Name: synthesis and structure determination of &#181;-conotoxin piiia isomers with different disulfide connectivities
Uploaded: 2018-10-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Structure Determination of Ã‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities at JoVE.com

אנחנו רוצים להודות Resemann א פ י מאייר, ד Suckau של ברוקר Daltonics GmbH ברמן; ד ההרחבה של טיצה, ההרחבה של טיצה א א, Schmidts ו', ג למפשעה מאוניברסיטת דרמסטאדט של טכנולוגיה; O. Ohlenschläger מ יינה כאשר שגיא, Engeser מ מ באוניברסיטת בון; ק' קרמר, Harzen א ו ה Nakagami של מכון מקס פלנק למחקר גידול הצמח, קלן; Susanne Neupert ממכון זואולוגיה, קלן; למערכות ביולוגיות תהודה מגנטית ספקטרוסקופיה במתקני באוניברסיטת פרנקפורט טכנית, תמיכה, הדרכה מודולים, וגישה מכשירים. תמיכה כספית מאת באוניברסיטת בון כדי ד הוא הודה בהכרת תודה.

הערה: כל חומצות האמינו המשמשות בתקנון היו בתצורה-L. הקיצורים של חומצות אמינו, חומצות אמיניות נגזרים שימשו על-פי ההמלצות של ועדת המינוח אוהב את, הוועדה המשותפת סיסטמטי-אוהב את המינוח הביוכימי.
1. מוצק-שלב פפטיד סינתזה (SPPS)
הערה: לבצע הסינתזה עם סינתיסייזר פפטיד מו?...

<ol>
	<li>Fosgerau, K., Hoffmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+therapeutics:+Current+status+and+future+directions.">Peptide therapeutics: Current status and future directions.</a> Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).</li><li>Gongora-Ben&#237;tez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+disulfide+bonds.+peptides+as+therapeutics.">Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).</li><li>Tietze, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+diverse+&#181;-conotoxin+PIIIA+isomers+block+sodium+channel+NaV1.4.">Structurally diverse &#181;-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).</li><li>Carstens, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Activity+Studies+of+Cysteine-Rich+&#945;-Conotoxins+that+Inhibit+High-Voltage-Activated+Calcium+Channels+via+GABABReceptor+Activation+Reveal+a+Minimal+Functional+Motif.">Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich &#945;-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).</li><li>Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bridges:+Bringing+together+frustrated+structure+in+a+bioactive+peptide.">Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide.</a> Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).</li><li>Nielsen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+&#181;-conotoxin+PIIIA,+a+preferential+inhibitor+of+persistent+tetrodotoxin-sensitive+sodium+channels.">Solution structure of &#181;-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).</li><li>Heimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+&#181;-Conotoxin+PIIIA+Isomers+Revisited:+Impact+of+Cysteine+Pairing+on+Disulfide-Bond+Assignment+and+Structure+Elucidation.">Conformational &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation.</a> Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).</li><li>Chang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+pathways+of+oxidative+folding+of+disulfide+proteins:+Underlying+causes+and+folding+models.">Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models.</a> Biochemistry. 50 (17), 3414-3431 (2011).</li><li>B&#246;hm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+structure+and+function+of+factor+XIIIa-inhibitor+tridegin.">Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).</li><li>Postma, T. M., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+Formation+Strategies+in+Peptide+Synthesis.">Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).</li><li>Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid-Protecting+Groups.">Amino Acid-Protecting Groups.</a> Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).</li><li>Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bond+formation+in+peptides.">Disulfide bond formation in peptides.</a> Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).</li><li>Kamber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Synthesis+of+Cystine+Peptides+by+Iodine+Oxidation+of+S-Trityl-cysteine+and+S-Acetamidomethyl-cysteine+Peptides.">The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides.</a> Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).</li><li>Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Modulators+of+Regulator+of+G-Protein+Signaling+(RGS)+Proteins.">Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins.</a> Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).</li><li>Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regioselective+formation+of+multiple+disulfide+bonds+with+the+aid+of+postsynthetic+S-tritylation.">Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation.</a> Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).</li><li>Peigneur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#948;-conotoxins+synthesized+using+an+acid-cleavable+solubility+tag+approach+reveal+key+structural+determinants+for+NaV+subtype+selectivity.">&#948;-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).</li><li>Heimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Room-Temperature+Aprotic+and+Protic+Ionic+Liquids+for+Oxidative+Folding+of+Cysteine-Rich+Peptides.">Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides.</a> ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).</li><li>Kates, S. A., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , (2000).</li><li>W&#252;thrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+studies+of+structure+and+function+of+biological+macromolecules+(Nobel+lecture).">NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture).</a> Angewandte Chemie - International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).</li></ol>

שיטת המתוארים בזאת לסינתזה של ציסטאין עתירי פפטידים כגון ממוצע-PIIIA מייצג אפשרות לייצר באופן סלקטיבי בונדד דיסולפידי isomers של אותו רצף חומצות אמיניות. לכן, הוקמה שיטות כמו מוצק מבוססי Fmoc שלב הסינתזה פפטיד18 , אסטרטגיה מוגדרת קבוצה שיגן על היווצרות regioselective דיסולפידי חוב היו בשימו...

השימוש של פפטידים ביו התרופות במחקר ופיתוח מוכרת מאוד, משום שהם מייצגים תרכובת סלקטיבי מאוד חזק עבור מטרות ביולוגיות מוגדרות1. עבור אתריים שלהם, למבנה התלת ממדי זאת, חשיבות רבה על מנת לבצע פעילות מבנה היחסים מחקרים2,3,4. מלבד רצף חומצת אמינו העיקרי המשפיע על קונפורמציה הכוללת, חוב דיסולפידי משמעותית לייצוב המבנה של ציסטאין עתירי פפטידים5. פפטידים גשר דיסולפידי מרובים כוללים conotoxins כגון ממוצע-PIIIA מ פורפורסנס אשר מכיל שישה cysteines ברצף שלה. תוכן ציסטאין גבוהה זה באופן תיאורטי מאפשרת היווצרות של 15 isomers דיסולפידי. קישוריות דיסולפידי נכונה חשוב מאוד פעילות ביולוגית6,7. עם זאת, השאלה שעולה היא האם יש אחד או יותר קונפורמציה ביו פפטידים המתרחשים באופן טבעי, אם אז, אשר של isomers האלה יש הפעילות הביולוגית הגבוהה ביותר? במקרה של ממוצע-conotoxins, מטרות ביולוגיות הן תעלות יונים ממותגת מתח נתרן, ממוצע-PIIIA בפרט הוא החזק ביותר עבור סוגיV1.2, נה נהV1.4 ו- NaV1.73.
הסינתזה של פפטידים גשר דיסולפידי יכולה להיות מושגת באמצעות שיטות שונות. השיטה הנוחה ביותר להיווצרות חוב דיסולפידי בתוך פפטיד היא הגישה כביכול על עצמי מתקפלים חמצוני. כאן, מבשר ליניארי של פפטיד מחזורית הרצוי הוא מסונתז הראשון באמצעות פפטיד מוצק-שלב הסינתזה, לאחר המחשוף מתמיכה פולימריים נתון חמצון במערכת מאגר. חמצון-חיזור-פעיל סוכני כגון גלוטתיון מופחתת ו מחמצנים (GSH/GSSG) מתווספים לעיתים קרובות כדי לקדם את היווצרות חוב דיסולפידי. החיסרון העיקרי של הנתמך על-ידי מאגר קיפול עצמית היא כי הקשרים דיסולפידי לא נוצרות באופן סלקטיבי stepwise אופנה. בהשוואה של פפטיד מקורית, אשר לעיתים קרובות איזומר אחד בלבד דיסולפידי ספציפי מתואר, זה אפשרי להשיג רבים isomers אחרים עם גישה זו8. ממוצע-PIIIA כבר הוכח לגרום לפחות שלושה isomers באופן שונה מקופל על עצמי מתקפל לתוך המחקר הקודם3. הפרדת תערובת איזומר כזה קשה למדי בשל פעמים השמירה דומה אם באמצעות שיטות טיהור כרומטוגרפי9. הסינתזה יישוב של איזומר ספציפי לכן יתרון. כדי לייצר באופן ספציפי שאיזומר עם קישוריות דיסולפידי מוגדרים, אסטרטגיה מיוחד נדרש אשר דיסולפידי איגרות החוב במרוכז סגורים. לכן, מבשר ליניארי נושאת קבוצות להגן על זוגות בודדים ציסטאין הוא מסונתז על התמיכה פולימר. לאחר חיסול, זוגות ציסטאין בנפרד ולא במרוכז deprotected הינם מקושרים ב תגובה חמצון להניב את הרצוי דיסולפידי אג ח10,11,12,13, 14 , 15 , 16. לאחר הסינתזה הטיהור של המוצר התגובה, נדרש לאשר את הזהות וקישוריות דיסולפידי לפי שיטות אנליטיות מתאימים. שיטות אנליטיות רבות זמינות עבור הבהרה של הרצף חומצת אמינו העיקרי, למשל., MS/MS, בעוד הקביעה של קישוריות דיסולפידי עדיין נשאר הרבה פחות ובדוקים. מלבד למורכבות כה מרובים בונדד דיסולפידי פפטידים, זיהומים הקשור למוצר (למשל., מ דיסולפידי ערבול), עקב מדגם והכנה לעבודה יכול לסבך עוד יותר את ניתוח. בנייר זה, אנו מראים כי השימוש בשילוב של טכניקות אנליטיות שונות הכרחי להבהיר באופן חד משמעי את זהותו של הקשרים דיסולפידי ב isomers ממוצע-PIIIA. יש בשילוב שיטות כרומטוגרפיות ספקטרומטר מסה ואנו מסופקים הדגימות באותו כדי NMR ספקטרוסקופיה. ב- desorption/ionization(MALDI) לייזר בסיוע מטריקס ניתוח MS/MS, זיהינו את האיגרות דיסולפידי באמצעות הפחתה חלקית של iodoacetamide derivatization כי ניתוח מלמעלה אינה אפשרית עבור פפטיד זה. 2D NMR הניסויים בוצעו על מנת לקבל מבנה תלת ממדי של כל איזומר. לפיכך, על ידי שילוב של שיטות אנליטיות מתוחכמים ברורים, אפשרי להבהיר כראוי קישוריות דיסולפידי ואת מבנה תלת ממדי של קומפלקס פפטידים בונדד דיסולפידי מספר7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:979px;" width="979">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fmoc Rink amide resin</td>
			<td style="width:185px;">Novabiochem</td>
			<td style="width:191px;">855001</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Pyr(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">A-3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Arg(Pbf)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Asn(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Asp(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyp(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FAA1627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lys(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Ser(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gln(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Glu(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Trp(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Tyr(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">47623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Thr(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">His(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FDP1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">8510060</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">DMF</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">D119</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">DCM</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td>D37</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Piperidine</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td>A12442</td>
			<td>Flammable, Toxic, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">N-Methyl-Morpholin</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">224286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(Acm)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FAA1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">E-2495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">trifluoruacetic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">74564</td>
			<td>Toxic, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">phenol</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:191px;">1002060</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">thioanisol</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:191px;">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ethanedithiol</td>
			<td style="width:185px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:191px;">2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">diethyl ether</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:191px;">100,921</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">tert-butanol</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:191px;">L12338</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">A998</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">water</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">W5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">isopropanol</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:191px;">ACRO42383</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium hydroxide</td>
			<td style="width:185px;">AppliChem</td>
			<td style="width:191px;">A6579,1000</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">iodoacetamide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">iodine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">I0385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:191px;">110165</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ascorbic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">diphenylsulfoxide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">P35405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">anisol</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">96109</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">trichloromethylsilane</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">M85301</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sample dilution buffer</td>
			<td style="width:185px;">Laborservice Onken</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">106370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">disodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">795410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">citric acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium citrate dihydrate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tris-acetate</td>
			<td style="width:185px;">Carl Roth,&#160;</td>
			<td style="width:191px;">7125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">E26282&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">peptide calibration standard II</td>
			<td style="width:185px;">Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">8222570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;"></td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:185px;">Company</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">solid-phase peptide synthesizer</td>
			<td>Intavis Bioanalytical Instruments AG</td>
			<td style="width:191px;">EPS 221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:340px;">lyophilizer&#160;</td>
			<td>Martin Christ GmbH</td>
			<td style="width:191px;">&#160;Alpha 1-2 Ldplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">semipreparative HPLC</td>
			<td>Jasco</td>
			<td style="width:191px;">system PV-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Eurospher 100 C18 column (RP, 5 &#181;m particle size, 100 &#197; pore size, 250 x 32 mm)</td>
			<td style="width:185px;">Knauer</td>
			<td style="width:191px;">25QE181E2J</td>
			<td>purification of the linear peptide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:340px;">Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 &#181;m particle size, 300 &#197; pore size, 250 x 22 mm)</td>
			<td>Hichrom-VWR</td>
			<td style="width:191px;">HICH218TP1022</td>
			<td>purification of the oxidized peptide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:340px;">analytical HPLC&#160;</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td style="width:191px;">system LC-20AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 &#181;m particle size, 300 &#197; pore size, 250 x 4.6 mm)&#160;</td>
			<td>Hichrom-VWR</td>
			<td style="width:191px;">HICH218TP54</td>
			<td>analytical column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ground steel target (MTP 384)</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">NC0910436</td>
			<td>MALDI preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">C18-concentration filter (ZipTip)</td>
			<td style="width:185px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:191px;">ZTC18S096</td>
			<td>MALDI preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MALDI mass spectrometer</td>
			<td style="width:185px;">Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">ultraflex III TOF/TOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">amino acid analyzer</td>
			<td>Eppendorf-Biotronik GmbH</td>
			<td style="width:191px;">LC 3000 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">NMR spectrometer Bruker Avance III</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">Bruker Avance III 600 MHz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">computer program for molecular visualising</td>
			<td>YASARA Biosciences GmbH</td>
			<td style="width:191px;">Yasara structures</td>
			<td>NMR structure calculation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">computer program for MALDI data evaluation&#160;</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">flexAnalysis, BioTools</td>
			<td>MS/MS fragmentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">analog vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:191px;">VM 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:191px;">5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td style="width:191px;">EBA 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Rotational vacuum concentrator</td>
			<td style="width:185px;">Christ</td>
			<td style="width:191px;">2-18 Cdplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Analytical Balance</td>
			<td style="width:185px;">A&#38;D Instruments</td>
			<td style="width:191px;">GR-202-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and structure determination of &#181;-conotoxin piiia isomers with different disulfide connectivities

פפטידים עם מספר גבוה של cysteines בדרך כלל מושפעים באשר למבנה התלת ממדי שלהם קישוריות דיסולפידי. זה ולכן חשוב מאוד להימנע מיצירת קשר דיסולפידי רצויה במהלך סינתזה פפטיד, כי זה עלול לגרום במבנה פפטיד שונה לחלוטין, וכתוצאה מכך משתנה bioactivity. אולם, היווצרות חוב דיסולפידי מרובים בפפטיד הנכון הוא קשה להשיג באמצעות שיטות עצמית מתקפלים סטנדרטיים כגון פרוטוקולים חימצון מאגר המקובלת, כי יכול להיווצר מספר connectivities דיסולפידי. פרוטוקול זה מייצג את אסטרטגיית מתקדם הדרושים לסינתזה יישוב של פפטידים גשר דיסולפידי מרובות אשר לא יכול להיות מסונתז באמצעות חימצון מאגר איכותי, כמותי. המחקר מדגים היישום של אסטרטגיה ברורה קבוצה שיגן על הסינתזה של כל פפטיד 3 דיסולפידי-בונדד אפשרי isomers של ממוצע-conotoxin PIIIA באופן ממוקד. פפטידים מוכנות על ידי באמצעות אסטרטגיה קבוצה מגן על היווצרות קשר דיסולפידי מוגדר סינתזה פפטיד מבוססי Fmoc מעבדתי. זוגות בהתאמה של cysteines מוגנים עם trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) טרט-בוטיל (tBu) הגנה על קבוצות כדי לוודא כי במהלך כל שלב חמצון רק הנדרשת cysteines deprotected הינם מקושרים. בנוסף הסינתזה יישוב, שילוב של מספר שיטות אנליטיות משמש כדי להבהיר את מתקפלות הנכונה ואת הדור של המבנים פפטיד הרצוי. ההשוואה של isomers שונים 3-דיסולפידי-בונדד מציין את החשיבות של נחישות מדויק והידע של קישוריות דיסולפידי עבור החישוב של מבנה תלת מימדי, פרשנות של הביולוגי פעילות של isomers פפטיד. אפיון אנליטיים כולל הבהרה קשר דיסולפידי המדויק באמצעות ספקטרומטר מסה (MS/MS) טנדם ניתוח שבו מבוצע עם נגזרות חלקית מופחתת ו alkylated של איזומר פפטיד שלם המיוצר על ידי פרוטוקול מותאם. יתר על כן, המבנים פפטיד נקבעים באמצעות תהודה מגנטית גרעינית (NMR) 2D ניסויים ואת הידע המתקבל ניתוח MS/MS.

15 שונים גשר דיסולפידי isomers של PIIIA ממוצע-conotoxin מסונתז, מאופיין בפירוט (איור 1). חוב דיסולפידי מזוהים על ידי הפחתת חלקית ו- MS/MS לאחר מכן ניתוח (איור 2). ניתוח NMR של isomers שונים מתבצעת (איור 3) כדי לחשוף את המבנים פפטיד בודדים. ראוי לציי...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Structure Determination of Ã‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities at JoVE.com

Synthesis and Structure Determination of ÃƒÆ’Ã¢â‚¬Å¡Ãƒâ€šÃ‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

ציסטאין עתירי פפטידים מקפלים לתוך מבנים תלת מימדיים נפרדות בהתאם שלהם קישוריות דיסולפידי. יישוב סינתזה של isomers דיסולפידי הפרט נדרש כאשר מאגר חמצון לא תוביל קישוריות דיסולפידי הרצוי. הפרוטוקול עוסק הסינתזה סלקטיבי של פפטידים 3 דיסולפידי-בונדד וניתוח מבניים שלהם באמצעות מחקרים NMR ו- MS/MS.

סינתזה וקביעת מבנה ממוצע-Conotoxin Isomers PIIIA עם Connectivities דיסולפידי שונים

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום סינתזת פפטיד כגון סינתזה של פפטידים עשירים disulfide וקביעת דפוס גשר disulfide המתאים שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת סינתזה סלקטיבית של איזומרים שונים פפטיד דיסולפיד פנד ואת האפיון הכימי והמבני הבאים שלהם. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו ייאבקו כי כל פפטיד עשיר disulfide מתנהג אחרת.סינתזה וניתוח עשויים להיות אופטימיזציה חלקית עבור פפטיד בודדים או חלבון. העבר את הרייטנטים המפורטים בפרוטוקול הטקסט לכלי הדם המתאימים והצב אותם במחבטים המתאימים של סינתיסייזר פפטיד שלב מוצק. לאחר מכן, מוסיפים 100 מיליגרם של שף יבש לעמודי התגובה ומכניסים אותם למחבט של הסינתיסייזר.התחל את סינתזת הפפטיד בשלב מלא כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר הסינתזה הושלמה, ליופילים את הרף בן לילה. עכשיו לחשוף את הפפטיד מן השף ולבצע הגנה עמוקה של שרשראות הצד.כדי לעשות זאת לשלב את בשרף מיובש בצינור 12 מיליליטר ו לקרר אותו לאפס מעלות צלזיוס על קרח. ראשית, מוסיפים 150 מיקרוליטרים של תערובת נבלות, ולאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של 95% חומצה טריפלואורואצטית לכל 100 מיליגרם של שרף. השאירו את התערובת רועדת בעדינות במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר.עכשיו, לסנן את התערובת דרך פריט זכוכית. לאסוף את הסינון בצינורות, בנפרד מלא אתר diethyl קר כקרח במיליליטר אחד של תערובת מחשוף לכל שמונה עד 10 מיליליטר של אתר diethyl. הפפטיד מזרז כמוצק לבן.לאחר שטיפה וצנטריפוגה של הצינורות כמתואר בפרוטוקול הטקסט, לייבש את הפפטידים. כדי לטהר את המבשר ליניארי עם כרומטוגרפיה הכנה למחצה להוסיף כ 70 מיליגרם של פפטיד גולמי צינור 15 מיליליטר. לאחר מכן ממיסים את הפפטיד הגולמי ב-0.1% TFA ובאצטוניטריל אחד לאחד למים.הפרד את תערובת הפפטיד באמצעות שיפוע של אפס עד 50%Eluent B במשך 120 דקות בקצב זרימה של 10 מיליליטר לדקה. אסוף את השברים בצינורות בודדים כפי שהם מופיעים והכן שברים נבחרים עבור ספקטרומטריית מסה וניתוח HPLC כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לייבש את השברים ולשלב את שברי העמית.התחל את היווצרות סלקטיבית של איגרות חוב disulfide על ידי ביצוע החמצון הראשון. כדי לעשות זאת, להמיס 15 מיליגרם של פפטיד ליניארי מיובש בהקפאה ב 105 מיליליטר של תערובת מים isopropanol. השאירו את התערובת תוך ערבוב באוויר בתנאים בסיסיים במשך 12 עד 48 שעות.הליך החמצון צעד אחר צעד הוא קריטי מאוד. פקדי תגובה נלקחים בכל שלושת שלבי החמצון כדי להבטיח היווצרות עשירה בדיסולפידים בודדים. החמצון השלישי הוא המכריע ביותר, כי ערבוב disulfide יכול להתרחש כאשר זמן התגובה האופטימלי הוא חריגה.עכשיו תבצע את החמצון השני. ממיסים 15 מיליגרם של פפטיד מיובש בהקפאה ב 105 מיליליטר של מים isopropanol, תערובת אחת חומצה הידרוכלורית טוחה. הוסף 158 מיקרוליטרים של תותב יוד טוחן 0.1 במתנול לפתרון.מערבבים את התגובה בטמפרטורת החדר עד שהחמצון הושלם. ואז לעצור את התגובה על ידי הוספת 79 microliters של חומצה אסקורבית טוחן אחד במים. לבסוף לבצע את החמצון השלישי.ממיסים 15 מיליגרם של פפטיד מיובש בהקפאה ב 5.5 מיליליטר של TFA המכיל תערובת נבלות. לזרז את הפפטיד לתוך צינורות המכילים אתר diethyl קר במיליליטר אחד של פתרון תגובה לכל שמונה עד עשרה מיליליטר של אתר diethyl. כדי לבצע טיהור פפטיד ב 15 מיליגרם של המוצר הגולמי מיובש בהקפאה לצינור 15 מיליליטר.ממיסים את המוצר הגולמי בנפח של לולאת מדגם HPLC באמצעות תערובת של 0.1%TFA ואחד לאחד אצטוניטריל למים. לאחר מערבולת עד פירוק מלא, צנטריפוגה הפתרון מדקה אחת ב 3400 פעמים G.Draw את התערובת 3.6 מיליליטר במזרק 5 מיליליטר ולהזריק את המדגם ללא כל בועות אוויר לתוך לולאת ההזרקה. הפעל את ההזרקה למערכת HPLC.לטהר את תערובת פפטיד באמצעות שיפוע של אפס עד 50% Eluent B מעל 120 דקות בקצב זרימה של 10 מיליליטר לדקה. לאסוף את השברים בצינורות בודדים כפי שהם מופיעים. לאחר השלמת הריצה, הכן שברים נבחרים לניתוח MS ו- HPLC כמתואר בטקסט.לייבש את כל השברים ולאחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי לבצע HPLC אנליטי, העבר דגימות של שברי הפפטיד או פקדי התגובה לתוך בקבוקון HPLC והמס אותו בתערובת של 0.1%TFA באחד לאחד Acetonitrile למים. מקם את בקבוקון HPLC לתוך הדוגם האוטומטי של ערכת HPLC השלב ההפוך האנליטי להזרקת 250 מיקרוליטרים של כל דגימה.השתמש במערכת אלוט הדרגתית של 0.1%TFA במים כמו Eluent A ב 0.1% TFA ב Acetonitrile כמו Eluent B.Analyze הפפטיד באמצעות שיפוע של 10%-40% אלואנט B מעל 30 דקות בקצב זרימה של 1.0 מיליליטר לדקה. כדי לבצע ניתוח חומצות אמינו, להעביר 100 מיקרוגרם של פפטיד טהור צינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר ולהמיס את האבקה ב 200 microliters של שישה HCL טוחנת. לאחר העברת הפתרון לאמפולה זכוכית, לסגור את האמפולה על ידי חימום הצוואר עם להבה מבער bunsen.לאחר מכן מניחים צינור זכוכית מחזיק את האמפולה בבלוק חימום במשך 24 שעות ב 110 מעלות צלזיוס להידרוליזה. לאחר 24 שעות, לפתוח את האמפולה ולהעביר את הפתרון לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה שני מיליליטר. צנטריפוגה הפתרון במשך שש שעות ב שישים מעלות צלזיוס ו 210 פעמים G ברכז ואקום סיבובי.לאחר מכן ממיסים את המוצר שעבר הידרוליז ב-192 מיקרוליטרים של מאגר הדילול שנדגם ומעבירים את הפתרון למסנן מיקרו צנטריפוגלי. לאחר צנטריפוגה המדגם במשך דקה אחת ב 2300 פעמים G, להעביר 100 microliters של הסינון לתוך צינור מדגם ניתוח חומצת אמינו. מניחים את הצינור לתוך מנתח חומצות אמינו ולהתחיל את הניתוח.במהלך פרוטוקול הפחתה זה בעבר, חיוני לקחת מספר בקרות תגובה על מנת להשיג פעמיים או ארבע פעמים קאפה mido מתילציה מינים אשר חיוניים לניתוח disulfide הבאים באמצעות ספקטרומטריית מסה. ראשית להמיס 600 מיקרוגרם של פפטיד טהור ב 1.2 מיליליטר של 0.05 מאגר ציטראט טוחן המכיל TCEP. הדגירה את התערובת בטמפרטורת החדר לוקח כמה 100 דגימות בקרת תגובה microliter החל אפס עד 30 דקות.מערבבים את הדגימות בצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר עם 300 microliters של מאגר אלקלציה כדי לעצור את התגובה ולבצע מתילציה קרבוניל של קבוצות תיול חינם. לעצור את התגובה לאחר חמש דקות על ידי הוספת 100 microliters של 10% TFA ומים ולאחסן את הדגימות על קרח יבש. כעת בצע HPLC על הדוגמאות כמפורט בפרוטוקול הטקסט.העבר כמות קטנה של כל שבר שנאסף לצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר לניתוח MS / MS של הצורות מחומצן. ממיסים את הפפטיד הנותר ב-0.1% TFA במים ומוסיפים נפח מתאים על פני פתרון TCEP של 100 מילימולרים כדי לקבל ריכוז TCEP סופי של 10 מילימולרים. בשלב זה, אלקילציה ציסטאין סלקטיבית ניתן לבדוק באמצעות רצף פפטיד.עם שני הפפטידים באמצע, נחישות של דפוס גשר disulfide אפשרי. ניתוח NMR של isomers שונים מתבצעת כדי לחשוף את מבני פפטיד בודדים. 20 המבנים בעלי האנרגיות הנמוכות ביותר, כמו גם הקישוריות הדיסולפידית של האיסומרים השונים מוצגים.יש לציין כי נדרש שילוב של פיצול HPLC MS/MS בשלבים הפוכים וניתוח NMR לזיהוי חד משמעי של קישוריות הדיסולפיד. ההשוואה של ערך סטייה ריבועית השורש הבהיר כי פפטיד נוקשה בעיקר מוביל מבנה NMR נפתר טוב יותר. וידאו זה צריך לתת לך דוגמה כיצד לסנתז באופן סלקטיבי פפטידים עם דפוס הקשר הרצוי disulfide.זה גם מראה את האפשרות לבדוק את הקישוריות disulfide הנכון באמצעות ספקטרומטריית מסה רכה ולקבל מבנה תלת מימדי באמצעות ספקטרוסקופיה NMR. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום סינתזת הפפטיד לחקור את החשיבות של דפוסי קשר דיסולפידיים למבנה התלת מימדי וכתוצאה מכך את הפעילות של isomers פפטיד כזה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ASAS פעילות על מנת לקבל תובנה על יחסי פעילות מבנה של isomers פפטיד שונים ביעד הביולוגי הספציפי.למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך הסינתזה וניתוח של conotoxins, זה יכול להיות מיושם גם על פפטידים גשר disulfide אחרים וחלבונים כגון fenzens, רעלנים בעלי חיים עשירים דיסולפיד ומולקולות אחרות המכילות ציסטאין מרובים.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Organic Chemistry

Chemistry

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Unit 1

Stereoisomerism

SCIENTISTS IN ACTION

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

מכלולי פפטיד הטרנסממברני ייצור של דיסולפיד-התייצבו ללימודים מבניים

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

From Constructs to Crystals ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Towards Structure Determination of ÃƒÅ½Ã‚Â²-barrel Outer Membrane Proteins

מתוך בונה קריסטלים - לקראת מבנה קביעת β-חבית החיצון ממברנה חלבונים

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

סינתזה ואפיון של קולואידים מולקולריים

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

השתברות אבקת רנטגן שימור מדע: לקראת קביעת מבנה שיגרתית קריסטל של מוצרי קורוזיה על יצירות אמנות מורשה

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Synthesis and Characterization of Fe-doped Aluminosilicate Nanotubes with Enhanced Electron Conductive Properties

סינתזה ואפיון של Fe-מסומם aluminosilicate צינורות עם מאפייני מוליכות אלקטרונים משופרים

The goal of the protocol is to synthesize Fe-doped aluminosilicate nanotubes of the imogolite type with the formula (OH)3Al2-xFexO3SiOH. Doping with Fe ...

Probing the Structure and Dynamics of Interfacial Water with Scanning Tunneling Microscopy and Spectroscopy

חיטוט את המבנה ואת הדינמיקה של מים פנים עם סריקה מיקרוסקופ מינהור וספקטרוסקופיה

Water/solid interfaces are ubiquitous and play a key role in many environmental, biophysical, and technological processes. Resolving the internal ...

Fabricating High-viscosity Droplets using Microfluidic Capillary Device with Phase-inversion Co-flow Structure

בדיית טיפות צמיגות גבוהה באמצעות המכשיר נימי Microfluidic עם שלב-היפוך זרימה ושיתוף מבנה

The generation of monodisperse droplets with high viscosity has always been a challenge in droplet microfluidics. Here, we demonstrate a phase-inversion ...

Synthesis of Graphene Nanofluids with Controllable Flake Size Distributions

סינתזה של גרפילואידים עם הפצות בגודל של פתיתים שאינם בשליטה

A method for synthesizing graphene nanofluids with controllable flake size distributions is presented. Graphene nanoflakes can be obtained by the ...

Organic Structure-directing Agent-free Synthesis for *BEA-type Zeolite Membrane

מבנה אורגני-מכוון סוכן-סינתזה חינם עבור * בי-סוג Zeאוליט ממברנה

Membrane separation has drawn attention as a novel-energy saving separation process. Zeolite membranes have great potential for hydrocarbon separation in ...