Name: the mub40 peptide for use in detecting neutrophil-mediated inflammation events
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) og ANR JCJC gir (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).

Alle metodene som er beskrevet her er vurdert og godkjent av de franske organisasjonene CoRC (Comité de Recherche Clinique) CPP (Comité de beskyttelse des Personnes) og CNIL (Kommisjonen Nationale Informatique et Liberté).
1. farging nøytrofile i histopatologi vev med Fluorescently merket MUB40
<ol><li>For å få vev for histopatologi, fikse vev/biopsi inndelinger i en passende mengde 4% paraformaldehyde (PFA) i 30 min opptil 4 h avhengig av tykkelsen på prøven. Sett prøven...

<ol>
	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Nicol&#225;s-&#193;vila, J. &. #. 1. 9. 3. ;., Adrover, J. M., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+Homeostasis,+Immunity,+and+Cancer.">Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer.</a> Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).</li><li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer:+neutral+no+more.">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li><li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases.">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li><li>Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+redox+stress+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+disease.">Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. , (2018).</li><li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granules+of+the+human+neutrophilic+polymorphonuclear+leukocyte.">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li><li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils,+from+marrow+to+microbes.">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li><li>Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Ly6C/Ly6G-based+strategy+to+analyze+the+mouse+splenic+myeloid+compartment.">A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).</li><li>Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6G++neutrophils+are+dispensable+for+defense+against+systemic+Listeria+monocytogenes+infection.">Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection.</a> Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).</li><li>Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+mediate+antibody-induced+antitumor+effects+in+mice.">Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice.</a> Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).</li><li>Anderson, M. C., Chaze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUB40+Binds+to+Lactoferrin+and+Stands+as+a+Specific+Neutrophil+Marker.">MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker.</a> Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).</li><li>Co&#239;c, Y. -. M., Baleux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+specific+colonic+mucus+marker+using+a+human+commensal+bacterium+cell+surface+domain.">Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).</li><li>Roos, S., Jonsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-molecular-mass+cell-surface+protein+from+Lactobacillus+reuteri+1063+adheres+to+mucus+components.">A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components.</a> Microbiology. 148, 433-442 (2002).</li><li>Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+proteins+with+a+mucus-binding+domain+found+exclusively+in+lactic+acid+bacteria.">Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria.</a> Microbiology. 152, 273-280 (2006).</li><li>Mancardi, D. A., J&#246;nsson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+The+murine+high-affinity+IgG+receptor+Fc&#947;RIV+is+sufficient+for+autoantibody-induced+arthritis.">Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor Fc&#947;RIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis.</a> Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).</li><li>Walmsley, S. R., Print, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+neutrophil+survival+is+mediated+by+HIF-1alpha-dependent+NF-kappaB+activity.">Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).</li><li>Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoxia+and+glucose+supplementation+preserve+neutrophil+viability+and+function.">Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function.</a> Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).</li></ol>

Her er to analyser beskrevet som MUB40 peptid brukes til å studere nøytrofile betennelse og aktivisering. Vi viser hvordan MUB40 kan avsløre nøytrofile presentere i histopatologi deler eller vise deres aktiveringsstatus bruker live renset nøytrofile. De avgjørende skritt for å bruke MUB40 som en flekker reagens er den samme som med andre fluorescerende oppdagelsen metoden. Hensyn må tas for å sikre kompatibilitet med fluorescerende signaler og at tilstrekkelig vask skritt er tatt...

Nøytrofile er en av de primære våpen av det medfødte immunsystemet og rekrutteres rutinemessig til nettstedene til betennelse rundt i kroppen. Studiet av nøytrofile har vært i stor grad svekket ved deres kort lifespan i vitro (mindre enn 8 timer) og begrenset gjenkjenningsverktøy basale vilkår eller etter aktivering. Her presenterer vi en godt testet protokoll for bred og konkret påvisning av pattedyr nøytrofile i fast/permeabilized prøver. Vi tilbyr også en detaljert protokoll til farging live nøytrofile MUB40. Bruker live nøytrofile flekker protokollen, kan tidsberegningen og plasseringen av nøytrofile aktivisering bli rettet. Denne protokollen er ideell for forskere som ønsker å studere nøytrofile aktivisering eller granule utgivelsen. Utover deres antimicrobial funksjoner er nøytrofile nå verdsatt som immunmodulerende celler involvert i en rekke sykdommer og immunreaksjoner (medfødte og adaptive)1,2. Nøytrofile er tilstede i mest provoserende vev, på høye tall i infiserte vev, inflammatorisk svulster3, under IBS og Crohns flare-ups4, og områder av ikke-smittsomme betennelser som synovia av revmatoid artritt ( RA) pasienter5. Nøytrofile inneholder fire klasser av pre-formet granulater azurophil (α), spesifikke (β1), tertiær (β2) granulater og sekretoriske blemmer (γ)6. Overføring til et provoserende rekruttert nøytrofile bli aktivert og skiller sekvensielt granule innholdet (komponert av vedheft, antimikrobielle forbindelser og immunmodulerende molekyler), som fremmer videre rekruttering og bidrar til infeksjon oppløsning (men også til vert vevsskade)7. Mens nøytrofile anses en kritisk del av medfødt immunitet, ennå det er få oppdagelsen reagenser tilgjengelig å studere dem, og enda færre som kan brukes til å vurdere aktiveringsstatusen for levende nøytrofile.
Gjeldende metoder av oppdager nøytrofile er avhengige av monoklonale antistoffer generert mot celle-overflate eksponert antigener, for eksempel Ly - 6 G2 eller proteiner spesielt lagret i nøytrofile granulater under basale forhold (f.eks myeloperoxidase lactoferrin). Fordelene av monoklonale antistoffer inkluderer sine sterke bindende, følsomhet og allsidighet under ulike analysen forhold. Det er imidlertid flere downsides å benytter monoklonale antistoffer og anti-Ly - 6G spesielt. Disse ulempene inkluderer spesifisitet, som Ly - 6G finnes på et flertall av myeloide celler i beinet margtransplantasjon og på alle granulocytter inkludert eosinofile; dermed krever tyde nøytrofile fra eosinofile med dette merket flere komplekser tilnærminger8. En annen hyppige bakdelen med monoklonale antistoffer er deres ofte begrenset vert spesifisitet, gjør sammenligning studier med flere dyrearter vanskelig. En tredje ulempen av antistoff gjenkjenningsmetoder, spesielt når du bruker live celler eller i vivo, er deres potensial til å forstyrre funksjonen celle eller føre til celle aktivering. Administrasjonen av anti-Ly - 6G til mus brukes for eksempel ofte til nøytrofile uttømming og forbigående nøytropeni9. Det har i tillegg blitt demonstrert at antistoff injeksjon kan stimulere nøytrofile antitumor funksjonen10. Til slutt avslører ikke antistoff påvisning av nøytrofile aktiveringsstatusen for cellen.
Vi har identifisert en 40-amino acid peptid kalt MUB40, som kan brukes i en rekke analyser etiketten nøytrofile under i vitro eller vivo forhold samt analysen aktiviseringen rang av live nøytrofile11. MUB40 er avledet fra MUB7012, et domene av Lactobacillus reuteri overflaten Slim-bindende protein opprinnelig beskrevet for sin evne til å binde Slim13,14. MUB40 samhandler med glycosylated Laktoferrin som finnes i høy konsentrasjoner i nøytrofile-spesifikke og tertiær granulat. MUB40 kan bli utsatt for disse granulater gjennom standard permeabilization trinnene i histopatologi eller fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) protokoller for robust farging av fast nøytrofile. Når live nøytrofile beholdes i deaktivert tilstand MUB40 peptid er utelukket fra granule innholdet og cellene flekker ikke positivt med markøren. Ved aktivering, kan MUB40 binde til utsatte Laktoferrin og føre til robust farging med peptid. MUB40 kan dermed brukes til å bestemme aktiveringsstatusen for renset nøytrofile, noe som gjør det til et attraktivt markør følge smittsomme prosessen. Muligheten til å binde til live aktivert nøytrofile kan også MUB40 skal brukes som et verktøy for å oppdage områder av nøytrofile betennelse i levende dyr modeller (f.eks en mus leddgikt modell15). Protokollene i dette manuskriptet detalj hvordan fluorescently merket MUB40 kan brukes å avsløre nøytrofile histology vev og hvordan analysen aktivering av live renset nøytrofile i vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="894">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">MUB40-Cy5</td>
			<td style="width:123px;">Benoit Marteyn</td>
			<td style="width:344px;">benoit.marteyn@pasteur.fr</td>
			<td style="width:167px;">Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RI-MUB40-Cy5</td>
			<td>Benoit Marteyn</td>
			<td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td>
			<td>Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Parformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">16005</td>
			<td>Fixative for histology</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Solution used to remove excess PFA</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td align="right">4583</td>
			<td>Used to freeze tissue before cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-Methylbutane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M32631</td>
			<td>Used to freeze tissue before cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">1.00974</td>
			<td>Used for dry ice bath to freeze tissue</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Leica Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1520</td>
			<td>Used to section tissues</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass microscopy slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-518-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cover slips</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>CG15CH</td>
			<td>Hi precision coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dako pen&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td>Used to prevent liquid loss during tissue staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">47036</td>
			<td>Used to permeabilize cells for IF staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">10236276001</td>
			<td>Stains DNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa fluor 488 Phalloidin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Binds actin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prolong Gold antifade Mountant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Prolongs IF signal and resistance to photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluorescent microscope</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Used to image IF slides</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anoxic Cabinet</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Used for the purification of live inactivated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Chloride NaCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Washing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MACS BSA buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>Washing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4937</td>
			<td>Gradient for neutrophil purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD235a glycophorin magnetic microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-501</td>
			<td>Used to remove contaminating RBCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used in the removal of RBCs from neutrophils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 without Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8755</td>
			<td>Used for neutrophil assays</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mub40 peptide for use in detecting neutrophil-mediated inflammation events

Her gir vi en protokoll med bruk av MUB40, et syntetisk peptid muligheten til å binde glycosylated Laktoferrin lagret i høy konsentrasjoner i bestemte og tertiær granulater av nøytrofile. Denne protokollen detaljer hvordan MUB40 konjugert direkte til en fluorophore kan brukes stain nøytrofile fast/permeabilized vev samt hvordan dette kan brukes i live-celle imaging til analysen for nøytrofile aktivisering og de korning. Nøytrofile gjenkjenningsmetoder er begrenset til artsspesifikke monoklonale antistoffer, som ikke alltid egnet for bestemte programmer. MUB40 trenge ikke cellemembranen og er derfor utelukket fra Laktoferrin lagret i ikke-aktivert/ikke-permeabilized nøytrofile. MUB40 har den ekstra fordelen av å gjenkjenne Laktoferrin fra et bredt vert område, slik at det er spesielt nyttig for å sammenligne resultatene i studier som involverer flere forskning modeller, reduserer like reagenser og forenkle protokoller gjennom enkeltsteg flekker.

Resultatene MUB40-farget vev fra histopatologi lysbilder avslører vanligvis enkeltceller spredt over hele vevet. MUB40 flekker Laktoferrin, som er tilstede i nøytrofile granulater og compartmentalized. Dermed vanligvis sett vises punctate flekker og flere store atskilt områder av signalet kommer fra personlige nøytrofile (figur 1). Det er nyttig å legge til en andre cellen markør som DAPI å lokalisere co MUB40 signalet ...

Watch this Scientific Journal Video about The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events at JoVE.com

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

Her presenterer vi en protokoll for å oppdage tilstedeværelsen av nøytrofile i fast/permeabilized histology deler og vurdere aktiveringsstatusen for live renset nøytrofile. Spesielt binder MUB40 peptid Laktoferrin i nøytrofile-spesifikke og tertiær granulat. Eksponering av granule innholdet via permeabilization eller nøytrofile Aktivering muliggjør merking av nøytrofile.

MUB40 peptid for bruk i å oppdage nøytrofile-mediert betennelse hendelser

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

MUB40 er en ny nøytrofil markør, som binder seg til laktoferrin og tillater en bestemt deteksjon i menneskelig og alle pattedyr vev prøve testet så langt. Merking nøytrofiler med MUB40 er enkelt, raskt og spesifikt. Det er nå brukt mye i laboratoriet vårt, og implikasjonen av denne teknikken strekker seg mot diagnose av inflammatoriske sykdommer.For å begynne, forberede løsninger en, to og tre i henhold til tekstprotokollen, og plasser dem i et anoksisk skap over natten. Deretter sentrifugerer rørene av samlet blod ved 650 g i 20 minutter for å skille cellene fra plasmafraksjonen. Uten å forstyrre det separerte blodet, overfør rørene til det anoksiske kabinettet og overfør plasmafraksjonene til et 50 milliliter konisk rør.Etter dette fjerner plasmarøret fra det anoksiske kabinettet og sentrifugerer det ved 2900 g i 20 minutter. Ta vare på å ikke forstyrre pelleted blodplater, overføre røret til det anoksiske kabinettet og pipette blodplaten dårlig plasma i en frisk 50 milliliter rør. Ved hjelp av blodoppsamlingsrørene, kombiner de røde blodcellene i et konisk 50 milliliter rør.Deretter legger du til 0,9% natriumkloridoppløsning til det totale volumet når 44 milliliter, og legger til seks milliliter med 6% dextran. Inverter røret 10 til 20 ganger for å forsiktig blande blodet og dextran blandingen, og la røret sediment i minst 30 minutter. Mens rørsedimentene, forberede en Percoll gradient ved å legge til 4,2 milliliter Percoll løsning til 5,8 milliliter plasma, og invertere røret for å blande.Deretter samler du nøytrofil som inneholder øvre brøkdel av dextran, og tar vare på å ikke pipetter røde blodlegemer. Trekk til skrukorken, fjern dekstranrøret fra det anoksiske kabinettet, og sentrifuger røret ved 300 g i 10 minutter. Ta vare på ikke å forstyrre pelleted celler, plasser røret tilbake i det anoksiske kabinettet.Fjern deretter væsken ved å pipettering. Forsiktig resuspend pellet i en milliliter plasma. Legg langsomt de resuspended cellene til toppen av Percoll-løsningen.Fjern Forsiktig Percoll-løsningsrøret fra det anoksiske kabinettet og sentrifuger det på 800 g i 20 minutter for å skille PBMCer fra nøytrofiler. Deretter forbereder du 14 milliliter vaskebufferløsning i henhold til tekstprotokollen. Deretter plasserer du Percoll-røret i det anoksiske kabinettet.Bruk en pipette til å fjerne Percoll- og PBMC-ene og gjenbruke nøytrofilen som inneholder pellet i én milliliter vaskebufferløsning. Deretter legger du til 200 mikroliter magnetiske perler til de resuspended cellene. Bland og inkuber cellene og perlene forsiktig i minst 15 minutter.Etter dette vasker du en separasjonskolonne to ganger, med to milliliter vaskebuffer. Mens du holder en ny, 15 milliliter konisk rør under kolonnen, sakte pipette nøytrofil røde blodlegemer blandingen gjennom kolonnen. Gjennomstrømningen fra kolonnen skal være overskyet og miste sin røde farge, noe som bekrefter den totale separasjonen av nøytrofiler fra gjenværende røde blodlegemer.Legg til to milliliter vaskebuffer øverst i kolonnen og samle gjennomstrømningen i samme rør. Ved slutten av denne vasken skal gjennomstrømningen være klar. Bland oppsamlingsrøret forsiktig for å sikre at nøytrofile fordeles jevnt.Deretter samlet 10 mikroliter av gjennomstrømningen fra celletelling. Etter dette fjerner du nøytrofilrøret fra det anoksiske kabinettet og sentrifugerer røret ved 300 g i 20 minutter. Plasser de sedimenterte nøytrofile tilbake i det anoksiske kabinettet og fjern vaskebufferen via pipettering.Deretter resuspend pellet i plasma. Tilsett en mikroliter ri-MUB40-Cy5 til en milliliter RPMI-1640 medium, uten fenolrød, og bland via pipettering. Deretter legger du til en mikroliter FMLP-løsning og pipette for å blande.Overfør blandingen til en glassbunnsmikroskopisfat. Legg deretter til et passende volum av rensede celler til parabolen. Til slutt plasserer du parabolen i et invertert fluorescerende mikroskop og starter bildeoppkjøp.I denne protokollen ble MUB40 brukt på levende celler for å oppdage nøytrofil sekresjon ved simulering med FMLP. Dynamikken i utgivelsen av granulatinnhold, inkludert laktoferrin, kan visualiseres over tid, her i magenta. MUB40 kan i tillegg brukes på faste nøytrofiler.Her, phagocytizing fluorescerende perler i en tidsstet serie. Nøytrofilgranulatets innhold er merket her i blått. Nøytrofile viste liten eller ingen cellefarging på tidlige tidspunkter, og gradvis økte RI-MUB40-merkingen over tid, både på plasmamembranen og perleoverflaten.MUB40 kan også brukes på fast inflammatorisk vev for å oppdage nøytrofiler spesielt, som vist i tekstfigurene. Vi beskriver her nøytrofilrensingsprosedyren, som brukes rutinemessig i laboratoriet vårt. Enhver annen metode er egnet, MUB40-Cy5 merking vil fortsatt fungere.Nøytrofil kan være spesielt merket med MUB40 etter rensing, eller direkte i betent vev fra pasienter eller dyremodeller. Flere MUB40 derivater er designet for å utvide bruken. Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forsker innen betennelse, for å utforske nøytrofil rekruttering og aktivering i inflammatoriske sykdommer.

Research

JoVE Journal

Biology

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET Mikroskopi for sanntids overvåking av signalanlegg hendelser i levende celler Bruke Unimolecular biosensorer

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Bruk av Chemostats i Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Leve Cell Imaging av Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Identifisere Protein-protein interaksjons nettsteder Bruke Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Spatiotemporal Analyse av Cytokinetic Hendelser i Fisjon Gjær

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Karakterisering av Forkalkning Hendelser Bruke levende Optiske og elektronmikroskopi teknikker i en Marine tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

Oppdage Estrogenic ligander i personlig pleie-produkter bruker en gjær østrogen skjermen optimert for undervisning undervisning laboratoriet

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Oppdage sykdommen Lyme spiroketen, Borrelia Burgdorferi, i flått bruke nestede PCR

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...