Name: synthesis and structure determination of &#181;-conotoxin piiia isomers with different disulfide connectivities
Uploaded: 2018-10-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Structure Determination of Ã‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities at JoVE.com

A. Resemann、f. j. マイヤー、ブルカー ・ ダルトニクス社ブレーメン; から + Suckau に感謝したいと思いますD. 人、A. A. 人、v. シュミッツ ・、ダルムシュタット工科大学; C. シールFLI イエナ、ボン大学から m. Engeser から o. OhlenschlägerK. Kramer、A. Harzen およびマックス ・ プランク植物育種研究、ケルン; から H. 中頭ケルン; 動物学研究所からスザンヌ Neupertブランクフルトの大学の生体磁気共鳴分光設備技術のサポート、トレーニング、および楽器へのアクセスします。直噴にボン大学による財政援助は感謝します。

注: ここで使用されるすべてのアミノ酸は、L 構成。アミノ酸およびアミノ酸誘導体の略語は、iub 秘匿の命名法委員会と生化学命名法に関する IUPAC iub 秘匿合同委員会の勧告に従って使用されました。
1. 固相ペプチド合成 (SPP)
注: は、固相ペプチド合成装置で合成を実行します。ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC NH2 9 fluorenylmethyloxycarbonyl (fmoc 保護) 化学の標準?...

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	<li>Fosgerau, K., Hoffmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+therapeutics:+Current+status+and+future+directions.">Peptide therapeutics: Current status and future directions.</a> Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).</li><li>Gongora-Ben&#237;tez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+disulfide+bonds.+peptides+as+therapeutics.">Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).</li><li>Tietze, A. 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Μ PIIIA は、同じアミノ酸配列からジスルフィド結合異性体を選択的に生成する可能性を表すなど、システインに富むペプチドの合成のためここに記載されているメソッド。したがって、fmoc 保護ベース固体等相ペプチド合成18とジスルフィド結合の選択的形成のための定義された保護グループ戦略が使用される16を設立しました。固相ペプチド合成は、自動?...

特定の生物学的ターゲット1の強力かつ選択性の高い化合物を表すため生理活性ペプチド医薬品の研究開発での使用は認めです。その生物活性の立体構造は、非常に重要な構造活動関係研究2,3、4を実行するために。別に全体の構造に影響を与える主なアミノ酸シーケンス、二硫化物結束は大幅システイン豊富なペプチッド5の構造を安定させます。複数のジスルフィド架橋ペプチドには、そのシーケンス内の六つのシステインを含む円錐ササから μ PIIIA など conotoxins が含まれます。この高システイン コンテンツ 15 ジスルフィド異性体の形成が可能で理論的に。正しい二硫化接続は非常に重要な生物学的活性6,7 です。しかし、問題が発生は、天然のペプチドとかどうかは、それらの異性体の所有している最高の生物学的活性の 1 つ以上の生理活性構造があるかどうかですか。Μ-conotoxins の場合生物学的ターゲットの電位依存性ナトリウム イオン チャネル、μ PIIIA は特にサブタイプ NaV1.2、Na の最も強力なV1.4 と NaV1.73。
ジスルフィド架橋ペプチドの合成は、さまざまな方法を使用して実現できます。ペプチド内ジスルフィド結合の形成のための最も便利な方法は、いわゆる酸化自己折り畳み方法です。ここでは、まず高分子のサポートから胸の谷間がバッファー システムに酸化を受けた後である固相ペプチド合成を使用して目的の環状ペプチドの線形の前駆体を合成します。還元と酸化型グルタチオン (GSH/GSSG) などのレドックス活性剤がしばしばジスルフィド結合の形成を促進するために追加されます。折り畳み式のバッファーでサポートされている自己の主な欠点は、二硫化物結束は段階的で選択的に形式がないことです。多くの場合 1 つだけ特定のジスルフィド異性体は記載されて、ネイティブのペプチドと比較してこのアプローチ8とその他の多数の異性体を得ることが可能です。Μ PIIIA は既に自己以前の研究3で折り畳み時に異なる 2 つ折り異性体、少なくとも 3 つの結果に示されています。このような異性体混合物の分離は、クロマトグラフィー精製方法9を使用して同じような保持時間のため難しい。特定の異性体のターゲットを絞った合成のため有利です。ジスルフィド結合をで定義された二硫化接続、特別な戦略を持つ異性体が必要な具体的にプロデュースして連続して閉じられます。したがって、個々 のシステインの組み合わせで異なる保護グループを運ぶ線形前駆体高分子担体を合成します。、除去後システイン ペア個別し順次 deprotected、リンク目的二硫化物結束10,11,12,13,を生成する酸化反応で14,15,16. 合成と反応生成物の精製後、適当な分析方法により id とジスルフィド結合接続を確認する必要です。例えば一次アミノ酸シーケンスの解明のため多数の分析方法があります。、MS/MS、二硫化接続の定量は依然としてはるかに少ない調査中。このような複数のジスルフィド結合のペプチドを製品関連不純物の複雑さから離れて (e.g。、二硫化スクランブルから)、サンプルのため準備や作業を解析さらに複雑にすることができます。本稿ではっきりと μ PIIIA 異性体のジスルフィド結合のアイデンティティを明らかにする必要があるさまざまな分析手法の組み合わせの使用を示します。質量分析法とクロマトグラフィー法を組み合わせるし、NMR 分光法に同じサンプルを提供しました。マトリックス支援レーザー desorption/ionization(MALDI) ・ MS/MS 分析の部分還元とヨードアセトアミド誘導トップダウン解析はこのペプチドを用いたジスルフィド結合がわかりました。各異性体の立体構造を得るために 2D NMR 実験を行った。したがって、異なる洗練された分析方法を組み合わせることによって複数のジスルフィド結合ペプチド7ジスルフィド接続および複合体の三次元構造を正しく解明することが可能です。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:979px;" width="979">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fmoc Rink amide resin</td>
			<td style="width:185px;">Novabiochem</td>
			<td style="width:191px;">855001</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Pyr(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">A-3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Arg(Pbf)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Asn(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Asp(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyp(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FAA1627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lys(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Ser(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gln(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Glu(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Trp(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Tyr(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">47623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Thr(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">His(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FDP1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">8510060</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">DMF</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">D119</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">DCM</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td>D37</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Piperidine</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td>A12442</td>
			<td>Flammable, Toxic, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">N-Methyl-Morpholin</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">224286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(Acm)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FAA1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">E-2495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">trifluoruacetic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">74564</td>
			<td>Toxic, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">phenol</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:191px;">1002060</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">thioanisol</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:191px;">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ethanedithiol</td>
			<td style="width:185px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:191px;">2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">diethyl ether</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:191px;">100,921</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">tert-butanol</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:191px;">L12338</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">A998</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">water</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">W5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">isopropanol</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:191px;">ACRO42383</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium hydroxide</td>
			<td style="width:185px;">AppliChem</td>
			<td style="width:191px;">A6579,1000</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">iodoacetamide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">iodine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">I0385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:191px;">110165</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ascorbic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">diphenylsulfoxide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">P35405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">anisol</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">96109</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">trichloromethylsilane</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">M85301</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sample dilution buffer</td>
			<td style="width:185px;">Laborservice Onken</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">106370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">disodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">795410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">citric acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium citrate dihydrate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tris-acetate</td>
			<td style="width:185px;">Carl Roth,&#160;</td>
			<td style="width:191px;">7125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">E26282&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">peptide calibration standard II</td>
			<td style="width:185px;">Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">8222570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;"></td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:185px;">Company</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">solid-phase peptide synthesizer</td>
			<td>Intavis Bioanalytical Instruments AG</td>
			<td style="width:191px;">EPS 221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:340px;">lyophilizer&#160;</td>
			<td>Martin Christ GmbH</td>
			<td style="width:191px;">&#160;Alpha 1-2 Ldplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">semipreparative HPLC</td>
			<td>Jasco</td>
			<td style="width:191px;">system PV-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Eurospher 100 C18 column (RP, 5 &#181;m particle size, 100 &#197; pore size, 250 x 32 mm)</td>
			<td style="width:185px;">Knauer</td>
			<td style="width:191px;">25QE181E2J</td>
			<td>purification of the linear peptide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:340px;">Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 &#181;m particle size, 300 &#197; pore size, 250 x 22 mm)</td>
			<td>Hichrom-VWR</td>
			<td style="width:191px;">HICH218TP1022</td>
			<td>purification of the oxidized peptide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:340px;">analytical HPLC&#160;</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td style="width:191px;">system LC-20AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 &#181;m particle size, 300 &#197; pore size, 250 x 4.6 mm)&#160;</td>
			<td>Hichrom-VWR</td>
			<td style="width:191px;">HICH218TP54</td>
			<td>analytical column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ground steel target (MTP 384)</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">NC0910436</td>
			<td>MALDI preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">C18-concentration filter (ZipTip)</td>
			<td style="width:185px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:191px;">ZTC18S096</td>
			<td>MALDI preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MALDI mass spectrometer</td>
			<td style="width:185px;">Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">ultraflex III TOF/TOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">amino acid analyzer</td>
			<td>Eppendorf-Biotronik GmbH</td>
			<td style="width:191px;">LC 3000 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">NMR spectrometer Bruker Avance III</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">Bruker Avance III 600 MHz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">computer program for molecular visualising</td>
			<td>YASARA Biosciences GmbH</td>
			<td style="width:191px;">Yasara structures</td>
			<td>NMR structure calculation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">computer program for MALDI data evaluation&#160;</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">flexAnalysis, BioTools</td>
			<td>MS/MS fragmentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">analog vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:191px;">VM 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:191px;">5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td style="width:191px;">EBA 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Rotational vacuum concentrator</td>
			<td style="width:185px;">Christ</td>
			<td style="width:191px;">2-18 Cdplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Analytical Balance</td>
			<td style="width:185px;">A&#38;D Instruments</td>
			<td style="width:191px;">GR-202-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and structure determination of &#181;-conotoxin piiia isomers with different disulfide connectivities

通常にシステインの数が多いを持つペプチド立体構造に関する、二硫化接続によって受けます。こうしてペプチド合成時に不要なジスルフィド結合の形成を避けるために非常に重要な完全に異なるペプチド構造で起因するかもしれないので、結果として生理活性を変更します。ただし、ペプチドの複数のジスルフィド結合の正しい形成がいくつか二硫化接続を作成できるため、従来バッファー酸化プロトコルなど標準的な自己折りたたみメソッドを使用して取得することは困難。このプロトコルは、ターゲットを絞った高品質と量のバッファー酸化を介して合成できない複数のジスルフィド架橋ペプチド合成に必要な高度な戦略を表します。研究では、ターゲットを絞った形で μ-コノトキシン PIIIA のすべての可能な 3 ジスルフィド結合ペプチド異性体の合成のための明確な保護グループ戦略のアプリケーションを示します。ペプチドは、保護グループ戦略定義ジスルフィド結合形成に使用して fmoc 保護基固相ペプチド合成によって準備されます。システインのそれぞれのペアは、トリチル (Trt)、acetamidomethyl (Acm)、 tertと保護されている- とは、すべての酸化ステップ中にそののみ必要なシステインは deprotected リンクを確認するグループのブチル (tBu) を保護します。対象となる合成に加えて分析手法の組み合わせを使用して、正しい折りたたみ目的ペプチド構造の生成を明らかにします。異なる 3 ジスルフィド結合異性体の比較を示し、正確な決定の重要性二硫化接続立体構造の計算および生物学的の解釈のための知識ペプチド異性体の活動。分析の特性には、適応プロトコルによって生成されたそのままのペプチド異性体の部分的に減少およびアルキル化誘導体で行われるタンデム質量分析 (MS/MS) 解析による正確なジスルフィド結合解明が含まれています。さらに、ペプチドの構造は、2次元核磁気共鳴 (NMR) 実験および MS/MS 分析から得られた知識を使用して決定されます。

μ-コノトキシン PIIIA のジスルフィド架橋 15 の異なる異性を合成して、詳細 (図 1)。ジスルフィド結合は部分的な削減と後続の MS/MS 分析 (図 2) によって識別されます。(図 3) 個々 のペプチドの構造を明らかにする別の異性体の NMR 解析が実行されます。特に、RP 高速液体クロマトグラフィー、フラグメ...

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Synthesis and Structure Determination of ÃƒÆ’Ã¢â‚¬Å¡Ãƒâ€šÃ‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

システイン豊富なペプチッドは、二硫化接続に応じて異なる立体構造に折る。個々 のジスルフィド異性体のターゲットを絞った合成は、バッファー酸化が必要な二硫化接続につながるしない場合に必要です。プロトコルを扱う 3 ジスルフィド結合ペプチド、NMR および MS/MS 研究を用いた構造解析の選択的合成。

合成と異なる二硫化接続と μ-コノトキシン PIIIA 異性体の構造決定

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

この方法は、ジスルフィドリッチペプチドの合成や、対応するジスルフィドブリッジパターンの決定など、ペプチド合成分野における重要な質問に答える助けとなります。この技術の主な利点は、異なるジスルフィド結合結合ペプチド異性体およびその後の化学的および構造的特徴付けの選択的合成を可能にすることです。一般的に、この方法に新しい個人は、各ジスルフィドリッチペプチドが異なった振る舞いをするので苦労します。合成および分析は、個々のペプチドまたはタンパク質に対して部分的に最適化されなければならない。テキストプロトコルに記載されている試薬を対応する容器に移し、固相ペプチド合成機の適切なラケットに入れる。その後、反応カラムに100ミリグラムの乾燥樹脂を加え、シンセサイザーのラケットに入れます。テキストプロトコルで詳述されているように、固相ペプチド合成を開始します。合成が完了した後、一晩、樹脂を凍結乾燥させた。今樹脂からペプチドを切断し、サイドチェーンの深い保護を行います。これを行うには、乾燥樹脂を12ミリリットルのチューブに入れ、氷の上で摂氏0度に冷却します。まず、スカベンジャー混合物の150マイクロリットルを追加し、次に樹脂の100ミリグラムあたり95%トリフルオロ酢酸の1ミリリットルを追加します。混合物を室温で3時間静かに振ったままにしておきます。次に、ガラスのフリットを通して混合物をフィルタリングします。チューブに濾液を収集し、氷冷ジエチルエーテルで個別に8〜10ミリリットルのジエチルエーテルあたり1ミリリットルの切断混合物で満たします。ペプチドは白色の固体として沈殿する。テキストプロトコルに記載されているようにチューブをリンスおよび遠心した後、ペプチドを凍結乾燥させる。半前質クロマトグラフィーでリニア前駆体を精製するために、粗ペプチドの約70ミリグラムを15ミリリットルのチューブに加える。その後、粗ペプチドを0.1%TFAに溶解し、1対1のアセトニトリルを水に溶かします。1分間に10ミリリットルの流量で120分間にわたってゼロから50%の溶離Bの勾配を使用してペプチド混合物を分離する。個々のチューブに分数を収集し、テキストプロトコルに記載されているように、質量分析とHPLC分析のために選択した分数を準備します。分数をフリーズドライし、ピア分数を組み合わせます。第1酸化を行うことにより、二硫化物結合の選択的形成を開始する。これを行うには、イソプロパノール水混合物の105ミリリットルに凍結乾燥リニアペプチドの15ミリグラムを溶解する。12〜48時間、基本的な条件下で空気中で攪拌混合物を残します。段階的酸化手順は非常に重要です。反応制御は、個々の異化物が豊富な形成を確実にするために、3つの酸化ステップすべてで取られる。3回目の酸化は、最適な反応時間を超えると二硫化スクランブリングが起こり得るため、最も重要です。次に、2回目の酸化を行います。イソプロパノール水の105ミリリットル、1モル塩酸混合物に凍結乾燥ペプチドの15ミリグラムを溶解する。メタノールに0.1モルヨウ素溶液158マイクロリットルを加えます。酸化が完了するまで室温で反応を攪拌します。次に、1モルアスコルビン酸を水中に79マイクロリットル加えて反応を停止します。最後に第3酸化を行う。スカベンジャー混合物を含むTFAの5.5ミリリットルに凍結乾燥ペプチドの15ミリグラムを溶解する。8~10ミリリットルのジエチルエーテルにつき1ミリリットルの反応溶液で、冷たいジエチルエーテルを含むチューブにペプチドを沈殿させます。15ミリリットルチューブに凍結乾燥粗生成物の15ミリグラムでペプチド精製を行う。粗生成物をHPLCサンプルループの体積に溶解し、0.1%TFAと1対1のアセトニトリルを水に混合して溶解します。完全に溶解するまでボルテックスした後、3400倍のG.5ミリリットルシリンジで3.6ミリリットルの混合物を引き出し、注入ループに気泡を入れずにサンプルを注入して、溶液を遠心分離します。HPLC システムへの注入を開始します。1分間に10ミリリットルの流量で120分間にわたってゼロから50%の溶出Bの勾配を使用してペプチド混合物を精製する。表示される個々のチューブの分数を収集します。実行が完了したら、テキストに記載されているように、MSおよびHPLC分析のために選択された分数を準備します。すべての分数を凍結乾燥し、マイナス20度で保存します。分析HPLCを実行するには、ペプチド画分または反応制御のサンプルをHPLCバイアルに移し、それを1対1のアセトニトリルの混合物に溶解します。分析リバース相HPLCセットのオートサンプラーにHPLCバイアルを入れ、各サンプルの250マイクロリットルを注入します。アセトニトリルの0.1%TFAの溶離性Aとして水中に0.1%TFAの勾配溶出システムを使用し、1分間に1.0ミリリットルの流量で30分間にわたって10%〜40%の溶離Bの勾配を使用してペプチドを分析します。アミノ酸分析を行うために、純粋なペプチドの100マイクログラムを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移し、200マイクロリットルの6モルHCLの粉末を溶解する。溶液をガラスアンプルに移した後、バンゼンバーナー炎で首を加熱してアンプルを閉じます。その後、加水分解のために摂氏110度で24時間加熱ブロックにアンプルを保持するガラス管を置きます。24時間後、アンプルを開き、溶液を2ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。回転真空濃縮器で60°Cで6時間、G210倍の溶液を遠心分離します。次いで、192マイクロリットルのサンプリングされた希釈バッファーに加水分解物を溶解し、溶液をマイクロ遠心フィルターに移します。試料を2300倍Gで1分間遠心した後、100マイクロリットルの濾液をアミノ酸分析サンプルチューブに移します。チューブをアミノ酸分析装置に入れ、分析を開始します。この過去の還元プロトコルでは、質量分析を介してその後のジスルフィド分析に不可欠なカッパミドメチル化種を2〜4回得るために、いくつかの反応制御を取ることが重要です。まず、TCEPを含む0.05モルクエン酸バッファーの1.2ミリリットルに純粋なペプチドの600マイクログラムを溶解します。ゼロから30分の範囲の数100マイクロリットル反応制御サンプルを室温でインキュベートします。1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに300マイクロリットルのアルキル化バッファーを混ぜて反応を停止し、遊離チオール基のカルボニルメチル化を行います。100マイクロリットルの100マイクロリットルの10%TFAと水を加えて5分後に反応を停止し、サンプルをドライアイスに保存します。テキストプロトコルで詳しく説明されているように、サンプルに対してHPLCを実行します。酸化された形態のMS/MS分析のために、収集された各分率を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に少量移動する。残りのペプチドを0.1%TFAに溶解し、100ミリモルTCEP溶液上に適切な体積を加えて、最終的なTCEP濃度10ミリモルを得る。この時点で、選択的システインアルキル化は、ペプチドシーケンシングを介してチェックすることができる。2つのペプチドを中間にして、二硫化物ブリッジパターンの決定が可能である。異なる異性体のNMR分析は、個々のペプチド構造を明らかにするために行われる。エネルギーが最も低い20の構造と異性体のジスルフィド接続性が示されている。特に、逆相HPLC MS/MSフラグメンテーションとNMR分析の組み合わせは、ジスルフィド接続性の明確な同定のために必要とされます。二乗平均平方偏差値の比較により、硬質ペプチドが主により良い解決されたNMR構造を導くことが明らかになっています。このビデオでは、所望のジスルフィド結合パターンを持つペプチドを選択的に合成する方法を示す必要があります。また、テンダー質量分析を介して正しいジスルフィド接続性をチェックし、NMR分光法を介して三次元構造を得る可能性を示す。その開発後、この技術は、ペプチド合成の分野の研究者が三次元構造のためのジスルフィド結合パターンの重要性を探求し、結果的にそのようなペプチド異性体の活性を探求する道を開いた。この手順に従って、活性ASASのような他の方法は、特定の生物学的標的における異なるペプチド異性体の構造活性関係に関する洞察を得るために行うことができる。この方法はコノトキシンの合成および分析に関する洞察を提供することができるが、フェンゼン、ジスルフィドが豊富な動物毒素および他の複数のシステイン含有分子のような他のジスルフィドブリッジペプチドおよびタンパク質にも適用することができる。

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Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

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