Name: synthesis and structure determination of &#181;-conotoxin piiia isomers with different disulfide connectivities
Uploaded: 2018-10-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Structure Determination of Ã‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities at JoVE.com

Vi vil gjerne takke A. Resemann, F. J. Mayer og D. Suckau fra Bruker Daltonics GmbH Bremen; D. Tietze, A. A. Tietze, V. Schmidts og C. Thiele fra Darmstadt University of Technology; O. Ohlenschläger fra FLI Jena, M. Engeser fra Universitetet i Bonn; K. Kramer, A. Harzen og H. Nakagami fra Max Planck Institute for planteforskning avl, Köln; Susanne Neupert fra Institute for zoologi, Köln; og Biomolecular magnetisk resonans spektroskopi fasilitetene på universitet i Frankfurt for teknisk støtte, opplæringsmoduler, og tilgang til instrumenter. Økonomisk støtte ved Universitetet i Bonn til di er takknemlig anerkjent.

Merk: Alle aminosyrer brukes her var i L-konfigurasjonen. Initialene til aminosyrer og amino acid derivater ble brukt i henhold til anbefalingene nomenklatur komiteen av IUB og den IUPAC-IUB felleskommisjon for biokjemiske nomenklaturen.
1. solid-fase peptid syntese (SPPER)
Merk: Utføre syntese med en solid-fase peptid synthesizer. Utføre syntesen av lineær peptid forløperne til generelle rekkefølgen ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH2 bruker en standardprotoko...

<ol>
	<li>Fosgerau, K., Hoffmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+therapeutics:+Current+status+and+future+directions.">Peptide therapeutics: Current status and future directions.</a> Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).</li><li>Gongora-Ben&#237;tez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+disulfide+bonds.+peptides+as+therapeutics.">Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).</li><li>Tietze, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+diverse+&#181;-conotoxin+PIIIA+isomers+block+sodium+channel+NaV1.4.">Structurally diverse &#181;-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).</li><li>Carstens, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Activity+Studies+of+Cysteine-Rich+&#945;-Conotoxins+that+Inhibit+High-Voltage-Activated+Calcium+Channels+via+GABABReceptor+Activation+Reveal+a+Minimal+Functional+Motif.">Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich &#945;-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).</li><li>Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bridges:+Bringing+together+frustrated+structure+in+a+bioactive+peptide.">Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide.</a> Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).</li><li>Nielsen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+&#181;-conotoxin+PIIIA,+a+preferential+inhibitor+of+persistent+tetrodotoxin-sensitive+sodium+channels.">Solution structure of &#181;-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).</li><li>Heimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+&#181;-Conotoxin+PIIIA+Isomers+Revisited:+Impact+of+Cysteine+Pairing+on+Disulfide-Bond+Assignment+and+Structure+Elucidation.">Conformational &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation.</a> Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).</li><li>Chang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+pathways+of+oxidative+folding+of+disulfide+proteins:+Underlying+causes+and+folding+models.">Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models.</a> Biochemistry. 50 (17), 3414-3431 (2011).</li><li>B&#246;hm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+structure+and+function+of+factor+XIIIa-inhibitor+tridegin.">Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).</li><li>Postma, T. M., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+Formation+Strategies+in+Peptide+Synthesis.">Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).</li><li>Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid-Protecting+Groups.">Amino Acid-Protecting Groups.</a> Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).</li><li>Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bond+formation+in+peptides.">Disulfide bond formation in peptides.</a> Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).</li><li>Kamber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Synthesis+of+Cystine+Peptides+by+Iodine+Oxidation+of+S-Trityl-cysteine+and+S-Acetamidomethyl-cysteine+Peptides.">The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides.</a> Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).</li><li>Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Modulators+of+Regulator+of+G-Protein+Signaling+(RGS)+Proteins.">Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins.</a> Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).</li><li>Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regioselective+formation+of+multiple+disulfide+bonds+with+the+aid+of+postsynthetic+S-tritylation.">Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation.</a> Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).</li><li>Peigneur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#948;-conotoxins+synthesized+using+an+acid-cleavable+solubility+tag+approach+reveal+key+structural+determinants+for+NaV+subtype+selectivity.">&#948;-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).</li><li>Heimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Room-Temperature+Aprotic+and+Protic+Ionic+Liquids+for+Oxidative+Folding+of+Cysteine-Rich+Peptides.">Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides.</a> ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).</li><li>Kates, S. A., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , (2000).</li><li>W&#252;thrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+studies+of+structure+and+function+of+biological+macromolecules+(Nobel+lecture).">NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture).</a> Angewandte Chemie - International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).</li></ol>

Metoden beskrevet her for syntese av cystein-rik peptider som μ-PIIIA representerer en mulighet til å produsere selektivt disulfide-limt isomerene fra samme aminosyresekvens. Derfor etablerte metoder som Fmoc-basert solid fase peptid syntese18 og en definert beskytte gruppe strategi for regioselective dannelsen av disulfide obligasjoner ble brukt16. Solid-fase peptid syntese kan produsere amino acid sekvenser på en polymer støtte (harpiks) via automatisert syntese. Diss...

Bruk av bioaktive peptider i farmasøytisk forskning og utvikling er anerkjente, fordi de representerer potent og svært selektive forbindelser for bestemte biologiske mål1. For sine bioactivity, men er den tredimensjonale strukturen av stor betydning for å utføre struktur aktivitet forholdet studier2,3,4. Bortsett fra den primære aminosyre sekvensen som påvirker den totale konformasjon, stabilisere disulfide obligasjoner betydelig strukturen til cystein-rik peptider5. Flere disulfide-bro peptider inkluderer conotoxins som μ-PIIIA fra Conus purpurascens som inneholder seks cysteinene i sekvensen. Høy cystein innholdet kan teoretisk dannelsen av 15 disulfide isomerene. Riktig disulfide tilkobling er svært viktig for biological aktivitet6,7. Men spørsmålet som oppstår er om det er flere bioaktive konformasjon av naturlig forekommende peptider og hvis så, hvilke av disse isomerene besitter høyeste biologiske aktivitet? Ved μ-conotoxins, biologiske målene er spenning-gated natrium ionekanaler og μ-PIIIA spesielt er mest potente for subtyper NaV1.2, NaV1.4 og NaV1.73.
Syntese av disulfide-bro peptider kan oppnås ved hjelp av ulike metoder. Den mest hensiktsmessige metoden for dannelsen av disulfide obligasjoner i et peptid er såkalte oksidativt selv folding tilnærming. Her er lineær forløperen til den ønskede syklisk peptid syntetisert først bruker solid-fase peptid syntese, som er etter cleavage fra polymere støtte utsatt for oksidasjon i en buffer system. Redoks-aktive stoffer som redusert og oksidert glutathione (GSH/GSSG) er ofte lagt til fremme dannelsen av disulfide obligasjoner. Det hovedavdeling ulempen av buffer-støttet selv folding er at av disulfide obligasjoner ikke er dannet selektivt i en gradvis mote. Sammenlignet med den opprinnelige peptid, som ofte bare en bestemt disulfide isomer er beskrevet, er det mulig å få mange andre isomerene med denne tilnærmingen8. Μ-PIIIA har allerede vist resulterer i minst tre annerledes foldet isomerene på selv kaste i en tidligere studie3. Separasjon av slik en isomer blanding er ganske vanskelig på grunn av lignende tid hvis bruker brukt kromatografiske rensing metoder9. Målrettet syntesen av en bestemt isomer er derfor en fordel. Spesielt produsere en isomer med definerte disulfide tilkobling, en spesiell strategi er nødvendig som av disulfide obligasjoner er suksessivt lukket. Derfor er lineær forløperen bærer beskyttelse grupper på individuelle cystein parene syntetisert på polymer støtte. Etter eliminering, cystein parene er individuelt og suksessivt deprotected og koblet en oksidasjon reaksjon til ønsket disulfide obligasjoner10,11,12,13, 14 , 15 , 16. etter syntese og rensing av reaksjon produktet, er det nødvendig å bekrefte identiteten og disulfide tilkobling av egnet analytiske metoder. Mange analytiske metoder er tilgjengelige for utviklingen av de primære aminosyresekvens, f.eks., MS-/ MS, mens fastsettelse av disulfide tilkobling fortsatt mye mindre undersøkt. Fra kompleksiteten av slike flere disulfide-limt peptider, produktrelaterte urenheter (f.eks., fra disulfide desperat), på grunn av prøven forberedelse og arbeidet opp kan ytterligere komplisere analyse. I dette papiret viser vi at bruk av en kombinasjon av forskjellige analytiske teknikker er nødvendig å avklare utvetydig identiteten av disulfide obligasjoner i μ-PIIIA isomerene. Vi har kombinert brukt kromatografiske metoder med massespektrometri og gitt samme prøvene å NMR spektroskopi. I matrix-assistert laser desorption/ionization(MALDI) MS-/ MS analyse identifisert vi av disulfide obligasjoner med delvis reduksjon og iodoacetamide derivatization fordi ovenfra og ned analyse ikke er mulig for denne peptid. 2D NMR eksperimenter ble utført for å få en tredimensjonal struktur av hver isomer. Dermed, ved å kombinere forskjellige avanserte analytiske metoder, er det mulig å belyse riktig disulfide tilkobling og tredimensjonale strukturen i komplekse flere disulfide-limt peptider7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:979px;" width="979">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fmoc Rink amide resin</td>
			<td style="width:185px;">Novabiochem</td>
			<td style="width:191px;">855001</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Pyr(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">A-3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Arg(Pbf)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Asn(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Asp(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyp(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FAA1627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lys(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Ser(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gln(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Glu(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Trp(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Tyr(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">47623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Thr(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">His(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FDP1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">8510060</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">DMF</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">D119</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">DCM</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td>D37</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Piperidine</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td>A12442</td>
			<td>Flammable, Toxic, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">N-Methyl-Morpholin</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">224286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(Acm)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FAA1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">E-2495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">trifluoruacetic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">74564</td>
			<td>Toxic, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">phenol</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:191px;">1002060</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">thioanisol</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:191px;">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ethanedithiol</td>
			<td style="width:185px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:191px;">2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">diethyl ether</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:191px;">100,921</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">tert-butanol</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:191px;">L12338</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">A998</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">water</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">W5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">isopropanol</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:191px;">ACRO42383</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium hydroxide</td>
			<td style="width:185px;">AppliChem</td>
			<td style="width:191px;">A6579,1000</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">iodoacetamide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">iodine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">I0385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:191px;">110165</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ascorbic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">diphenylsulfoxide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">P35405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">anisol</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">96109</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">trichloromethylsilane</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">M85301</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sample dilution buffer</td>
			<td style="width:185px;">Laborservice Onken</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">106370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">disodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">795410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">citric acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium citrate dihydrate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tris-acetate</td>
			<td style="width:185px;">Carl Roth,&#160;</td>
			<td style="width:191px;">7125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">E26282&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">peptide calibration standard II</td>
			<td style="width:185px;">Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">8222570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;"></td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:185px;">Company</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">solid-phase peptide synthesizer</td>
			<td>Intavis Bioanalytical Instruments AG</td>
			<td style="width:191px;">EPS 221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:340px;">lyophilizer&#160;</td>
			<td>Martin Christ GmbH</td>
			<td style="width:191px;">&#160;Alpha 1-2 Ldplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">semipreparative HPLC</td>
			<td>Jasco</td>
			<td style="width:191px;">system PV-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Eurospher 100 C18 column (RP, 5 &#181;m particle size, 100 &#197; pore size, 250 x 32 mm)</td>
			<td style="width:185px;">Knauer</td>
			<td style="width:191px;">25QE181E2J</td>
			<td>purification of the linear peptide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:340px;">Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 &#181;m particle size, 300 &#197; pore size, 250 x 22 mm)</td>
			<td>Hichrom-VWR</td>
			<td style="width:191px;">HICH218TP1022</td>
			<td>purification of the oxidized peptide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:340px;">analytical HPLC&#160;</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td style="width:191px;">system LC-20AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 &#181;m particle size, 300 &#197; pore size, 250 x 4.6 mm)&#160;</td>
			<td>Hichrom-VWR</td>
			<td style="width:191px;">HICH218TP54</td>
			<td>analytical column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ground steel target (MTP 384)</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">NC0910436</td>
			<td>MALDI preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">C18-concentration filter (ZipTip)</td>
			<td style="width:185px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:191px;">ZTC18S096</td>
			<td>MALDI preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MALDI mass spectrometer</td>
			<td style="width:185px;">Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">ultraflex III TOF/TOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">amino acid analyzer</td>
			<td>Eppendorf-Biotronik GmbH</td>
			<td style="width:191px;">LC 3000 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">NMR spectrometer Bruker Avance III</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">Bruker Avance III 600 MHz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">computer program for molecular visualising</td>
			<td>YASARA Biosciences GmbH</td>
			<td style="width:191px;">Yasara structures</td>
			<td>NMR structure calculation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">computer program for MALDI data evaluation&#160;</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">flexAnalysis, BioTools</td>
			<td>MS/MS fragmentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">analog vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:191px;">VM 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:191px;">5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td style="width:191px;">EBA 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Rotational vacuum concentrator</td>
			<td style="width:185px;">Christ</td>
			<td style="width:191px;">2-18 Cdplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Analytical Balance</td>
			<td style="width:185px;">A&#38;D Instruments</td>
			<td style="width:191px;">GR-202-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and structure determination of &#181;-conotoxin piiia isomers with different disulfide connectivities

Peptider med et høyt antall cysteinene påvirkes vanligvis om tredimensjonale strukturen av disulfide tilkoblingen. Det er derfor svært viktig å unngå uønskede disulfide obligasjon formasjon under peptid syntese, fordi det kan resultere i en helt annen peptid struktur, og derfor endret bioactivity. Riktig dannelsen av flere disulfide obligasjoner i et peptid er imidlertid vanskelig å få ved å bruke standard selv folding metoder som konvensjonelle buffer oksidasjon protokoller, fordi flere disulfide connectivities kan dannes. Denne protokollen representerer en avansert strategi kreves for målrettet syntesen av flere disulfide-bro peptider som ikke kan syntetiseres via buffer oksidasjon i høy kvalitet og kvantitet. Studien viser anvendelsen av en distinkt beskytte gruppe strategi for syntese av alle mulige 3-disulfide-limt peptid en μ-conotoxin PIIIA på en målrettet måte. Peptidene er utarbeidet av Fmoc-basert solid fase peptid syntese bruker en beskyttelse gruppe strategi for definerte disulfide obligasjon formasjon. Respektive parene av cysteinene er beskyttet med trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) og tert-butyl (tBu) beskytte grupper for å sikre at under hvert oksidasjon steg bare de nødvendige cysteinene er deprotected og koblet. I tillegg til målrettet syntese, en kombinasjon av flere analytiske metoder til å avklare riktig folding og generasjon av ønsket peptid strukturer. Sammenligning av de ulike 3-disulfide-limt isomerene indikerer viktigheten av nøyaktig bestemmelse og kunnskap om disulfide tilkobling for beregning av tredimensjonale strukturen og tolkning av biologisk aktivitet av peptid isomerene. Analytiske karakterisering inneholder nøyaktig disulfide obligasjon forklaring via tandem massespektrometri (MS-/ MS) analyse som utføres med delvis redusert og alkylated derivater av intakt peptid-isomer produsert av en tilpasset protokoll. Videre fastsettes peptid strukturer ved hjelp av 2D kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) eksperimenter og kunnskap fra MS-/ MS analyse.

15 forskjellige disulfide-Bridge en μ-conotoxin-PIIIA er syntetisert og preget i detalj (figur 1). Disulfide obligasjoner identifiseres med delvis reduksjon og påfølgende MS-/ MS analyse (figur 2). NMR analyse av de forskjellige isomerene utføres (Figur 3) til å avsløre personlige peptid strukturer. Spesielt, kreves en kombinasjon av RP HPLC, MS-/ MS fragmentering og NMR analyse for entydig ide...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Structure Determination of Ã‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities at JoVE.com

Synthesis and Structure Determination of ÃƒÆ’Ã¢â‚¬Å¡Ãƒâ€šÃ‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Cystein-rik peptider brett i forskjellige tredimensjonale strukturer avhengig av disulfide tilkoblingen. Målrettet syntese av personlige disulfide isomerene kreves når bufferen oksidasjon ikke fører til ønsket disulfide tilkobling. Protokollen avtaler med selektiv syntesen av 3-disulfide-limt peptider og strukturell analyse bruker NMR og MS-/ MS studier.

Syntese og proteinstrukturer av μ-Conotoxin PIIIA isomerene med forskjellige Disulfide Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i peptidsyntesefeltet som å syntetisere disulfidrike peptider og bestemme deres tilsvarende disulfidbromønster. Den største fordelen med denne teknikken er at den gjør det mulig for selektiv syntese av forskjellige disulfid bondend peptid isomers og deres påfølgende kjemiske og strukturelle karakterisering. Vanligvis individer nye til denne metoden vil slite fordi hver disulfide rik peptid oppfører seg annerledes.Syntese og analyse må kanskje være delvis optimalisert for individuell peptid eller protein. Overfør reagensene som er oppført i tekstprotokollen til de tilsvarende fartøyene, og plasser dem i de aktuelle racketene til den faste fasepeptidsynthesizeren. Deretter legger du til 100 milligram tørr harpiks til reaksjonskolonnene og legger dem i racketen til synthesizeren.Start den solide fasen peptidsyntesen som beskrevet i tekstprotokollen. Etter at syntesen er fullført, lyofilisert harpiksen over natten. Nå cleave peptid fra harpiksen og utføre dyp beskyttelse av sidekjeder.For å gjøre dette kombinere tørket harpiks i en 12 milliliter rør og kjøle den til null grader Celsius på is. Først legger du til 150 mikroliter av en scavengerblanding, og tilsett deretter en milliliter 95% trifluorotaksyre per 100 milligram harpiks. La blandingen forsiktig riste i tre timer ved romtemperatur.Nå filtrerer du blandingen gjennom en glassfrit. Samle filtrat i rør, individuelt fylt med iskald dietyliser på en milliliter spalting blanding per åtte til 10 milliliter dietyleter. Peptidet utløses som en hvit fast stoff.Etter skylling og sentrifugering av rørene som beskrevet i tekstprotokollen, fryse-tørke peptidene. For å rense den lineære forløperen med halvforberedende kromatografi, tilsett ca. 70 milligram av det rå peptidet til et 15 milliliter rør. Oppløs deretter det rå peptidet i 0,1% TFA og en-til-en Acetonitrile til vann.Skill peptidblandingen ved hjelp av en gradering på null til 50% Eluent B over 120 minutter med en strømningshastighet på 10 milliliter per minutt. Samle brøkene i individuelle rør som de vises og forberede utvalgte fraksjoner for massespektrometri og HPLC analyse som beskrevet i tekstprotokollen. Frys-tørk brøkene og kombinere peer fraksjoner.Start selektiv dannelse av disulfidbindinger ved å utføre den første oksidasjonen. For å gjøre dette, oppløse 15 milligram av frysetørket lineær peptid i 105 milliliter av en isopropanol vannblanding. La blandingen røre på luft under grunnleggende forhold i 12 til 48 timer.Prosedyren for trinnvis oksidasjon er svært kritisk. Reaksjonskontroller tas i alle tre oksidasjonstrinn for å sikre individuell disulfidrik formasjon. Den tredje oksidasjonen er den mest avgjørende fordi disulfid scrambling kan oppstå når den optimale reaksjonstiden overskrides.Utfør nå den andre oksidasjonen. Oppløs 15 milligram av frysetørket peptid i 105 milliliter isopropanolvann, en molarsyreblanding. Tilsett 158 mikroliter av en 0,1 molar jodoppløsning i metanol til løsningen.Rør reaksjonen ved romtemperatur til oksidasjonen er fullført. Stopp deretter reaksjonen ved å tilsette 79 mikroliter av en molar askorbinsyre i vann. Til slutt utfører du den tredje oksidasjonen.Oppløs 15 milligram av frysetørket peptid i 5,5 milliliter TFA som inneholder en scavenger blanding. Utfell peptidet i rør som inneholder kald dietyliser ved en milliliter reaksjonsløsning per åtte til ti milliliter dietyleter. For å utføre peptid rensing på 15 milligram av frysetørket råolje produkt til en 15 milliliter tube.Oppløs råoljeproduktet i volumet av HPLC-prøveløkken ved hjelp av en blanding av 0,1% TFA og en til en Acetonitril til vann. Etter vortexing til fullstendig oppløsning, sentrifuger oppløsningen fra ett minutt på 3400 ganger G.Trekk opp 3,6 milliliter blandingen i en 5 milliliter sprøyte og injiser prøven uten luftbobler i injeksjonssløyfen. Start injeksjonen i HPLC-systemet.Rens peptidblandingen ved hjelp av en gradient på null til 50% Eluent B over 120 minutter med en strømningshastighet på 10 milliliter per minutt. Samle fraksjonene i individuelle rør slik de ser ut. Når kjøringen er fullført, klargjør du valgte brøker for MS- og HPLC-analyse som beskrevet i teksten.Frys alle brøker og lagre dem på minus 20 grader Celsius. For å utføre analytisk HPLC, overfør prøver av peptidfraksjonene eller reaksjonskontrollene til et HPLC hetteglass og oppløs det i blandingen av 0,1% TFA i ett til en Acetonitril til vann. Plasser HPLC-hetteglasset i den automatiske prøveren på det analytiske reversfase-HPLC-settet for å injisere 250 mikroliter av hver prøve.Bruk en gradient elution system på 0,1% TFA i vann som Eluent A i 0,1% TFA i Acetonitrile som en Eluent B.Analyser peptid ved hjelp av en gradient på 10% til 40% Eluent B over 30 minutter med en strømningshastighet på 1,0 milliliter per minutt. For å utføre aminosyreanalyse, overfør 100 mikrogram av det rene peptidet til et 1,5 milliliter mikrosentrigerrør og oppløs pulveret i 200 mikroliter på seks molar HCL. Etter overføring av løsningen til en glassforsterking, lukk ampullen ved å varme opp nakken med en bunsen brenner flamme.Plasser deretter et glassrør som holder ampullen i en varmeblokk i 24 timer ved 110 grader Celsius for hydrolyse. Etter 24 timer åpner du ampullen og overfører løsningen til et to milliliter mikrosentrigerrør. Sentrifuger løsningen i seks timer ved seksti grader Celsius og 210 ganger G i en rotasjonsvakuumkonsentrator.Oppløs deretter det hydrolyserte produktet i 192 mikroliter av den samplede fortynningsbufferen og overfør løsningen til et mikrosentriburalfilter. Etter å ha sentrifugert prøven i ett minutt ved 2300 ganger G, overfør 100 mikroliter av filtratet til et aminosyreanalyseprøverør. Plasser røret i aminosyreanalysatoren og start analysen.I løpet av denne tidligere reduksjonsprotokollen er det avgjørende å ta flere reaksjonskontroller for å oppnå to eller fire ganger kappa midometylerte arter som er uunnværlige for påfølgende disulfidanalyse via massespektrometri. Oppløs først 600 mikrogram av det rene peptidet i 1,2 milliliter med 0,05 molar citratebuffer som inneholder TCEP. Inkuber blandingen ved romtemperatur som tar flere 100 mikroliter reaksjonskontrollprøver fra null til 30 minutter.Bland prøvene i et 1,5 milliliter mikrosentrifugerrør med 300 mikroliter alkylasjonsbuffer for å stoppe reaksjonen og utføre karbonylmetylering av de frie tiolgruppene. Stopp reaksjonen etter fem minutter ved å legge til 100 mikroliter på 10% TFA og vann og lagre prøvene på tørris. Utfør nå HPLC på eksemplene som beskrevet i tekstprotokollen.Overfør en liten mengde av hver innsamlede fraksjon til et 1,5 milliliter mikrosentrigerrør for MS/MS-analyse av de oksiderte formene. Oppløs det gjenværende peptidet i 0,1% TFA i vann og tilsett et passende volum over en 100 millimolar TCEP-løsning for å få en endelig TCEP-konsentrasjon på 10 millimolar. På dette punktet kan selektiv cysteinalkylasjon kontrolleres via peptidsekvensering.Med de to peptidene i midten er en bestemmelse av disulfidbromønsteret mulig. NMR-analyse av de forskjellige isomers utføres for å avsløre de enkelte peptidstrukturene. De 20 strukturene med lavest energi samt disulfidtilkoblingen til de forskjellige isomers er vist.Spesielt er det nødvendig med en kombinasjon av omvendt fase HPLC MS/MS-fragmentering og NMR-analyse for entydig identifisering av disulfidtilkoblingen. Sammenligningen av roten gjennomsnittlig kvadratavviksverdi avklart at et stivt peptid for det meste fører til en bedre løst NMR-struktur. Denne videoen bør gi deg et eksempel på hvordan du selektivt syntetiserer peptider med et ønsket disulfidbindingsmønster.Det viser også muligheten til å sjekke riktig disulfidtilkobling via anbudsmassespektrometri og for å oppnå en tredimensjonal struktur via NMR-spektroskopi. Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen peptidsyntese for å utforske betydningen av disulfidbindingsmønstre for den tredimensjonale strukturen og dermed aktiviteten til slike peptid isomers. Etter denne prosedyren kan andre metoder som aktivitet ASAS utføres for å få innsikt i strukturaktivitetsrelasjoner av forskjellige peptid isomers på det spesifikke biologiske målet.Selv om denne metoden kan gi innsikt i syntese og analyse av konotoksiner, kan den også brukes på andre disulfidbropeptider og proteiner som fenzener, disulfidrike dyretoksiner og andre flere cysteinholdige molekyler.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Organic Chemistry

Chemistry

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Unit 1

Stereoisomerism

SCIENTISTS IN ACTION

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Produksjon av disulfide-stabilisert transmembrane Peptid Komplekser for Strukturelle studier

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

From Constructs to Crystals ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Towards Structure Determination of ÃƒÅ½Ã‚Â²-barrel Outer Membrane Proteins

Fra konstruerer Crystals - Mot Struktur Bestemmelse av β-fat ytre membranproteiner

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Syntese og karakterisering av supra Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

X-ray Powder Diffraksjon i Conservation Science: Mot Rutine Crystal Structure Bestemmelse av korrosjonsprodukter på Heritage Kunstverk

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Synthesis and Characterization of Fe-doped Aluminosilicate Nanotubes with Enhanced Electron Conductive Properties

Syntese og karakterisering av Fe-dopet Aluminosilicate nanorør med Enhanced Electron ledende egenskaper

The goal of the protocol is to synthesize Fe-doped aluminosilicate nanotubes of the imogolite type with the formula (OH)3Al2-xFexO3SiOH. Doping with Fe ...

Probing the Structure and Dynamics of Interfacial Water with Scanning Tunneling Microscopy and Spectroscopy

Verifiserer strukturen og dynamikken i Interfacial vann med Scanning Tunneling mikroskopi og spektroskopi

Water/solid interfaces are ubiquitous and play a key role in many environmental, biophysical, and technological processes. Resolving the internal ...

Fabricating High-viscosity Droplets using Microfluidic Capillary Device with Phase-inversion Co-flow Structure

Fabrikere høy viskositet dråper bruker Microfluidic kapillær enhet med fase-inversjon co flyt

The generation of monodisperse droplets with high viscosity has always been a challenge in droplet microfluidics. Here, we demonstrate a phase-inversion ...

Synthesis of Graphene Nanofluids with Controllable Flake Size Distributions

Syntese av grafen Nanofluider med kontrollerbar flak størrelse distribusjoner

A method for synthesizing graphene nanofluids with controllable flake size distributions is presented. Graphene nanoflakes can be obtained by the ...

Organic Structure-directing Agent-free Synthesis for *BEA-type Zeolite Membrane

Organisk struktur-regi agent-fri syntese for * BEA-type Zeolite Membran

Membrane separation has drawn attention as a novel-energy saving separation process. Zeolite membranes have great potential for hydrocarbon separation in ...