Name: the mub40 peptide for use in detecting neutrophil-mediated inflammation events
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events at JoVE.com

Detta arbete stöds av den Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) och ANR JCJC bidrag (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).

Alla metoderna som beskrivs här har granskats och godkänts av de franska organisationerna CoRC (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) och CNIL (kommissionen Nationale Informatique et Liberté).
1. färgning neutrofiler i histopatologi vävnad med Fluorescently märkta SNAJDARN240
<ol><li>För att erhålla vävnad för histopatologi, fixa vävnad/biopsi sektioner i en lämplig volym av 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) för 30 min upp till 4 timmar bero...

<ol>
	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Nicol&#225;s-&#193;vila, J. &. #. 1. 9. 3. ;., Adrover, J. M., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+Homeostasis,+Immunity,+and+Cancer.">Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer.</a> Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).</li><li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer:+neutral+no+more.">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li><li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases.">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li><li>Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+redox+stress+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+disease.">Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. , (2018).</li><li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granules+of+the+human+neutrophilic+polymorphonuclear+leukocyte.">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li><li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils,+from+marrow+to+microbes.">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li><li>Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Ly6C/Ly6G-based+strategy+to+analyze+the+mouse+splenic+myeloid+compartment.">A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).</li><li>Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6G++neutrophils+are+dispensable+for+defense+against+systemic+Listeria+monocytogenes+infection.">Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection.</a> Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).</li><li>Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+mediate+antibody-induced+antitumor+effects+in+mice.">Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice.</a> Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).</li><li>Anderson, M. C., Chaze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUB40+Binds+to+Lactoferrin+and+Stands+as+a+Specific+Neutrophil+Marker.">MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker.</a> Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).</li><li>Co&#239;c, Y. -. M., Baleux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+specific+colonic+mucus+marker+using+a+human+commensal+bacterium+cell+surface+domain.">Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).</li><li>Roos, S., Jonsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-molecular-mass+cell-surface+protein+from+Lactobacillus+reuteri+1063+adheres+to+mucus+components.">A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components.</a> Microbiology. 148, 433-442 (2002).</li><li>Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+proteins+with+a+mucus-binding+domain+found+exclusively+in+lactic+acid+bacteria.">Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria.</a> Microbiology. 152, 273-280 (2006).</li><li>Mancardi, D. A., J&#246;nsson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+The+murine+high-affinity+IgG+receptor+Fc&#947;RIV+is+sufficient+for+autoantibody-induced+arthritis.">Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor Fc&#947;RIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis.</a> Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).</li><li>Walmsley, S. R., Print, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+neutrophil+survival+is+mediated+by+HIF-1alpha-dependent+NF-kappaB+activity.">Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).</li><li>Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoxia+and+glucose+supplementation+preserve+neutrophil+viability+and+function.">Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function.</a> Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).</li></ol>

Här beskrivs två analyser där SNAJDARN240 peptiden används för att studera neutrofil inflammation och aktivering. Vi visar hur SNAJDARN240 kan avslöja neutrofiler föreligger i histopatologi sektioner eller visa sin aktiveringstillstånd att använda levande renat neutrofiler. De kritiska steg för att använda SNAJDARN240 som en färgning reagens är samma som med alla andra fluorescerande detektionsmetod. Var noga med att säkerställa kompatibilitet av fluorescerande signaler och...

Neutrofiler är en av de primära vapen av det medfödda immunsystemet och rekryteras rutinmässigt till platser i inflammation runt kroppen. Studien av neutrofilerna har varit i hög grad nedsatt genom sin korta livslängd i vitro (mindre än 8 h) och begränsad identifieringsverktyg under basala förhållanden eller efter aktiveringen. Här presenterar vi en väl testad protokoll för den breda och specifikt påvisande av däggdjur neutrofiler i fasta/permeabilized prover. Vi ger också ett detaljerat protokoll för färgning levande neutrofiler med SNAJDARN240. Genom att använda protokollet för levande neutrofila färgning, kan tidpunkten och platsen för neutrofil aktivering vara identifierat. Detta protokoll är idealisk för forskare som vill studera neutrofil aktivering eller granule release. Bortom deras antimikrobiella funktioner uppskattas nu neutrofiler som immunmodulerande celler involverade i ett stort antal sjukdomar och immunsvar (medfödd och adaptiv)1,2. Neutrofiler är närvarande i den inflammatoriska vävnader, på kicken numrerar i infekterade vävnader, i inflammatoriska tumörer3, under IBS och Crohns flare-ups4, och i områden av icke-infektiös inflammation såsom synovia av reumatoid artrit ( RA) patienter5. Neutrofiler innehåller fyra klasser redan bildade granulat heter azurophil (α), specifika (β1), tertiär (β2) granulat och sekretoriska vesiklar (γ)6. Vid migrering till en inflammatorisk webbplats, rekryteras neutrofiler aktiveras och utsöndrar sekventiellt granule tillfredsställer (bestående av vidhäftning, antimikrobiella föreningar och immunmodulerande molekyler), som främjar ytterligare rekrytering och bidrar till infektion resolution (men även till värd vävnadsskada)7. Medan neutrofiler anses vara en viktig aspekt av den medfödda immuniteten, hittills det är några upptäckt reagenser tillgängliga att studera dem, och ännu färre som kan användas för att bedöma tillståndet aktivering av levande neutrofiler.
Nuvarande metoder för att upptäcka neutrofiler lita på monoklonala antikroppar genereras mot cellytan exponerade antigener, såsom Ly - 6 G2 eller proteiner specifikt lagras i neutrofila granulat under basala förhållanden (t.ex. myeloperoxidas Laktoferrin). Fördelarna med monoklonala antikroppar är deras starka bindning, känslighet och mångsidighet olika assay villkor. Dock finns det flera nackdelar med att använda monoklonala antikroppar och anti-Ly - 6G i synnerhet. Dessa nackdelar inkluderar specificitet, Ly - 6G är närvarande på en majoritet av myeloida celler i benmärgen och på alla granulocyter inklusive eosinofiler; dechiffrera neutrofiler från eosinofiler med denna markör kräver alltså, mer komplex närmar sig8. En annan frekvent nackdelen med monoklonala antikroppar är deras ofta begränsad specificitet spektrum försvårar jämförelsen studier med mer än en djurart. En tredje nackdel av antikropp detektionsmetoder, särskilt när användande levande celler eller in vivo, är deras potential att störa cellernas funktion eller leda till cellaktivering. Exempelvis är administrationen av anti-Ly - 6G till möss vanligen tillämpas på neutrofila utarmning och övergående neutropeni9. Det har dessutom visat att antikroppen injektion kan stimulera neutrofila antitumöreffekt funktion10. Påvisande av antikroppar av neutrofiler avslöjar slutligen inte tillståndet aktivering av cellen.
Vi har identifierat en 40-amino acid peptid som kallas SNAJDARN240, som kan användas i ett antal analyser till etikett neutrofiler in vitro- eller in-vivo villkor samt assay aktiveringen ställningen av levande neutrofiler11. SNAJDARN240 härleds från SNAJDARN27012, en domän av Lactobacillus reuteri ytan slem-bindande protein ursprungligen beskrevs för dess förmåga att binda slem13,14. SNAJDARN240 interagerar med glykosylerat Laktoferrin som är närvarande vid höga koncentrationer i neutrofiler-specifika och tertiär granulat. SNAJDARN240 kan utsättas för dessa granulat genom standard vilket steg i histopatologi eller fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) protokoll för robust färgning av fasta neutrofiler. När levande neutrofiler hålls i ett inaktiverat tillstånd, SNAJDARN240 peptiden utesluts från granule innehållet och celler fläckar inte positivt med markören. Vid aktivering, kan SNAJDARN240 binda till exponerade Laktoferrin och leda till robust färgning med peptiden. SNAJDARN240 kan således användas för att avgöra aktiveringstillstånd för renat neutrofiler, vilket gör det till en attraktiv markör att följa smittsamma processen. Förmågan att binda till live-aktiverade neutrofiler kan också SNAJDARN240 att användas som ett verktyg för att identifiera områden av neutrofil inflammation i levande djurmodeller (t.ex. en mus artrit modell15). Protokollen i denna manuskriptet detalj hur fluorescently märkt SNAJDARN240 kan användas för att avslöja neutrofiler i histologi vävnader och hur till assay aktivering av levande renat neutrofiler i vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="894">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">MUB40-Cy5</td>
			<td style="width:123px;">Benoit Marteyn</td>
			<td style="width:344px;">benoit.marteyn@pasteur.fr</td>
			<td style="width:167px;">Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RI-MUB40-Cy5</td>
			<td>Benoit Marteyn</td>
			<td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td>
			<td>Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Parformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">16005</td>
			<td>Fixative for histology</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Solution used to remove excess PFA</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td align="right">4583</td>
			<td>Used to freeze tissue before cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-Methylbutane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M32631</td>
			<td>Used to freeze tissue before cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">1.00974</td>
			<td>Used for dry ice bath to freeze tissue</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Leica Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1520</td>
			<td>Used to section tissues</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass microscopy slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-518-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cover slips</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>CG15CH</td>
			<td>Hi precision coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dako pen&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td>Used to prevent liquid loss during tissue staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">47036</td>
			<td>Used to permeabilize cells for IF staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">10236276001</td>
			<td>Stains DNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa fluor 488 Phalloidin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Binds actin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prolong Gold antifade Mountant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Prolongs IF signal and resistance to photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluorescent microscope</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Used to image IF slides</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anoxic Cabinet</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Used for the purification of live inactivated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Chloride NaCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Washing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MACS BSA buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>Washing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4937</td>
			<td>Gradient for neutrophil purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD235a glycophorin magnetic microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-501</td>
			<td>Used to remove contaminating RBCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used in the removal of RBCs from neutrophils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 without Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8755</td>
			<td>Used for neutrophil assays</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mub40 peptide for use in detecting neutrophil-mediated inflammation events

Här, tillhandahåller vi ett protokoll som inbegriper användning av SNAJDARN240, en syntetiserade peptid med förmågan att binda glykosylerat Laktoferrin lagras vid höga koncentrationer i specifika och tertiär granulat av neutrofiler. Detta protokolldetaljer hur SNAJDARN240 konjugerat direkt till en fluorophore kan användas för att färga neutrofiler i fasta/permeabilized vävnader samt hur detta kan användas i live-cell imaging till assay för neutrofil aktivering och avinstallation granulering. Neutrofila detekteringsmetoderna är begränsad till artspecifika monoklonala antikroppar, som inte alltid är lämpliga för vissa applikationer. SNAJDARN240 tränger inte cellmembranet och är därmed undantagna från Laktoferrin lagras i icke-aktiverad/icke-permeabilized neutrofiler. SNAJDARN240 har fördelen av att erkänna Laktoferrin från ett brett spektrum, vilket gör det särskilt användbart för att jämföra resultaten i studier med flera forskningsmodeller, att minska antalet duplicerade reagenser och förenkla protokoll genom steg färgning.

Resultaten av SNAJDARN240-färgade vävnader från histopatologi bilder brukar avslöja enskilda celler utspridda i vävnaden. SNAJDARN240 fläckar Laktoferrin, som är närvarande i neutrofila granulat och uppdelade. Således normalt sett punktuell färgning eller flera stora avskilda områden av signal kommer från enskilda neutrofiler (figur 1). Det är bra att lägga till en andra cell markör såsom DAPI att hjälpa Co lokalisera SN...

Watch this Scientific Journal Video about The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events at JoVE.com

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

Här presenterar vi ett protokoll för att upptäcka förekomsten av neutrofiler i fasta/permeabilized histologi sektioner och bedöma aktivering av levande renat neutrofiler. I synnerhet binder SNAJDARN240 peptiden Laktoferrin närvarande i neutrofiler-specifika och tertiär granulat. Exponering av granule innehållet antingen genom permeabilisering eller neutrofil aktivering möjliggör märkning av neutrofiler.

SNAJDARN240 peptiden för användning i att upptäcka neutrofiler-medierad Inflammation händelser

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

MUB40 är en ny neutrofil markör, som binder till laktoferrin och möjliggör en specifik upptäckt i mänskliga och alla däggdjur vävnadsprov testas hittills. Att märka neutrofiler med MUB40 är enkelt, snabbt och specifikt. Det är nu används i stor utsträckning i vårt labb och innebörden av denna teknik sträcker sig mot diagnos av inflammatoriska sjukdomar.Till att börja med förbereda lösningar ett, två och tre enligt textprotokollet, och placera dem i ett anoxiskt skåp över natten. Sedan centrifugera rören av uppsamlat blod vid 650 g i 20 minuter för att separera cellerna från plasmafraktionen. Utan att störa det separerade blodet, överför rören till anoxiska skåpet och överför plasmafraktionerna till ett 50 milliliter koniskt rör.Efter detta ta bort röret av plasma från anoxic skåpet och centrifug det på 2900 g i 20 minuter. Var noga med att inte störa de pelleterade blodplättarna, överför röret till anoxiska skåpet och pipettera trombocytfattig plasma till ett nytt 50 milliliterrör. Med hjälp av blodinsamlingsrören, kombinera de röda blodkropparna i en konisk 50 milliliter tub.Tillsätt sedan 0,9%natriumkloridlösning tills den totala volymen når 44 milliliter, och tillsätt sex milliliter 6%dextran. Invertera röret 10 till 20 gånger för att försiktigt blanda blodet och dextran blandningen, och låt röret att sediment i minst 30 minuter. Medan röret sediment, förbereda en Percoll gradient genom att lägga till 4,2 milliliter Percoll lösning till 5,8 milliliter plasma, och invertera röret för att blanda.Därefter samla neutrofil som innehåller översta fraktionen av dextran, var noga med att inte pipettera röda blodkroppar. Dra åt skruvlocket, ta bort dextranröret från anoxiska skåpet, och centrifug röret vid 300 g i 10 minuter. Var noga med att inte störa de pelleterade cellerna, placera röret tillbaka i anoxic skåpet.Ta sedan bort vätskan genom pipettering. Försiktigt återanvända pelleten i en milliliter plasma. Tillsätt långsamt de återanvända cellerna till percoll-lösningens toppar.Ta försiktigt bort Percoll-lösningsröret från anoxiska skåpet och centrifugera det på 800 g i 20 minuter för att separera PBMCs från neutrofiler. Därefter förbereder du 14 milliliter tvättbuffertlösning enligt textprotokollet. Placera sedan Percoll-röret i anoxiska skåpet.Använd en pipett för att ta bort Percoll och PBMCs och återanvänd neutrofil som innehåller pellet i en milliliter av tvättbuffertlösning. Därefter lägger du till 200 mikroliter av magnetiska pärlor till de återanvända cellerna. Blanda försiktigt och inkubera cellerna och pärlorna i minst 15 minuter.Efter detta, tvätta en separationspelare två gånger, med två milliliter av tvättbuffert. Medan du håller en ny, 15 milliliter koniska röret under kolonnen, långsamt pipettera neutrofil röda blodkroppar blandningen genom kolonnen. Flödet-through från kolumnen bör vara grumlig och förlora sin röda färg, bekräftar den totala separationen av neutrofiler från återstående röda blodkroppar.Lägg till två milliliter av tvättbuffert till toppen av kolumnen och samla in genomflödet i samma rör. I slutet av denna tvätt bör genomflödet vara klart. Blanda försiktigt uppsamlingsröret för att säkerställa att neutrofilerna är jämnt fördelade.Därefter samlades 10 mikroliter av flödet genom från cellräkning. Efter detta, ta bort neutrofilröret från anoxiska skåpet och centrifug röret vid 300 g i 20 minuter. Placera tillbaka de sedimenterade neutrofilerna i anoxiska skåpet och ta bort tvättbufferten via pipettering.Sedan, resuspend pelleten i plasma. Lägg till en mikroliter av RI-MUB40-Cy5 till en milliliter av RPMI-1640 medium, utan fenolröd, och blanda via pipettering. Lägg sedan till en mikroliter fmlp-lösning och pipetter för att blanda.Överför blandningen till en glasbotten mikroskopi skålen. Tillsätt sedan en lämplig volym av renade celler till skålen. Slutligen placera skålen i en inverterad fluorescerande mikroskop och börja bild förvärv.I detta protokoll användes MUB40 på levande celler för att upptäcka neutrofil utsöndring vid simulering med FMLP. Dynamiken i frisättningen av granulathalt, inklusive laktokrin, kan visualiseras över tiden, här i magenta. MUB40 kan dessutom användas på fasta neutrofiler.Här, fagocytizing fluorescerande pärlor i en tidsbetonad serie. Neutrofilgranulatets innehåll är märkt här i blått. De neutrophils visade liten till ingen cell färgning på tidiga tidpunkter och gradvis, RI-MUB40 märkning ökade med tiden, både på plasmamembranet och pärla yta.MUB40 kan också användas på fasta inflammatoriska vävnader för att upptäcka neutrofiler specifikt, vilket framgår av textfigurerna. Vi beskriver här neutrofil reningsproceduren, tillämpas rutinmässigt i vårt labb. Någon annan metod är lämplig, MUB40-Cy5 märkning kommer fortfarande att fungera.Neutrofil kan vara specifikt märkt med MUB40 efter rening, eller direkt i inflammerad vävnad från patienter eller djurmodeller. Flera MUB40-derivat har utformats för att bredda dess användning. Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom inflammationsområdet, att utforska neutrofila rekrytering och aktivering vid inflammatoriska sjukdomar.

Research

JoVE Journal

Biology

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

Användningen av Biofeedback i klinisk Virtual Reality: Intrepid Project

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenes och funktionsanalys av jonkanaler Uttryckt Heterologously i däggdjursceller

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET mikroskopi för realtidsövervakning av signalering händelser i levande celler Använda unimolekylära Biosensorer

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Användning av kemostater i Microbial Systembiologi

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Levande cell imaging av Early autophagy Evenemang: Omegasomes och Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Identifiera protein-proteininteraktion webbplatser Använda peptid Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Spatiotemporal Analys av Cytokinetic händelser i fissionsjäst

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Karakterisering av förkalkning händelser Använda Live Optiska och elektronmikroskopi tekniker i en marin Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

Att upptäcka östrogena ligander i personliga hygienprodukter använder en jäst östrogen skärmen optimerad för grundutbildning undervisning laboratoriet

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Att upptäcka det Borrelia Spirochete, Borrelia Burgdorferi, i fästingar med nästlade PCR

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...