localizzano...

Watch this Scientific Journal Video about The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events at JoVE.com

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare la presenza di neutrofili in sezioni di istologia fisso/permeabilizzate e valutare lo stato di attivazione dei neutrofili purificati dal vivo. In particolare, il peptide di40 MUB associa la lattoferrina presente nei granuli specifici del neutrofilo e terziari. L'esposizione del contenuto granello tramite permeabilizzazione o l'attivazione del neutrofilo permette per la marcatura dei neutrofili.

Il Peptide di40 MUB per uso nella rilevazione eventi infiammatori mediato dai neutrofili

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

MUB40 è un nuovo marcatore neutrofilo, che si lega alla lattoferrina e consente un rilevamento specifico nel campione di tessuto umano e di tutti i mammiferi testato finora. Etichettare i neutrofili con MUB40 è facile, veloce e specifico. Ora è ampiamente usato nel nostro laboratorio e l'implicazione di questa tecnica si estende verso la diagnosi di malattie infiammatorie.Per iniziare, preparare le soluzioni una, due e tre in base al protocollo di testo e posizionarle in un armadio anossico durante la notte. Quindi, centrifugare i tubi del sangue raccolto a 650 g per 20 minuti per separare le cellule dalla frazione plasmatica. Senza disturbare il sangue separato, trasferire i tubi nell'armadio anossico e trasferire le frazioni plasmatiche in un tubo conico da 50 millilitri.Successivamente rimuovere il tubo di plasma dall'armadio anossico e centrifugarlo a 2900 g per 20 minuti. Facendo attenzione a non interrompere le piastrine pelletate, trasferire il tubo nell'armadio anossico e pipettare il plasma povero di piastrine in un tubo fresco da 50 millilitri. Utilizzando i tubi di raccolta del sangue, unire i globuli rossi in un tubo conico da 50 millilitri.Quindi, aggiungere la soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% fino a quando il volume totale non raggiunge i 44 millilitri e aggiungere sei millilitri del 6%dextran. Invertire il tubo da 10 a 20 volte per mescolare delicatamente il sangue e la miscela di dextran e lasciare che il tubo sedimenti per almeno 30 minuti. Mentre il tubo sedimenta, preparare un gradiente di Percoll aggiungendo 4,2 millilitri di soluzione Percoll a 5,8 millilitri di plasma e invertire il tubo per mescolare.Successivamente, raccogliere il neutrofilo contenente la frazione superiore del dextran, facendo attenzione a non pipettare i globuli rossi. Stringere il tappo a vite, rimuovere il tubo di dextran dall'armadio anossico e centrifugare il tubo a 300 g per 10 minuti. Facendo attenzione a non disturbare le cellule pellettate, riposizionare il tubo nell'armadio anossico.Quindi, rimuovere il liquido tubazione. Riutilizzare delicatamente il pellet in un millilitro di plasma. Aggiungere lentamente le celle rimescolate alle parti superiore della soluzione Percoll.Rimuovere con cura il tubo di soluzione Percoll dall'armadio anossico e centrifugarlo a 800 g per 20 minuti per separare i PBBC dai neutrofili. Successivamente, preparare 14 millilitri di soluzione tampone di lavaggio secondo il protocollo di testo. Quindi, posizionare il tubo Percoll nell'armadio anossico.Utilizzare una pipetta per rimuovere il Percoll e il PBPC e rimorsi il neutrofilo contenente pellet in un millilitro di soluzione tampone di lavaggio. Aggiungere quindi 200 microlitri di perline magnetiche alle cellule rimorsi. Mescolare e incubare delicatamente le cellule e le perline per almeno 15 minuti.Dopo questo, lavare due volte una colonna di separazione, con due millilitri di tampone di lavaggio. Tenendo un nuovo tubo conico da 15 millilitri sotto la colonna, pipettare lentamente la miscela di globuli rossi neutrofili attraverso la colonna. Il flusso dalla colonna dovrebbe essere torbido e perdere il suo colore rosso, confermando la separazione totale dei neutrofili dai globuli rossi rimanenti.Aggiungere due millilitri di tampone di lavaggio nella parte superiore della colonna e raccogliere il flusso nello stesso tubo. Entro la fine di questo lavaggio, il flusso dovrebbe essere chiaro. Mescolare delicatamente il tubo di raccolta per assicurarsi che i neutrofili siano distribuiti uniformemente.Quindi raccolti 10 microlitri del flusso attraverso il conteggio delle cellule. Successivamente, rimuovere il tubo neutrofilo dall'armadio anossico e centrifugare il tubo a 300 g per 20 minuti. Riposizionare i neutrofili sedimentati nell'armadio anossico e rimuovere il tampone di lavaggio tramite pipettazione.Quindi, resuspend il pellet nel plasma. Aggiungere un microlitro di RI-MUB40-Cy5 a un millilitro di mezzo RPMI-1640, senza rosso fenolo, e mescolare tramite pipettazione. Quindi, aggiungere un microlitro di soluzione FMLP e pipetta da mescolare.Trasferire la miscela su un piatto di microscopia con fondo di vetro. Quindi aggiungere un volume appropriato di cellule purificate al piatto. Infine, posizionare il piatto in un microscopio fluorescente invertito e avviare l'acquisizione dell'immagine.In questo protocollo, MUB40 è stato utilizzato sulle cellule viventi per rilevare la secrezione di neutrofili durante la simulazione con FMLP. La dinamica del rilascio del contenuto di granuli, compresa la lattoferrina, può essere vista nel tempo, qui a Magenta. MUB40 può essere utilizzato anche su neutrofili fissi.Qui, fagocitizzando le perle fluorescenti in una serie a tempo. Il contenuto del granulo neutrofilo è etichettato qui in blu. I neutrofili hanno mostrato poca o nessuna colorazione cellulare nei primi punti di tempo e gradualmente, l'etichettatura RI-MUB40 è aumentata nel tempo, sia sulla membrana plasmatica che sulla superficie del tallone.MUB40 può essere utilizzato anche su tessuti infiammatori fissi per rilevare specificamente i neutrofili, come mostrato nelle figure di testo. Descriviamo qui la procedura di purificazione dei neutrofili, applicata regolarmente nel nostro laboratorio. Qualsiasi altro metodo è adatto, l'etichettatura MUB40-Cy5 funzionerà ancora.Neutrofilo può essere specificamente etichettato con MUB40 dopo la purificazione, o direttamente in tessuto infiammato da pazienti o modelli animali. Diversi derivati MUB40 sono stati progettati per ampliarne l'uso. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada al ricercatore nel campo dell'infiammazione, per esplorare il reclutamento neutrofilo e l'attivazione nelle malattie infiammatorie.

Research

JoVE Journal

Biology

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

L&#39;uso del Biofeedback in Clinica Realtà Virtuale: Il Progetto INTREPID

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Ricerca

Biologia

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET Microscopia per Monitoraggio in tempo reale di segnalazione di eventi in cellule vive Uso Biosensori unimolecolare

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

L&#39;uso di chemostati in Biologia microbica Sistemi

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Imaging cellulare dal vivo dei primi autofagia Eventi: Omegasomes e oltre

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Identificare proteina-proteina siti di interazione Uso Peptide Array

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Analisi spazio-temporale di Cytokinetic Eventi in lievito di fissione

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Caratterizzazione di calcificazione eventi utilizzando dal vivo ottica ed elettronica Microscopia tecniche in un tubeworm Marine

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

Rilevamento di ligandi estrogenici nei prodotti di cura personale utilizzando un lievito estrogeno schermo ottimizzato per il laboratorio di insegnamento universitari

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Rilevare il malattia di Lyme Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in segni di graduazione utilizzando la PCR annidata

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...