Name: the mub40 peptide for use in detecting neutrophil-mediated inflammation events
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events at JoVE.com

Bu eser Fondation Laurette Fugain (Eğer-2015-15) (B.S.M.) tarafından desteklenen ve ANR JCJC (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.) verir.

Tüm yöntem tanımlamak burada gözden geçirilmiş ve onaylanmış Fransız kuruluşlarca CoRC (Comite de Recherche Clinique), CPP (Comite de koruma des Personnes) ve CNIL (komisyon Nationale Informatique et Liberté).
1. Fluorescently nötrofil histopatoloji doku ile boyama MUB40 etiketli
<ol><li>Histopatoloji için doku elde etmek için en fazla 4 h örnek kalınlığına bağlı olarak doku/biyopsisi bölümleri % 4 paraformaldehyde (PFA) 30 dk için uygun bir birimdeki düze...

<ol>
	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Nicol&#225;s-&#193;vila, J. &. #. 1. 9. 3. ;., Adrover, J. M., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+Homeostasis,+Immunity,+and+Cancer.">Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer.</a> Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).</li><li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer:+neutral+no+more.">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li><li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases.">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li><li>Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+redox+stress+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+disease.">Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. , (2018).</li><li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granules+of+the+human+neutrophilic+polymorphonuclear+leukocyte.">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li><li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils,+from+marrow+to+microbes.">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li><li>Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Ly6C/Ly6G-based+strategy+to+analyze+the+mouse+splenic+myeloid+compartment.">A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).</li><li>Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6G++neutrophils+are+dispensable+for+defense+against+systemic+Listeria+monocytogenes+infection.">Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection.</a> Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).</li><li>Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+mediate+antibody-induced+antitumor+effects+in+mice.">Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice.</a> Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).</li><li>Anderson, M. C., Chaze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUB40+Binds+to+Lactoferrin+and+Stands+as+a+Specific+Neutrophil+Marker.">MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker.</a> Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).</li><li>Co&#239;c, Y. -. M., Baleux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+specific+colonic+mucus+marker+using+a+human+commensal+bacterium+cell+surface+domain.">Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).</li><li>Roos, S., Jonsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-molecular-mass+cell-surface+protein+from+Lactobacillus+reuteri+1063+adheres+to+mucus+components.">A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components.</a> Microbiology. 148, 433-442 (2002).</li><li>Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+proteins+with+a+mucus-binding+domain+found+exclusively+in+lactic+acid+bacteria.">Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria.</a> Microbiology. 152, 273-280 (2006).</li><li>Mancardi, D. A., J&#246;nsson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+The+murine+high-affinity+IgG+receptor+Fc&#947;RIV+is+sufficient+for+autoantibody-induced+arthritis.">Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor Fc&#947;RIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis.</a> Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).</li><li>Walmsley, S. R., Print, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+neutrophil+survival+is+mediated+by+HIF-1alpha-dependent+NF-kappaB+activity.">Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).</li><li>Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoxia+and+glucose+supplementation+preserve+neutrophil+viability+and+function.">Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function.</a> Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).</li></ol>

Burada, iki deneyleri MUB40 peptid nötrofil inflamasyon ve harekete geçirmek için kullanılan açıklanır. Biz nasıl MUB40 nötrofil histopatoloji bölümlerde ya da canlı arıtılmış nötrofil kullanarak onların harekete geçirmek durum göstermek-ebilmek açığa vurmak göstermek. MUB40 boyama reaktifi kullanmak için kritik adımlar olarak başka bir floresan algılama yöntemi ile aynıdır. Floresan sinyallerin ve güncelliği ve yeterli çamaşır adımlar arka plan boyama...

Nötrofil bir doğuştan gelen bağışıklık sisteminin birincil silah ve rutin olarak inflamasyon vücut etrafında siteler için işe. Nötrofil çalışma büyük ölçüde bozulmuş onların kısa ömrü vitro (az 8 h) ve sınırlı algılama araçları bazal koşullar altında veya aktivasyon sonra olmuştur. Burada, sabit/permeabilized örneklerinde memeli nötrofil geniş ve belirli algılanması için iyi sınanmış bir protokol mevcut. Ayrıca canlı nötrofil MUB40ile boyama için detaylı bir protokol sağlar. Canlı nötrofil boyama iletişim kuralını kullanarak, zamanlama ve nötrofil harekete geçirmek konumunu kesin olarak belirlemiş. Bu iletişim kuralı nötrofil harekete geçirmek ya da granül yayın eğitim almak isteyen araştırmacılar için idealdir. Antimikrobiyal işlevlerini, nötrofil şimdi immunomodulatory hücreler çeşitli hastalıklar ve immün yanıt (doğuştan gelen ve edinilmiş)1,2yer olarak takdir edilmektedir. Nötrofil yüksek numaralarından enfekte dokularda, inflamatuar tümörler3, IBS ve Crohn flare-up4sırasında ve romatoid artrit (synovia gibi bulaşıcı olmayan iltihap alanlarında en inflamatuar doku mevcut RA) hastalar5. Nötrofil önceden biçimlendirilmiş granül azurophil (α), özel (β1), Tersiyer (B2) granülleri ve salgı veziküller (γ)6adlı dört sınıfları içerir. Geçiş inflamatuar sitesine üzerine işe nötrofil aktif hale ve sırayla granül içeriği daha fazla istihdamı teşvik ve katkıda bulunur (yapışma, antimikrobiyal bileşikleri ve immunomodulatory molekülleri oluşan), salgılar enfeksiyon çözünürlük (aynı zamanda için ana bilgisayar doku hasarı)7. Nötrofil olarak kabul edilir süre önemli bir özelliği, orada bugüne kadar doğuştan gelen bağışıklık kaç algılama reaktifler onlara eğitim kullanılabilir, ve hatta daha az bu yaşam nötrofil etkinleştirme durumunu değerlendirmek için kullanılabilir.
Monoklonal antikor Ly - 6 G2 veya özel olarak nötrofil granül bazal koşullar (Örneğin, myeloperoxidase altında depolanan proteinler gibi hücre yüzeyine maruz antijenlere karşı oluşturulan nötrofil tespit geçerli yöntemleri itimat Laktoferrin). Onların güçlü bağlama, ışık hassasiyeti ve çeşitli tahlil koşullarda çok yönlülük monoklonal antikorlar avantajları şunlardır. Ancak, özellikle kullanarak monoklonal antikorlar ve anti-Ly - 6 G birçok downsides vardır. Ly - 6 G mevcut myeloid hücrelerin bir çoğunluğu kemik iliği ve Eozinofiller de dahil olmak üzere tüm granülosit olduğu gibi bu downsides özgüllüğü, içerir; Böylece, nötrofil eozinofil üzerinden bu marker ile deşifre daha fazla kompleksleri yaklaşımlar8gerektirir. Başka bir sık tradeoff monoklonal antikorlar ile birden fazla hayvan türleri ile karşılaştırma çalışmaları zorlaştırıyor onların kez sınırlı ana özgüllük, aralıktır. Üçüncü ise bir antikor algılama yöntemleri özellikle canlı hücreleri veya içinde vivo kullanırken, hücre işlevi bozabilir veya hücre aktivasyonu için kurşun potansiyellerini dezavantajıdır. Örneğin, yönetim, anti-Ly - 6G farelere yaygın nötrofil tükenmesi ve geçici nötropeni9uygulanır. Ayrıca antikor enjeksiyon nötrofil antitümör işlev10teşvik edebilir kanıtlanmıştır. Son olarak, antikor algılama nötrofil hücre etkinleştirme durumunu ortaya koymuyor.
Biz 40-amino asit peptid MUB40deneyleri bir sayısını nötrofil vitro ve in vivo koşulları altında etiket gibi canlı nötrofil11etkinleştirme durumunu tahlil için kullanılabilir, denilen belirledik. MUB40 MUB7012, aslında onun yetenek mukus13,14bağlamak için açıklanan Lactobacillus reuteri yüzey mukus-bağlayıcı proteinin bir etki elde edilir. MUB40 nötrofil özgü ve Tersiyer granül yüksek konsantrasyonlarda bulunur glikozile Laktoferrin ile etkileşim kurar. MUB40 histopatoloji veya floresan aktif hücre sağlam sabit nötrofil boyama için (FACS) iletişim kuralları sıralama mevcut standart permeabilization adımlarda bu tanecikler için gösterilebilir. Canlı nötrofil Inaktif bir durumda tutulur MUB40 peptid granül içeriğinden söz konusu değildir ve hücreleri marker ile pozitif leke değil. Harekete geçirmek MUB40 maruz laktoferrin bağlamak ve sağlam ile peptid boyama için yol. Böylece, MUB40 arıtılmış nötrofil, yapım o bulaşıcı süreci takip etmek çekici bir işaretleyici etkinleştirme durumunu belirlemek için kullanılabilir. Aktif nötrofil yaşamak için bağlama yeteneği aynı zamanda canlı hayvan modellerinde (Örneğin, bir fare artrit modeli15) nötrofil iltihap alanları tespit etmek için bir araç olarak kullanılacak MUB40 sağlar. Bu el yazması ayrıntılı nasıl fluorescently MUB40 etiketli iletişim kuralları nötrofil Histoloji doku ve nasıl canlı arıtılmış nötrofil vitroaktivasyonu tahlil ortaya çıkarmak için kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="894">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">MUB40-Cy5</td>
			<td style="width:123px;">Benoit Marteyn</td>
			<td style="width:344px;">benoit.marteyn@pasteur.fr</td>
			<td style="width:167px;">Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RI-MUB40-Cy5</td>
			<td>Benoit Marteyn</td>
			<td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td>
			<td>Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Parformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">16005</td>
			<td>Fixative for histology</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Solution used to remove excess PFA</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td align="right">4583</td>
			<td>Used to freeze tissue before cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-Methylbutane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M32631</td>
			<td>Used to freeze tissue before cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">1.00974</td>
			<td>Used for dry ice bath to freeze tissue</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Leica Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1520</td>
			<td>Used to section tissues</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass microscopy slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-518-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cover slips</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>CG15CH</td>
			<td>Hi precision coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dako pen&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td>Used to prevent liquid loss during tissue staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">47036</td>
			<td>Used to permeabilize cells for IF staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">10236276001</td>
			<td>Stains DNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa fluor 488 Phalloidin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Binds actin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prolong Gold antifade Mountant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Prolongs IF signal and resistance to photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluorescent microscope</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Used to image IF slides</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anoxic Cabinet</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Used for the purification of live inactivated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Chloride NaCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Washing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MACS BSA buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>Washing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4937</td>
			<td>Gradient for neutrophil purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD235a glycophorin magnetic microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-501</td>
			<td>Used to remove contaminating RBCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used in the removal of RBCs from neutrophils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 without Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8755</td>
			<td>Used for neutrophil assays</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mub40 peptide for use in detecting neutrophil-mediated inflammation events

Burada, biz MUB40, yüksek konsantrasyonlarda nötrofil özel ve Tersiyer granül depolanan glikozile laktoferrin bağlama yeteneği ile sentezlenmiş bir peptid kullanımını içeren bir protokol sağlar. Nasıl Birleşik MUB40 doğrudan bir fluorophore için bu protokolü ayrıntıları bu canlı hücre Imaging'de nötrofil etkinleştirme ve de-granülasyon için tahlil için kullanılabilir ne kadar sabit/permeabilized dokularda de nötrofiller leke için kullanılabilir. Nötrofil algılama yöntemleri her zaman bazı uygulamalar için uygun değildir species-specific monoklonal antikorlar sınırlı olmalıdır. MUB40 hücre zarı nüfuz etmez ve böylece sigara-aktif/sigara-permeabilized nötrofil içinde depolanan laktoferrin üzerinden söz konusu değildir. MUB40 tane laktoferrin geniş ana bilgisayar aralığından, özellikle birden fazla araştırma modeli, ilgili çalışmalarda sonuçları karşılaştırmak için faydalı hale tanıma yararı yinelenen reaktifler sayısını azaltarak ve protokolleri kolaylaştırarak tek adım boyama yoluyla.

Sonuçları MUB40-histopatoloji slaytlardan lekeli dokular genellikle tek tek hücreleri doku dağınık ortaya. MUB40 lactoferrin, nötrofil granül bulunması ve bölümlere olan leke bırakır. Böylece, tipik olarak görülen punctate boyama veya sinyal çeşitli büyük ayrılmış alanlarda bireysel nötrofil (Şekil 1) geliyor. DAPI MUB40 sinyal lekeli hücre ile birlikte yerelleştirilmesine yardımcı gibi ikinci bir ...

Watch this Scientific Journal Video about The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events at JoVE.com

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

Burada, sabit/permeabilized Histoloji bölümlerde nötrofil var olup olmadığını belirlemek ve canlı arıtılmış nötrofil etkinleştirme durumunu değerlendirmek için bir protokol mevcut. Özellikle, MUB40 peptid laktoferrin nötrofil özgü ve Tersiyer granül mevcut bağlar. Pozlama permeabilization veya nötrofil harekete geçirmek granül İçindekiler nötrofil işaretleme için sağlar.

MUB40 peptid nötrofil aracılıklı iltihaplanma olayları algılama kullanmak için

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

MUB40, laktoferrin'e bağlanan ve şimdiye kadar test edilen insan ve tüm memeli doku örneklerinde spesifik bir tespite olanak tanıyan yeni bir nötrofil belirtecidir. Nötrofilleri MUB40 ile etiketlemek kolay, hızlı ve özeldir. Şimdi bizim laboratuvarda yaygın olarak kullanılan ve bu tekniğin etkisi inflamatuar hastalıkların tanısı doğru uzanır.Başlamak için, metin protokolüne göre bir, iki ve üç numaralı çözümleri hazırlayın ve bunları bir gecede anoksik bir kabine yerleştirin. Daha sonra, 650 g'de toplanan kan tüplerini 20 dakika santrifüj edin ve hücreleri plazma fraksiyonundan ayırın. Ayrılmış kanı bozmadan tüpleri anoksik kabine aktarın ve plazma fraksiyonlarını 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.Bundan sonra anoksik dolaptan plazma tüpünü çıkarın ve 20 dakika boyunca 2900 g santrifüj. Peletli trombositleri bozmamaya özen gösteriyor, tüpü anoksik kabine aktarın ve trombosit zayıf plazmasını 50 mililitrelik taze bir tüpe aktarın. Kan toplama tüpleri kullanarak, konik 50 mililitrelik tüp kırmızı kan hücreleri birleştirmek.Daha sonra, toplam hacmi 44 mililitre ulaşana kadar% 0.9 sodyum klorür çözeltisi ekleyin ve% 6 dekstran altı mililitre ekleyin. Kan ve dekstran karışımını hafifçe karıştırmak için tüpü 10 ila 20 kez ters çevirin ve tüpün en az 30 dakika tortu letmesine izin verin. Tüp tortuları iken, plazma 5.8 mililitre percoll çözeltisi 4.2 mililitre ekleyerek bir Percoll gradyan hazırlamak ve karıştırmak için tüp ters.Daha sonra, dextran üst kısmını içeren nötrofil toplamak, pipet kırmızı kan hücreleri için değil dikkat. Vida kapağını sıkın, dekstran tüpünü anoksik dolaptan çıkarın ve tüpü 300 g'da 10 dakika santrifüj edin. Peletli hücreleri rahatsız etmemeye özen gösteriyor, tüpü anoksik kabine geri yerleştirin.Daha sonra, pipetleme ile sıvı çıkarın. Bir mililitre plazmadaki peleti yavaşça askıya alın. Yavaş yavaş Percoll çözeltisinin üstlerine resuspended hücreleri ekleyin.Percoll çözelti tüpünü anoksik dolaptan dikkatlice çıkarın ve 800 g'da 20 dakika boyunca nötrofillerden ayırmak için santrifüj edin. Daha sonra, metin protokolüne göre 14 mililitre yıkama tampon çözeltisi hazırlayın. Sonra, anoksik kabine Percoll tüp yerleştirin.Percoll ve PBMCs kaldırmak ve yıkama tampon çözeltisi bir mililitre içinde pelet içeren nötrofil yeniden askıya almak için bir pipet kullanın. Sonra, yeniden askıya alınan hücrelere 200 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin. Hücreleri ve boncukları en az 15 dakika karıştırıp kuluçkaya yatırın.Bundan sonra, iki mililitre yıkama tamponu ile iki kez ayırma sütunu yıkayın. Sütunun altında yeni, 15 mililitrelik konik bir tüp tutarken, yavaş yavaş kolon aracılığıyla nötrofil kırmızı kan hücresi karışımı pipet. Sütundan akan bulutlu olmalı ve kırmızı rengini kaybetmeli, nötrofillerin kalan kırmızı kan hücrelerinden tamamen ayrıştığını doğrular.Sütunun üst kısmında yıkama tampon iki mililitre ekleyin ve aynı tüp içinde akış toplamak. Bu yıkamanın sonunda, akış açık olmalıdır. Nötrofillerin eşit olarak dağıtıldığından emin olmak için toplama tüpünü yavaşça karıştırın.Daha sonra hücre sayma akışı ndan 10 mikrolitre toplandı. Bundan sonra, anoksik dolaptan nötrofil tüp çıkarın ve 20 dakika boyunca 300 g tüp santrifüj. Tortulanmış nötrofilleri anoksik kabine geri yerleştirin ve pipetleme yoluyla yıkama tamponu çıkarın.Sonra, plazmadaki peleti askıya alın. BIR mikrolitre RI-MUB40-Cy5'i bir mililitre RPMI-1640 ortamına, fenol kırmızısı olmadan ekleyin ve pipetleme yoluyla karıştırın. Daha sonra, karıştırmak için FMLP çözeltisi ve pipet bir mikrolitre ekleyin.Karışımı cam alt mikroskopi kabına aktarın. Sonra çanak saflaştırılmış hücrelerin uygun bir hacim ekleyin. Son olarak, ters floresan mikroskobun içine çanak yerleştirin ve görüntü edinimi başlar.Bu protokolde, MUB40 FMLP ile simülasyon üzerine nötrofil salgısını saptamak için canlı hücreler üzerinde kullanılmıştır. Laktoferrin de dahil olmak üzere granül içeriğinin serbest bırakılması dinamikleri, zaman içinde görselleştirilmiş olabilir, burada macenta. MUB40 ayrıca sabit nötrofillerde de kullanılabilir.Burada, zamanlanmış bir seride fagosiyefle floresan boncuklar. Nötrofil granül içeriği burada mavi olarak etiketlenmiştir. Nötrofiller erken zaman noktalarında hücre boyaması çok az gösterdi ve yavaş yavaş, RI-MUB40 etiketleme zaman içinde arttı, plazma membran ve boncuk yüzeyinde hem de.MUB40, metin şekillerinde gösterildiği gibi nötrofillerin özellikle saptanması için sabit inflamatuar dokularda da kullanılabilir. Burada laboratuarımızda rutin olarak uygulanan nötrofil arınma prosedürünü anlatıyoruz. Başka bir yöntem uygundur, MUB40-Cy5 etiketleme hala çalışacaktır.Nötrofil özellikle arınma sonrası MUB40 ile etiketlenebilir, ya da doğrudan hasta veya hayvan modellerinden iltihaplı doku. Kullanımı genişletmek için çeşitli MUB40 türevleri tasarlanmıştır. Gelişiminden sonra, bu teknik inflamasyon alanında araştırmacı için yol açtı, inflamatuar hastalıklarda nötrofilik işe ve aktivasyon keşfetmek için.

Research

JoVE Journal

Biology

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

Klinik Sanal Gerçeklik Biofeedback kullanımı: INTREPID Projesi

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Mikrobiyal Systems Biyoloji Chemostats Kullanımı

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Erken Otofaji Etkinlikler Hücre Görüntüleme Canlı: Omegasomes ve Ötesi

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Fisyon Maya Cytokinetic Olayların zamanmekansal Analizi

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Bir Deniz Tubeworm Canlı Optik ve Elektron Mikroskobu Teknikleri Kullanılarak kalsifikasyon Olaylar Karakterizasyonu

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

Kişisel bakım ürünleri için lisans öğretim laboratuvar bir maya östrojen ekran optimize kullanarak östrojenik ligandlar saptamak

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

İç içe geçmiş PCR kullanarak keneler Lyme hastalığı Sfilis, Borrelia Burgdorferi, algılama

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...