Name: synthesis and structure determination of &#181;-conotoxin piiia isomers with different disulfide connectivities
Uploaded: 2018-10-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Structure Determination of Ã‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить A. Resemann, Майер J. F. и д Suckau от компании Bruker Daltonics GmbH Бремен; D. Титце, а. а. Титце, V. варьете и C. Thiele из технологического университета Дармштадта; O. Ohlenschläger из FLI Jena, м. Engeser из университета Бонна; K. Крамер, A. Harzen и H. Накагами из Института Макса Планка для исследования селекции растений, Кёльн; Susanne Neupert из Института зоологии, Кёльн; биомолекулярных магнитно-резонансная спектроскопия объектов Франкфуртского университета для технической поддержки, учебные модули, и доступ к документам. Финансовой поддержке Боннского университета к д.и. с благодарностью.

Примечание: Все аминокислоты, используемые в настоящем документе были в L-конфигурации. Согласно рекомендации Комитета IUB номенклатуры и совместной комиссии по биохимической номенклатуры IUPAC-IUB были использованы сокращения аминокислот, и аминокислоты производные.
1. твер?...

<ol>
	<li>Fosgerau, K., Hoffmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+therapeutics:+Current+status+and+future+directions.">Peptide therapeutics: Current status and future directions.</a> Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).</li><li>Gongora-Ben&#237;tez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+disulfide+bonds.+peptides+as+therapeutics.">Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).</li><li>Tietze, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+diverse+&#181;-conotoxin+PIIIA+isomers+block+sodium+channel+NaV1.4.">Structurally diverse &#181;-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).</li><li>Carstens, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Activity+Studies+of+Cysteine-Rich+&#945;-Conotoxins+that+Inhibit+High-Voltage-Activated+Calcium+Channels+via+GABABReceptor+Activation+Reveal+a+Minimal+Functional+Motif.">Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich &#945;-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).</li><li>Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bridges:+Bringing+together+frustrated+structure+in+a+bioactive+peptide.">Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide.</a> Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).</li><li>Nielsen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+&#181;-conotoxin+PIIIA,+a+preferential+inhibitor+of+persistent+tetrodotoxin-sensitive+sodium+channels.">Solution structure of &#181;-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).</li><li>Heimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+&#181;-Conotoxin+PIIIA+Isomers+Revisited:+Impact+of+Cysteine+Pairing+on+Disulfide-Bond+Assignment+and+Structure+Elucidation.">Conformational &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation.</a> Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).</li><li>Chang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+pathways+of+oxidative+folding+of+disulfide+proteins:+Underlying+causes+and+folding+models.">Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models.</a> Biochemistry. 50 (17), 3414-3431 (2011).</li><li>B&#246;hm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+structure+and+function+of+factor+XIIIa-inhibitor+tridegin.">Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).</li><li>Postma, T. M., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+Formation+Strategies+in+Peptide+Synthesis.">Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).</li><li>Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid-Protecting+Groups.">Amino Acid-Protecting Groups.</a> Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).</li><li>Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bond+formation+in+peptides.">Disulfide bond formation in peptides.</a> Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).</li><li>Kamber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Synthesis+of+Cystine+Peptides+by+Iodine+Oxidation+of+S-Trityl-cysteine+and+S-Acetamidomethyl-cysteine+Peptides.">The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides.</a> Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).</li><li>Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Modulators+of+Regulator+of+G-Protein+Signaling+(RGS)+Proteins.">Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins.</a> Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).</li><li>Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regioselective+formation+of+multiple+disulfide+bonds+with+the+aid+of+postsynthetic+S-tritylation.">Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation.</a> Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).</li><li>Peigneur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#948;-conotoxins+synthesized+using+an+acid-cleavable+solubility+tag+approach+reveal+key+structural+determinants+for+NaV+subtype+selectivity.">&#948;-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).</li><li>Heimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Room-Temperature+Aprotic+and+Protic+Ionic+Liquids+for+Oxidative+Folding+of+Cysteine-Rich+Peptides.">Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides.</a> ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).</li><li>Kates, S. A., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , (2000).</li><li>W&#252;thrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+studies+of+structure+and+function+of+biological+macromolecules+(Nobel+lecture).">NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture).</a> Angewandte Chemie - International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).</li></ol>

Метод, описанный здесь для синтеза пептидов хвоща богатые, такие как µ-PIIIA представляет возможность производить избирательно дисульфида стружечные изомеров от такую же последовательность аминокислот. Таким образом созданы такие методы, как на основе Fmoc твердых этапа пептидного синте?...

Использование биоактивные пептиды в фармацевтических исследований и разработок является признанным, потому что они представляют собой мощный и высокоселективных соединений для конкретных биологических цели1. Для их биологическую однако, трехмерная структура имеет большое значение для того, чтобы выполнять структура активность отношения исследования2,3,4. Помимо первичного аминокислотной последовательности, которая влияет на общую конформации дисульфидными облигаций значительно стабилизации структуры хвоща богатые пептиды5. Несколько мост дисульфидных пептиды включают конотоксины например µ-PIIIA от конус скворец , который содержит шесть которым в своей последовательности. Это высокий хвоща содержимое теоретически позволяет формирование 15 дисульфида изомеров. Правильные дисульфида подключения является очень важным для биологической активности6,7. Однако возникает вопрос есть ли более чем одной биоактивные конформации естественных пептидов и если да, какие из этих изомеров обладает высокой биологической активностью? В случае µ конотоксины, биологической цели являются воротами напряжения натрия ионных каналов, и µ-PIIIA, в частности, является самым мощным для подтиповV1.2, Na Na NaV1.7 иV1.43.
Синтез пептидов, дисульфид мост может быть достигнуто с помощью различных методов. Наиболее удобный способ для образования дисульфидных связей внутри пептид является так называемого оксидативного самостоятельно складной подход. Здесь линейная прекурсора желаемый циклические пептиды синтезируется, сначала с помощью твердофазный пептидного синтеза, который после расщепления от полимерных поддержки подвергается окислению в буферную систему. Редокс активных агентов, таких как восстановленного и окисленного глутатиона (GSH/GSSG) часто добавляются для поощрения образования дисульфидных связей. Основным недостатком буфер поддерживается собственной складывания является, что дисульфидными облигаций формируются в ступенчатой моды не выборочно. По сравнению с родной пептид, для которого часто описывается только один конкретный дисульфида изомер, это можно получить многочисленные другие изомеры с этот подход8. Уже было показано, что мкг-PIIIA привести к по крайней мере три по-разному сложенном изомеров после индивидуальной складывающиеся в предыдущем исследовании3. Разделение такой смеси изомером является довольно трудно из-за аналогичные удержания раз, если с помощью хроматографических очистки методы9. Поэтому выгодно целевых синтез определенных изомеров. Производить специально требуемого изомер с определенными дисульфида связи, специальной стратегии в котором дисульфидными облигаций последовательно закрываются. Таким образом линейной прекурсоров, перевозящих отдельные группы защиты в отдельных хвоща пар синтезируется на поддержку полимера. После ликвидации хвоща пары являются индивидуально и последовательно deprotected и связаны в реакции окисления приносить желаемых дисульфидными облигаций10,11,12,13, 14 , 15 , 16. после синтеза и очистки продукта реакции, он требуется для подтверждения личности и соединения дисульфида подходящих методов анализа. Многочисленные аналитические методы доступны для выяснения основной аминокислотной последовательности, например., МС/МС, в то время как определение дисульфида подключения по-прежнему остается гораздо менее исследованы. Помимо сложности таких несколько дисульфида стружечные пептиды, связанные с продуктом примеси (например., от дисульфида скремблирования), из-за образец подготовки и работы могут еще более усложнить анализ. В этом документе мы покажем, что использование сочетания различных аналитических методов необходимо недвусмысленно разъяснить удостоверение дисульфидных связей в изомеров µ-PIIIA. Мы есть комбинированные методы хроматографии с масс-спектрометрии и же образцы для ЯМР спектроскопии. В desorption/ionization(MALDI) при содействии матрицы лазерный анализ МС/МС мы определили дисульфидными облигаций с помощью частичного сокращения и iodoacetamide деривации, потому что сверху вниз анализ не является возможным для этого пептида. Для того чтобы получить трехмерную структуру каждого изомера были эксперименты 2D ЯМР. Таким образом путем объединения различных сложных аналитических методов, это возможно для выяснения должным образом дисульфида подключения и трехмерной структуры комплекса несколько дисульфида стружечные пептиды7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:979px;" width="979">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fmoc Rink amide resin</td>
			<td style="width:185px;">Novabiochem</td>
			<td style="width:191px;">855001</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Pyr(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">A-3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Arg(Pbf)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Asn(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Asp(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyp(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FAA1627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lys(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Ser(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gln(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Glu(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Trp(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Tyr(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">47623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Thr(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">His(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FDP1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">8510060</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">DMF</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">D119</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">DCM</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td>D37</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Piperidine</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td>A12442</td>
			<td>Flammable, Toxic, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">N-Methyl-Morpholin</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">224286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(Acm)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FAA1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">E-2495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">trifluoruacetic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">74564</td>
			<td>Toxic, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">phenol</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:191px;">1002060</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">thioanisol</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:191px;">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ethanedithiol</td>
			<td style="width:185px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:191px;">2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">diethyl ether</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:191px;">100,921</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">tert-butanol</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:191px;">L12338</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">A998</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">water</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">W5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">isopropanol</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:191px;">ACRO42383</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium hydroxide</td>
			<td style="width:185px;">AppliChem</td>
			<td style="width:191px;">A6579,1000</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">iodoacetamide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">iodine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">I0385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:191px;">110165</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ascorbic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">diphenylsulfoxide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">P35405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">anisol</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">96109</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">trichloromethylsilane</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">M85301</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sample dilution buffer</td>
			<td style="width:185px;">Laborservice Onken</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">106370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">disodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">795410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">citric acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium citrate dihydrate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tris-acetate</td>
			<td style="width:185px;">Carl Roth,&#160;</td>
			<td style="width:191px;">7125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">E26282&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">peptide calibration standard II</td>
			<td style="width:185px;">Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">8222570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;"></td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:185px;">Company</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">solid-phase peptide synthesizer</td>
			<td>Intavis Bioanalytical Instruments AG</td>
			<td style="width:191px;">EPS 221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:340px;">lyophilizer&#160;</td>
			<td>Martin Christ GmbH</td>
			<td style="width:191px;">&#160;Alpha 1-2 Ldplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">semipreparative HPLC</td>
			<td>Jasco</td>
			<td style="width:191px;">system PV-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Eurospher 100 C18 column (RP, 5 &#181;m particle size, 100 &#197; pore size, 250 x 32 mm)</td>
			<td style="width:185px;">Knauer</td>
			<td style="width:191px;">25QE181E2J</td>
			<td>purification of the linear peptide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:340px;">Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 &#181;m particle size, 300 &#197; pore size, 250 x 22 mm)</td>
			<td>Hichrom-VWR</td>
			<td style="width:191px;">HICH218TP1022</td>
			<td>purification of the oxidized peptide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:340px;">analytical HPLC&#160;</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td style="width:191px;">system LC-20AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 &#181;m particle size, 300 &#197; pore size, 250 x 4.6 mm)&#160;</td>
			<td>Hichrom-VWR</td>
			<td style="width:191px;">HICH218TP54</td>
			<td>analytical column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ground steel target (MTP 384)</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">NC0910436</td>
			<td>MALDI preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">C18-concentration filter (ZipTip)</td>
			<td style="width:185px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:191px;">ZTC18S096</td>
			<td>MALDI preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MALDI mass spectrometer</td>
			<td style="width:185px;">Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">ultraflex III TOF/TOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">amino acid analyzer</td>
			<td>Eppendorf-Biotronik GmbH</td>
			<td style="width:191px;">LC 3000 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">NMR spectrometer Bruker Avance III</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">Bruker Avance III 600 MHz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">computer program for molecular visualising</td>
			<td>YASARA Biosciences GmbH</td>
			<td style="width:191px;">Yasara structures</td>
			<td>NMR structure calculation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">computer program for MALDI data evaluation&#160;</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">flexAnalysis, BioTools</td>
			<td>MS/MS fragmentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">analog vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:191px;">VM 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:191px;">5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td style="width:191px;">EBA 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Rotational vacuum concentrator</td>
			<td style="width:185px;">Christ</td>
			<td style="width:191px;">2-18 Cdplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Analytical Balance</td>
			<td style="width:185px;">A&#38;D Instruments</td>
			<td style="width:191px;">GR-202-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and structure determination of &#181;-conotoxin piiia isomers with different disulfide connectivities

Пептиды с высокое количество которым находятся обычно под влиянием относительно трехмерной структуры их соединения дисульфида. Он таким образом очень важно, чтобы избежать нежелательных дисульфидными облигаций формирования во время синтеза пептида, потому что это может привести к совершенно разных пептидных структуры и соответственно изменены биологическую. Однако правильное формирование нескольких дисульфидными облигаций в пептид трудно получить с помощью стандартных методов самостоятельной складной как обычного буфера окисления протоколы, потому что могут быть сформированы несколько дисульфида связность. Этот протокол представляет передовые стратегии, необходимые для целенаправленного синтеза нескольких мост дисульфидных пептиды, которые не могут быть синтезированы через буфер окисления в высокое качество и количество. Исследование демонстрирует применение различных защиты группы стратегии для синтеза всех изомеров возможно 3-дисульфид стружечные пептид µ-conotoxin PIIIA в целевой путь. Пептиды подготовленный на основе Fmoc твердой фазы пептидного синтеза с использованием стратегию защиты группы для формирования определенных дисульфидными облигаций. Соответствующих пар которым защищены с trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) и трет-бутила (tбу) защита группы чтобы убедиться, что во время каждого шага окисления только необходимые которым deprotected и связаны. Помимо целенаправленного синтеза сочетание нескольких аналитических методов используется для уточнить правильный складные и поколения желаемого пептид структур. Сравнение различных изомеров 3-дисульфид стружечные указывает на важность точного определения и знание дисульфида подключения для расчета трехмерной структуры и интерпретации биологических деятельность пептида изомеров. Аналитическая характеристика включает точное дисульфида Бонд разяснения через тандем масс-спектрометрия (МС/МС) анализ, который проводится с частично сокращенной и алкилированные производные нетронутыми пептид изомера, подготовлен адаптированный протокол. Кроме того пептид структуры определяются с помощью 2D ядерного магнитного резонанса (ЯМР) эксперименты и знания, полученные от анализа МС/МС.

15 различных мост дисульфидных изомеров PIIIA µ-conotoxin синтезированы и характеризуется в деталях (рис. 1). Дисульфидными облигаций определяются путем частичного сокращения и последующего анализа МС/МС (рис. 2). (Рис. 3) выявить о...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Structure Determination of Ã‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities at JoVE.com

Synthesis and Structure Determination of ÃƒÆ’Ã¢â‚¬Å¡Ãƒâ€šÃ‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Цистеин богатые пептиды сложить в собственный трехмерной структуры в зависимости от их соединения дисульфида. При буфера окисления не приведет к желаемой дисульфида подключения требуется целевой синтез отдельных дисульфида изомеров. Протокол касается селективный синтез пептидов, 3-дисульфид стружечные и их структурного анализа с помощью исследования ЯМР и МС/МС.

Синтез и определение структуры изомеров PIIIA µ-Conotoxin с различными дисульфида связность

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области синтеза пептидов, такие как синтез богатых дисульфидом пептидов и определение их соответствующего дисульфидного моста. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет селективного синтеза различных дисульфидных связующихся пептидных изомеров и их последующей химической и структурной характеристики. Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться, потому что каждый дисульфид богатых пептид ведет себя по-разному.Синтез и анализ, возможно, придется частично оптимизировать для отдельных пептида или белка. Перенесите реагенты, перечисленные в текстовом протоколе, на соответствующие сосуды и поместите их в соответствующие ракетки твердого фазового пептидного синтезатора. Затем добавьте 100 миллиграммов сухой смолы в реакционной колонке и положите их в ракетку синтезатора.Начните синтез пептида твердой фазы, как описано в текстовом протоколе. После завершения синтеза лиофилизировал смолу на ночь. Теперь вылепить пептид из смолы и выполнять глубокую защиту боковых цепей.Для этого смешайте высушенную смолу в 12 миллилитровой трубке и охладите ее до нуля градусов по Цельсию на льду. Сначала добавьте 150 микролитров смеси мусорщика, затем добавьте один миллилитр 95%трифтороацетической кислоты на 100 миллиграммов смолы. Оставьте смесь нежно встряхивая в течение трех часов при комнатной температуре.Теперь, фильтровать смесь через стеклянный фрит. Соберите фильтрат в трубках, индивидуально наполненных ледяным дитил эфиром на один миллилитр смеси расщепления на 8-10 миллилитров дителилового эфира. Пептид осаждается как белое твердое тело.После полоскания и центрифугирования труб, как описано в текстовом протоколе, заморозить-высушить пептиды. Для очистки линейного прекурсора с полуперпаративной хроматографией добавьте около 70 миллиграммов сырого пептида в 15 миллилитровую трубку. Затем растворите сырой пептид в 0.1%TFA и один-к-одному Ацетонитрил в воду.Отделяйте пептидную смесь, используя градиент от нуля до 50% Eluent B в течение 120 минут со скоростью потока 10 миллилитров в минуту. Соберите фракции в отдельных трубках по мере их появляются и подготовьв выбранные фракции для анализа масс-спектрометрии и HPLC, как описано в текстовом протоколе. Заморозить-высушить фракции и объединить одноранговые фракции.Начните селективное образование дисульфидных связей, выполняя первое окисление. Для этого растворите 15 миллиграммов лиофилизированных линейных пептидов в 105 миллилитров изопропаноловой водяной смеси. Оставьте смесь перемешивания на воздухе в основных условиях в течение 12 до 48 часов.Процедура окисления пошаговая очень критична. Контроль реакции принимаются во всех трех шагах окисления для обеспечения индивидуального образования диульфида. Третье окисление является наиболее важным, поскольку дисульфидный скремблирование может произойти, когда оптимальное время реакции превышено.Теперь выполните второе окисление. Растворите 15 миллиграммов лиофилизированных пептидов в 105 миллилитров изопропаноловой воды, одной молярной смеси соляной кислоты. Добавьте в раствор 158 микролитров раствора молярного йода в метаноле 0,1.Перемешайте реакцию при комнатной температуре до завершения окисления. Затем остановите реакцию, добавив в воду 79 микролитров одной молярной аскорбиновой кислоты. Наконец выполнить третье окисление.Растворите 15 миллиграммов лиофилизированных пептидов в 5,5 миллилитров TFA, содержащих смесь мусорщика. Осадок пептида в трубки, содержащие холодный диэтил эфир на один миллилитр реакционной раствора на восемь-десять миллилитров диэтил эфира. Для выполнения пептидной очистки на 15 миллиграммов лиофилизированный сырой продукт в 15 миллилитров трубки.Растворите сырой продукт в объеме цикла образца HPLC, используя смесь 0,1%TFA и один к одному Ацетонитрил в воду. После вихря до полного растворения, центрифуга раствор от одной минуты в 3400 раз G.Draw до 3,6 миллилитров смесь в 5 миллилитров шприц и вводить образец без каких-либо пузырьков воздуха в цикл инъекции. Начните инъекцию в систему HPLC.Очистить пептидную смесь с помощью градиента от нуля до 50% Eluent B в течение 120 минут со скоростью потока 10 миллилитров в минуту. Соберите фракции в отдельных трубках, как они появляются. После завершения выполнения подготовьтесь к выбранным фракциям для анализа MS и HPLC, как описано в тексте.Заморозить все фракции и хранить их при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Для выполнения аналитических HPLC, передача образцов пептидных фракций или контроля реакции в флакон HPLC и растворить его в смеси 0,1%TFA в один к одному Ацетонитрил в воду. Поместите флакон HPLC в автоотборчик аналитической обратной фазы HPLC, установленный для впрыска 250 микролитров каждого образца.Используйте систему градиентного элюциона 0,1%TFA в воде как Eluent A в 0.1%TFA в Acetonitrile как Eluent B.Analyze пептид, используя градиент от 10%до 40%Eluent B в течение 30 минут со скоростью потока 1,0 миллилитра в минуту. Для проведения анализа аминокислот перенесите 100 микрограммов чистого пептида в 1,5 миллилитровую микро центрифугу и растворите порошок в 200 микролитров шести молярных HCL. После переноса раствора в стеклянную ампулу, закройте ампулу, нагревая шею пламенем горелки бунсена.Затем поместите стеклянную трубку, держащую ампулу в отопительном блоке в течение 24 часов при 110 градусах цельсия для гидролиза. Через 24 часа откройте ампулу и перенесите раствор в двухми миллилитровую микро-центрифугу. Центрифуга раствора в течение шести часов при шестидесяти градусах Цельсия и 210 раз G в вращательном вакуумном концентраторе.Затем растворите гидролизованный продукт в 192 микролитерах пробованного буфера разбавления и перенесите раствор в микро центробежный фильтр. После центрифугирования образца в течение одной минуты при 2300 раз G, передача 100 микролитров фильтрата в аминокислотный анализ образца трубки. Поместите трубку в анализатор аминокислот и начните анализ.В течение этого прошлого протокола сокращения, крайне важно принять несколько реакций контроля для того, чтобы получить в два или четыре раза каппа мидо метилированных видов, которые необходимы для последующего анализа дисульфида с помощью масс-спектрометрии. Сначала растворите 600 микрограммов чистого пептида в 1,2 миллилитров 0,05 молярного буфера цитрата, содержащего TCEP. Инкубировать смесь при комнатной температуре, принимая несколько 100 образцов контроля реакции микролитров в диапазоне от нуля до 30 минут.Смешайте образцы в 1,5 миллилитр микро-центрифуг трубки с 300 микролитров алкиляционного буфера, чтобы остановить реакцию и выполнить карбонил метилирования свободных групп тиола. Остановите реакцию через пять минут, добавив 100 микролитров 10% TFA и воды и хранить образцы на сухом льду. Теперь выполните HPLC по образцам, описанным в текстовом протоколе.Перенесите небольшое количество каждой собранной фракции в 1,5-миллилитровую микро-центрифугу для анализа окислимых форм MS/MS. Растворите оставшийся пептид в 0.1%TFA в воде и добавьте соответствующий объем в течение 100 миллимолярского раствора TCEP, чтобы получить окончательную концентрацию TCEP 10 миллимоляра. На этом этапе селективное алкиляция цистеин может быть проверена с помощью пептидного секвенирования.С двумя пептидами в середине, определение дисульфидного моста картина возможна. NmR анализ различных изомеров проводится, чтобы выявить отдельные пептидные структуры. Показаны 20 структур с самыми низкими энергиями, а также дисульфидная связь различных изомеров.Примечательно, что для однозначной идентификации дисульфидной связи требуется сочетание обратной фазы фрагментации HPLC MS/MS и анализа ЯМР. Сравнение среднего значения квадратного отклонения корня разъясняет, что жесткий пептид в основном приводит к лучшей разрешенной структуре ЯМР. Это видео должно дать вам пример, как избирательно синтезировать пептиды с желаемой дисульфидной схемой связи.Он также показывает возможность проверить правильное соединение дисульфида с помощью тендерной масс-спектрометрии и получить трехмерную структуру с помощью спектроскопии ЯМР. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области пептидного синтеза, чтобы исследовать важность дисульфидных связей моделей для трехмерной структуры и, следовательно, активность таких пептидных изомеров. После этой процедуры, другие методы, такие как деятельность ASAS могут быть выполнены для того, чтобы получить представление о структуре деятельности отношений различных пептидных изомеров на конкретной биологической цели.Хотя этот метод может дать представление о синтезе и анализе конотоксинов, он также может быть применен к другим пептидам и белкам дисульфидного моста, таким как фензены, богатые дисульфидными токсинами животных и другими множественными цистеинами, содержащими молекулы.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Organic Chemistry

Chemistry

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Unit 1

Stereoisomerism

SCIENTISTS IN ACTION

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Производство дисульфид-стабилизировались трансмембранного пептидные комплексы для структурных исследований

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

From Constructs to Crystals ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Towards Structure Determination of ÃƒÅ½Ã‚Â²-barrel Outer Membrane Proteins

От конструктов в кристаллах - в сторону структуры Определение β-ствольных белки наружной мембраны

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Синтез и характеристика супрамолекулярных коллоидов

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

Рентгеновская дифракция в порошок по сохранению науки: На пути к Обычной кристаллической структуры Определение продуктов коррозии на наследие предметов искусства

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Synthesis and Characterization of Fe-doped Aluminosilicate Nanotubes with Enhanced Electron Conductive Properties

Синтез и свойства Fe-легированного алюмосиликатных нанотрубках с расширенными Electron проводящими свойствами

The goal of the protocol is to synthesize Fe-doped aluminosilicate nanotubes of the imogolite type with the formula (OH)3Al2-xFexO3SiOH. Doping with Fe ...

Probing the Structure and Dynamics of Interfacial Water with Scanning Tunneling Microscopy and Spectroscopy

Проверка структуры и динамики межфазного воды с сканирование туннелирования микроскопии и спектроскопии

Water/solid interfaces are ubiquitous and play a key role in many environmental, biophysical, and technological processes. Resolving the internal ...

Fabricating High-viscosity Droplets using Microfluidic Capillary Device with Phase-inversion Co-flow Structure

Изготовления капель высокой вязкости, используя Microfluidic капиллярного устройства с фазы инверсии потока со структурой

The generation of monodisperse droplets with high viscosity has always been a challenge in droplet microfluidics. Here, we demonstrate a phase-inversion ...

Synthesis of Graphene Nanofluids with Controllable Flake Size Distributions

Синтез графеновых наножидкости с контролируемыми распределениями размеров хлопьев

A method for synthesizing graphene nanofluids with controllable flake size distributions is presented. Graphene nanoflakes can be obtained by the ...

Organic Structure-directing Agent-free Synthesis for *BEA-type Zeolite Membrane

Органическая структура-направление Без агента синтеза для ЗБЕА типа цеолит Мембрана

Membrane separation has drawn attention as a novel-energy saving separation process. Zeolite membranes have great potential for hydrocarbon separation in ...