Name: synthesis and structure determination of &#181;-conotoxin piiia isomers with different disulfide connectivities
Uploaded: 2018-10-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Structure Determination of Ã‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a A. Resemann, F. J. Mayer y D. Suckau de Bruker Daltonics GmbH Bremen; D. Tietze, A. A. Tietze, V. Schmidts y Thiele C. de la Universidad Tecnológica de Darmstadt; O. Ohlenschläger de la Jena FLI, M. Engeser de la Universidad de Bonn; K. Kramer, A. Harzen y H. Nakagami del Instituto Max Planck para la investigación de crianza de planta, Colonia; Susanne Neupert del Instituto de Zoología de la Colonia; y las instalaciones de espectroscopia de resonancia magnética Biomolecular de la Universidad de Francfort para técnico soporte, módulos, de formación y acceso a instrumentos. Se agradece el apoyo financiero de la Universidad de Bonn a D.I..

Nota: Todos los aminoácidos en este documento fueron en la configuración L. Se utilizan las abreviaturas de los aminoácidos y derivados de aminoácidos según las recomendaciones de la Comisión del IUB de nomenclatura y de la Comisión conjunta de IUPAC-IUB de nomenclatura bioquímica.
1. síntesis de péptidos fase sólida (SPPS)
Nota: Realizar la síntesis con un sintetizador de péptidos de fase sólida. Realizar la síntesis de los precursores del péptido lin...

<ol>
	<li>Fosgerau, K., Hoffmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+therapeutics:+Current+status+and+future+directions.">Peptide therapeutics: Current status and future directions.</a> Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).</li><li>Gongora-Ben&#237;tez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+disulfide+bonds.+peptides+as+therapeutics.">Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).</li><li>Tietze, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+diverse+&#181;-conotoxin+PIIIA+isomers+block+sodium+channel+NaV1.4.">Structurally diverse &#181;-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).</li><li>Carstens, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Activity+Studies+of+Cysteine-Rich+&#945;-Conotoxins+that+Inhibit+High-Voltage-Activated+Calcium+Channels+via+GABABReceptor+Activation+Reveal+a+Minimal+Functional+Motif.">Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich &#945;-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).</li><li>Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bridges:+Bringing+together+frustrated+structure+in+a+bioactive+peptide.">Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide.</a> Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).</li><li>Nielsen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+&#181;-conotoxin+PIIIA,+a+preferential+inhibitor+of+persistent+tetrodotoxin-sensitive+sodium+channels.">Solution structure of &#181;-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).</li><li>Heimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+&#181;-Conotoxin+PIIIA+Isomers+Revisited:+Impact+of+Cysteine+Pairing+on+Disulfide-Bond+Assignment+and+Structure+Elucidation.">Conformational &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation.</a> Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).</li><li>Chang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+pathways+of+oxidative+folding+of+disulfide+proteins:+Underlying+causes+and+folding+models.">Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models.</a> Biochemistry. 50 (17), 3414-3431 (2011).</li><li>B&#246;hm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+structure+and+function+of+factor+XIIIa-inhibitor+tridegin.">Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).</li><li>Postma, T. M., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+Formation+Strategies+in+Peptide+Synthesis.">Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).</li><li>Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid-Protecting+Groups.">Amino Acid-Protecting Groups.</a> Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).</li><li>Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bond+formation+in+peptides.">Disulfide bond formation in peptides.</a> Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).</li><li>Kamber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Synthesis+of+Cystine+Peptides+by+Iodine+Oxidation+of+S-Trityl-cysteine+and+S-Acetamidomethyl-cysteine+Peptides.">The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides.</a> Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).</li><li>Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Modulators+of+Regulator+of+G-Protein+Signaling+(RGS)+Proteins.">Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins.</a> Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).</li><li>Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regioselective+formation+of+multiple+disulfide+bonds+with+the+aid+of+postsynthetic+S-tritylation.">Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation.</a> Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).</li><li>Peigneur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#948;-conotoxins+synthesized+using+an+acid-cleavable+solubility+tag+approach+reveal+key+structural+determinants+for+NaV+subtype+selectivity.">&#948;-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).</li><li>Heimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Room-Temperature+Aprotic+and+Protic+Ionic+Liquids+for+Oxidative+Folding+of+Cysteine-Rich+Peptides.">Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides.</a> ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).</li><li>Kates, S. A., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , (2000).</li><li>W&#252;thrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+studies+of+structure+and+function+of+biological+macromolecules+(Nobel+lecture).">NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture).</a> Angewandte Chemie - International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).</li></ol>

El método descrito en este documento para la síntesis de péptidos ricos en cisteína como μ-PIIIA representa una posibilidad para producir selectivamente disulfuro-consolidado isómeros de la misma secuencia de aminoácidos. Por lo tanto, estableció métodos como sólida base de Fmoc fase de síntesis de péptido18 y una estrategia de grupo de protección definida para la formación regioselectiva de disulfuro fueron utilizadas16. La síntesis del peptide de la fase s?...

El uso de péptidos bioactivos en investigación farmacéutica y desarrollo es altamente reconocido, debido a que representan compuestos potentes y altamente selectivos para objetivos biológicos específicos1. Para su bioactividad, sin embargo, la estructura tridimensional es de gran importancia para realizar la estructura y actividad relación estudios2,3,4. Aparte de la secuencia primaria del aminoácido que influye en la conformación general, enlaces de disulfuro estabilizan significativamente la estructura de péptidos ricos en cisteína5. Varios péptidos puente disulfuro incluyen conotoxinas como μ-PIIIA de Conus purpurascens que contiene seis cisteínas en su secuencia. Este contenido de cisteína alta permite teóricamente la formación de 15 isómeros de disulfuro. La conectividad de disulfuro correcto es muy importante para la actividad biológica6,7. ¿Sin embargo, la pregunta que surge es si existe más de una conformación bioactivo péptidos naturalmente y si por lo tanto, cuál de los isómeros posee la más alta actividad biológica? En el caso de μ-conotoxinas, los blancos biológicos son canales de sodio voltaje-bloqueado del ion, y μ-PIIIA en particular es más potente para los subtipos de NaV1.2, NaV1.4 y NaV1.73.
La síntesis de péptidos puente disulfuro puede lograrse usando varios métodos. El método más conveniente para la formación de enlaces disulfuro dentro de un péptido es el llamado enfoque auto plegable oxidativo. Aquí, el precursor lineal del péptido cíclico deseado se sintetiza primero usando la síntesis de péptidos de fase sólida, que es después de la ruptura del soporte polimérico sometidos a oxidación en un sistema de buffer. Agentes redox activos como el glutation reducido y oxidado (GSH/GSSG) se agregan a menudo para promover la formación de los enlaces de disulfuro. La principal desventaja de buffer compatible auto plegable es que los enlaces de disulfuro se forman no selectivamente de manera gradual. Comparado con el péptido nativo, que a menudo isómero disulfuro específica solo se describe, es posible obtener numerosos otros isómeros con este enfoque8. Μ-PIIIA ya se ha demostrado para dar lugar a isómeros diferentemente doblados por lo menos tres a uno plegable en un anterior estudio3. La separación de una mezcla de isómero es algo difícil debido a los tiempos de retención similares si el uso de métodos de purificación cromatográfica9. La síntesis específica de un isómero específico, por tanto, es ventajosa. En concreto produce que un isómero con conectividad de disulfuro definido, una estrategia especial se requiere que el disulfuro de bonos sucesivamente están cerrados. Por lo tanto, el precursor lineal llevando grupos distintos de protección en los pares individuales de cisteína se sintetiza en el soporte de polímero. Después de la eliminación, los pares de cisteína individual y sucesivamente deprotected y vinculados en una reacción de oxidación para producir la deseada disulfuro bonos10,11,12,13, 14 , 15 , 16. después de la síntesis y la purificación del producto de la reacción, es necesaria para confirmar la identidad y la conectividad de disulfuro por métodos analíticos apropiados. Numerosos métodos analíticos están disponibles para la elucidación de la secuencia primaria de aminoácidos, por ejemplo., MS/MS, mientras que la determinación de la conectividad de disulfuro sigue siendo mucho menos investigada. Aparte de la complejidad de tales múltiples péptidos disulfuro-consolidado, impurezas relacionadas con el producto (ej., de disulfuro el revolver), debido a la muestra de preparación y el work-up pueden complicar más análisis. En este trabajo, nos muestran que el uso de una combinación de diferentes técnicas analíticas es necesario aclarar inequívocamente la identidad de los enlaces de disulfuro en los isómeros de μ-PIIIA. Hemos combinado métodos de cromatografía con espectrometría de masas y siempre las mismas muestras para espectroscopia de RMN. En desorption/ionization(MALDI) láser asistida por matriz de análisis MS/MS, identificamos el disulfuro mediante reducción parcial y derivatización de Yodoacetamida porque análisis de arriba hacia abajo no es posible que este péptido. Se realizaron experimentos de NMR 2D para obtener una estructura tridimensional de cada isómero. Así, combinando distintos métodos analíticos sofisticados, es posible dilucidar adecuadamente el disulfuro conectividad y estructura tridimensional del complejo de múltiples péptidos disulfuro-consolidado7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:979px;" width="979">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fmoc Rink amide resin</td>
			<td style="width:185px;">Novabiochem</td>
			<td style="width:191px;">855001</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Pyr(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">A-3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Arg(Pbf)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Asn(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Asp(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyp(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FAA1627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lys(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Ser(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gln(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Glu(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Trp(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Tyr(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">47623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Thr(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">His(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FDP1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">8510060</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">DMF</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">D119</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">DCM</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td>D37</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Piperidine</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td>A12442</td>
			<td>Flammable, Toxic, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">N-Methyl-Morpholin</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">224286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(Acm)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FAA1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">E-2495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">trifluoruacetic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">74564</td>
			<td>Toxic, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">phenol</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:191px;">1002060</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">thioanisol</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:191px;">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ethanedithiol</td>
			<td style="width:185px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:191px;">2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">diethyl ether</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:191px;">100,921</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">tert-butanol</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:191px;">L12338</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">A998</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">water</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">W5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">isopropanol</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:191px;">ACRO42383</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium hydroxide</td>
			<td style="width:185px;">AppliChem</td>
			<td style="width:191px;">A6579,1000</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">iodoacetamide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">iodine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">I0385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:191px;">110165</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ascorbic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">diphenylsulfoxide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">P35405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">anisol</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">96109</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">trichloromethylsilane</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">M85301</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sample dilution buffer</td>
			<td style="width:185px;">Laborservice Onken</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">106370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">disodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">795410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">citric acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium citrate dihydrate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tris-acetate</td>
			<td style="width:185px;">Carl Roth,&#160;</td>
			<td style="width:191px;">7125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">E26282&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">peptide calibration standard II</td>
			<td style="width:185px;">Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">8222570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;"></td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:185px;">Company</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">solid-phase peptide synthesizer</td>
			<td>Intavis Bioanalytical Instruments AG</td>
			<td style="width:191px;">EPS 221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:340px;">lyophilizer&#160;</td>
			<td>Martin Christ GmbH</td>
			<td style="width:191px;">&#160;Alpha 1-2 Ldplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">semipreparative HPLC</td>
			<td>Jasco</td>
			<td style="width:191px;">system PV-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Eurospher 100 C18 column (RP, 5 &#181;m particle size, 100 &#197; pore size, 250 x 32 mm)</td>
			<td style="width:185px;">Knauer</td>
			<td style="width:191px;">25QE181E2J</td>
			<td>purification of the linear peptide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:340px;">Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 &#181;m particle size, 300 &#197; pore size, 250 x 22 mm)</td>
			<td>Hichrom-VWR</td>
			<td style="width:191px;">HICH218TP1022</td>
			<td>purification of the oxidized peptide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:340px;">analytical HPLC&#160;</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td style="width:191px;">system LC-20AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 &#181;m particle size, 300 &#197; pore size, 250 x 4.6 mm)&#160;</td>
			<td>Hichrom-VWR</td>
			<td style="width:191px;">HICH218TP54</td>
			<td>analytical column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ground steel target (MTP 384)</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">NC0910436</td>
			<td>MALDI preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">C18-concentration filter (ZipTip)</td>
			<td style="width:185px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:191px;">ZTC18S096</td>
			<td>MALDI preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MALDI mass spectrometer</td>
			<td style="width:185px;">Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">ultraflex III TOF/TOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">amino acid analyzer</td>
			<td>Eppendorf-Biotronik GmbH</td>
			<td style="width:191px;">LC 3000 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">NMR spectrometer Bruker Avance III</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">Bruker Avance III 600 MHz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">computer program for molecular visualising</td>
			<td>YASARA Biosciences GmbH</td>
			<td style="width:191px;">Yasara structures</td>
			<td>NMR structure calculation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">computer program for MALDI data evaluation&#160;</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">flexAnalysis, BioTools</td>
			<td>MS/MS fragmentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">analog vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:191px;">VM 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:191px;">5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td style="width:191px;">EBA 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Rotational vacuum concentrator</td>
			<td style="width:185px;">Christ</td>
			<td style="width:191px;">2-18 Cdplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Analytical Balance</td>
			<td style="width:185px;">A&#38;D Instruments</td>
			<td style="width:191px;">GR-202-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and structure determination of &#181;-conotoxin piiia isomers with different disulfide connectivities

Péptidos con un elevado número de cisteínas son influenciados generalmente con respecto a la estructura tridimensional por su conectividad de disulfuro. Por lo tanto es muy importante para evitar la formación de Enlace disulfuro no deseados durante la síntesis de péptidos, porque puede dar lugar a una estructura completamente diferente de péptidos y en consecuencia alterado bioactividad. Sin embargo, la correcta formación de múltiples enlaces de disulfuro en un péptido es difícil de obtener mediante métodos auto plegables estándar tales como protocolos de la oxidación del tampón convencional, porque pueden formar varias conectividades de disulfuro. Este protocolo representa una avanzada estrategia necesaria para la síntesis específica de múltiples péptidos puente disulfuro que no pueden ser sintetizados vía oxidación de búfer en alta calidad y cantidad. El estudio demuestra la aplicación de una estrategia de grupo protección distinta para la síntesis de todos los isómeros posibles péptidos 3-disulfuro-consolidado de μ-Conotoxina PIIIA una manera específica. Los péptidos son preparados por síntesis de péptidos de fase sólida basado en el Fmoc utilizando una estrategia de protección del grupo para la formación del Enlace disulfuro definida. Los respectivos pares de cisteínas están protegidos con trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) y terc-butilo (tBu) proteger grupos para asegurarse de que durante cada paso de oxidación sólo las cisteínas requiere deprotected y vinculados. Además la síntesis específica, una combinación de varios métodos analíticos se usa para aclarar el plegamiento correcto y la generación de las estructuras de péptido deseado. La comparación de los diferentes isómeros 3-disulfuro-consolidado indica la importancia de la determinación precisa y el conocimiento de la conectividad de disulfuro para el cálculo de la estructura tridimensional y para la interpretación de lo biológico actividad de los isómeros del péptido. La caracterización analítica incluye la aclaración de Enlace disulfuro exacta vía análisis de espectrometría de masas (MS/MS) de tándem que se realiza con derivados alkylated y parcialmente reducidos del isómero intactas péptido producido por un protocolo adaptado. Además, las estructuras de péptidos se determinan mediante experimentos 2D de resonancia magnética nuclear (RMN) y el conocimiento obtenidos del análisis MS/MS.

15 diferentes isómeros puente disulfuro de la μ-Conotoxina PIIIA sintetizados y caracterizados en detalle (figura 1). Enlaces de disulfuro son identificados por reducción parcial y posterior análisis de MS/MS (figura 2). Análisis de NMR de los isómeros diferentes se lleva a cabo (figura 3) para revelar las estructuras de los péptidos. En particular, una combinación de RP HPLC, fragmentación ...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Structure Determination of Ã‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities at JoVE.com

Synthesis and Structure Determination of ÃƒÆ’Ã¢â‚¬Å¡Ãƒâ€šÃ‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Péptidos ricos en cisteína doblan en estructuras tridimensionales distintas dependiendo de la conectividad de disulfuro. Específicas síntesis de isómeros individuales disulfuro es necesario oxidación de búfer no conduce a la conectividad deseada disulfuro. El protocolo aborda la síntesis selectiva de péptidos 3-disulfuro-consolidado y su análisis estructural mediante estudios NMR y MS/MS.

Síntesis y determinación estructural de μ-Conotoxina PIIIA isómeros con disulfuro diferentes conectividades

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la síntesis de péptidos, como sintetizar péptidos ricos en disulfuro y determinar su patrón de puente de disulfuro correspondiente. La principal ventaja de esta técnica es que permite la síntesis selectiva de diferentes isómeros de péptidos de unión de disulfuro y su posterior caracterización química y estructural. Generalmente los individuos nuevos en este método lucharán porque cada péptido rico disulfuro se comporta de manera diferente.La síntesis y el análisis pueden tener que ser parcialmente optimizados para péptidos o proteínas individuales. Transfiera los reactivos enumerados en el protocolo de texto a los recipientes correspondientes y colóquelos en las raquetas apropiadas del sintetizador de péptidos de fase sólida. A continuación, añadir 100 miligramos de resina seca a las columnas de reacción y ponerlos en la raqueta del sintetizador.Inicie la síntesis de péptidos de fase sólida como se detalla en el protocolo de texto. Una vez completada la síntesis, la resina se liofilizó durante la noche. Ahora separar el péptido de la resina y realizar una protección profunda de las cadenas laterales.Para ello, combine la resina seca en un tubo de 12 mililitros y enfríe a cero grados Centígrados sobre hielo. Primero, agregue 150 microlitros de una mezcla de carroñeros, luego agregue un mililitro de 95%ácido trifluoroacético por 100 miligramos de resina. Deje la mezcla agitando suavemente durante tres horas a temperatura ambiente.Ahora, filtre la mezcla a través de una frita de vidrio. Recoger el filtrado en tubos, lleno individualmente con éter de dietil frío en hielo a un mililitro de mezcla de escote por ocho a 10 mililitros de éter dietílico. El péptido se precipita como un sólido blanco.Después de enjuagar y centrifugar los tubos como se describe en el protocolo de texto, límpiate los péptidos. Para purificar el precursor lineal con cromatografía semicurtiva añadir aproximadamente 70 miligramos del péptido crudo a un tubo de 15 mililitros. A continuación, disolver el péptido crudo en 0,1%TFA y acetonitrilo uno a uno para el agua.Separe la mezcla de péptidos usando un gradiente de cero a 50%Eluent B durante 120 minutos a un caudal de 10 mililitros por minuto. Recopile las fracciones en tubos individuales a medida que aparecen y prepare las fracciones seleccionadas para la espectrometría de masas y el análisis HPLC como se describe en el protocolo de texto. Seque las fracciones y combine las fracciones de pares.Iniciar la formación selectiva de enlaces de disulfuro realizando la primera oxidación. Para ello, disolver 15 miligramos del péptido lineal liofilización en 105 mililitros de una mezcla de agua isopropanol. Dejar la mezcla revolviendo al aire en condiciones básicas durante 12 a 48 horas.El procedimiento de oxidación escalonada es muy crítico. Los controles de reacción se toman en las tres medidas de oxidación para asegurar la formación rica en disulfuro individual. La tercera oxidación es la más crucial porque el diulfuro puede ocurrir cuando se supera el tiempo de reacción óptimo.Ahora realiza la segunda oxidación. Disolver 15 miligramos del péptido liofilado en 105 mililitros de agua isopropanol, una mezcla de ácido clorhídrico molar. Añadir 158 microlitros de una solución de yodo molar 0.1 en metanol a la solución.Revuelva la reacción a temperatura ambiente hasta que se complete la oxidación. A continuación, detenga la reacción añadiendo 79 microlitros de un ácido ascórbico molar en el agua. Finalmente realizar la tercera oxidación.Disolver 15 miligramos del péptido liofilado en 5,5 mililitros de TFA que contengan una mezcla de carroñeros. Precipite el péptido en tubos que contengan éter dietílico frío a un mililitro de solución de reacción por ocho a diez mililitros de éter dietílico. Para realizar la purificación de péptidos a 15 miligramos del producto crudo liofilario a un tubo de 15 mililitros.Disolver el producto crudo en el volumen del bucle de muestra HPLC utilizando una mezcla de 0.1%TFA y uno a uno Acetonitrile al agua. Después de vórquel hasta la disolución completa, centrifugar la solución de un minuto a 3400 veces G.Extraiga la mezcla de 3,6 mililitros en una jeringa de 5 mililitros e inyecte la muestra sin burbujas de aire en el bucle de inyección. Inicie la inyección en el sistema HPLC.Purificar la mezcla de péptidos usando un gradiente de cero a 50%Eluent B durante 120 minutos a un caudal de 10 mililitros por minuto. Recoger las fracciones en tubos individuales a medida que aparecen. Una vez completada la ejecución, prepare las fracciones seleccionadas para el análisis de MS y HPLC como se describe en el texto.Seque todas las fracciones y guárdelas a menos 20 grados centígrados. Para realizar hpLC analítica, transfiera muestras de las fracciones de péptidos o controles de reacción a un vial de HPLC y disuelva en la mezcla de 0,1%TFA en una a una Acetonitrile al agua. Coloque el vial de HPLC en el muestreador automático de la fase inversa analítica HPLC para inyectar 250 microlitros de cada muestra.Utilice un sistema de elución de gradiente de 0.1%TFA en agua como Eluent A en 0.1%TFA en Acetonitrile como un Eluent B.Analizar el péptido usando un gradiente de 10%a 40%Eluent B durante 30 minutos a un caudal de 1.0 mililitro por minuto. Para realizar análisis de aminoácidos, transfiera 100 microgramos del péptido puro a un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros y disuelva el polvo en 200 microlitros de seis molares HCL. Después de transferir la solución a una ampolla de vidrio, cierre la ampolla calentando el cuello con una llama de quemador de bunsen.A continuación, coloque un tubo de vidrio sosteniendo la ampolla en un bloque de calentamiento durante 24 horas a 110 grados Celsius para la hidrólisis. Después de 24 horas, abra la ampolla y transfiera la solución a un tubo de micro centrífuga de dos mililitros. Centrifugar la solución durante seis horas a sesenta grados centígrados y 210 veces G en un concentrador de vacío rotacional.A continuación, disuelva el producto hidrolizado en 192 microlitros del tampón de dilución muestreado y transfiera la solución a un filtro micro centrífugo. Después de centrifugar la muestra durante un minuto a 2300 veces G, transfiera 100 microlitros del filtrado a un tubo de muestra de análisis de aminoácidos. Coloque el tubo en el analizador de aminoácidos e inicie el análisis.Durante este protocolo de reducción pasado, es crucial tomar varios controles de reacción para obtener dos o cuatro veces kappa mido especies metiladas que son indispensables para el posterior análisis de desulfuro a través de espectrometría de masas. Disolver primero 600 microgramos del péptido puro en 1,2 mililitros de tampón de citrato molar 0,05 que contiene TCEP. Incubar la mezcla a temperatura ambiente tomando varias muestras de control de reacción de 100 microlitrotros que van de cero a 30 minutos.Mezclar las muestras en un tubo de micro-centrífuga de 1,5 mililitros con 300 microlitros de tampón de alquilación para detener la reacción y realizar la metilación carbonil de los grupos de tiol libre. Detenga la reacción después de cinco minutos añadiendo 100 microlitros de 10%TFA y agua y almacene las muestras en hielo seco. Ahora realice HPLC en las muestras como se detalla en el protocolo de texto.Transfiera una pequeña cantidad de cada fracción recolectada a un tubo de microterrífuga de 1,5 mililitros para el análisis de MS/MS de las formas oxidadas. Disolver el péptido restante en 0,1%TFA en agua y añadir un volumen adecuado sobre una solución de TCEP de 100 milimolar para obtener una concentración final de TCEP de 10 milimolar. En este punto, alquilación selectiva de cisteína se puede comprobar a través de la secuenciación de péptidos.Con los dos péptidos en el medio, una determinación del patrón de puente de disulfuro es posible. El análisis de RMN de los diferentes isómeros se lleva a cabo para revelar las estructuras de péptidos individuales. Se muestran las 20 estructuras con las energías más bajas, así como la conectividad disulfuro de los diferentes isómeros.En particular, se requiere una combinación de fragmentación HPLC MS/MS de fase inversa y análisis de RMN para la identificación inequívoca de la conectividad de disulfuro. La comparación del valor de desviación cuadrada media de la raíz aclaró que un péptido rígido conduce principalmente a una estructura de RMN mejor resuelta. Este video debe darle un ejemplo de cómo sintetizar selectivamente péptidos con un patrón de unión de disulfuro deseado.También muestra la posibilidad de comprobar la conectividad correcta del disulfuro a través de la espectrometría de masas tierna y obtener una estructura tridimensional a través de la espectroscopia de RMN. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la síntesis de péptidos exploraran la importancia de los patrones de unión de disulfuro para la estructura tridimensional y, en consecuencia, la actividad de dichos isómeros péptidos. Siguiendo este procedimiento, otros métodos como la actividad ASAS se pueden realizar para obtener información sobre las relaciones de actividad de la estructura de diferentes isómeros del péptido en el objetivo biológico específico.Aunque este método puede proporcionar información sobre la síntesis y el análisis de las conotoxinas, también se puede aplicar a otros péptidos de puente de disulfuro y proteínas como los fenzens, toxinas animales ricas en disulfuro y otras moléculas múltiples que contienen cisteína.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Organic Chemistry

Chemistry

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Unit 1

Stereoisomerism

SCIENTISTS IN ACTION

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

La producción de disulfuro estabilizados complejos transmembrana de péptidos de Estudios Estructurales

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Investigación

Química

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

From Constructs to Crystals ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Towards Structure Determination of ÃƒÅ½Ã‚Â²-barrel Outer Membrane Proteins

A partir de construcciones de Cristales - Hacia la determinación de la estructura de la β-barril proteínas de membrana externas

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Síntesis y caracterización de supramoleculares Coloides

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

Difracción de polvo de rayos X en Ciencias de la Conservación: Hacia rutina de determinación de estructura cristalina de los productos de corrosión de objetos de arte del patrimonio

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Synthesis and Characterization of Fe-doped Aluminosilicate Nanotubes with Enhanced Electron Conductive Properties

Síntesis y caracterización de dopado con Fe aluminosilicato nanotubos con propiedades conductoras mejoradas Electron

The goal of the protocol is to synthesize Fe-doped aluminosilicate nanotubes of the imogolite type with the formula (OH)3Al2-xFexO3SiOH. Doping with Fe ...

Probing the Structure and Dynamics of Interfacial Water with Scanning Tunneling Microscopy and Spectroscopy

Sondear la estructura y dinámica del agua superficial con túnel microscopía de barrido y espectroscopia

Water/solid interfaces are ubiquitous and play a key role in many environmental, biophysical, and technological processes. Resolving the internal ...

Fabricating High-viscosity Droplets using Microfluidic Capillary Device with Phase-inversion Co-flow Structure

Fabricación de gotas de alta viscosidad usando dispositivos capilares microfluídicos con estructura de flujo de co inversión de fase

The generation of monodisperse droplets with high viscosity has always been a challenge in droplet microfluidics. Here, we demonstrate a phase-inversion ...

Synthesis of Graphene Nanofluids with Controllable Flake Size Distributions

Síntesis de nanofluidos de grafeno con distribuciones de tamaño de escamas controlables

A method for synthesizing graphene nanofluids with controllable flake size distributions is presented. Graphene nanoflakes can be obtained by the ...

Organic Structure-directing Agent-free Synthesis for *BEA-type Zeolite Membrane

Síntesis libre de agentes que dirige la estructura orgánica para la membrana de zeolita tipo BEA

Membrane separation has drawn attention as a novel-energy saving separation process. Zeolite membranes have great potential for hydrocarbon separation in ...