Name: synthesis and structure determination of &#181;-conotoxin piiia isomers with different disulfide connectivities
Uploaded: 2018-10-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Structure Determination of Ã‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities at JoVE.com

Vi vill tacka A. Resemann, F. J. Mayer och D. Suckau från Bruker Daltonics GmbH Bremen; D. Tietze, A. A. Tietze, V. Schmidts och C. Thiele från Darmstadt tekniska högskolan; O. Ohlenschläger från den FLI Jena, M. Engeser från universitetet i Bonn; K. Kramer, A. Harzen och H. Nakagami från Max Planck-institutet för avel växtforskning, Köln; Susanne Neupert från Institutet för zoologi, Köln; och till Biomolekylär magnetisk resonans spektroskopi på universitetet i Frankfurt för tekniskt stöd, utbildningsmoduler, och tillgång till instrument. Ekonomiskt stöd av universitetet i Bonn till D.I. är erkänt tacksamt.

Obs: Alla aminosyror som används häri var i L-konfigurationen. Förkortningarna av aminosyror och amino syra derivat användes enligt rekommendationerna från den nomenklatur kommittén av IUB och IUPAC-IUB gemensamma kommissionen på biokemisk nomenklatur.
1. fasta fasen peptidsyntesen (SPPS)
Obs: Utför syntesen med en fasta fasen peptid synthesizer. Utföra syntesen av linjära peptid prekursorer av allmänna sekvens ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH2 använde...

<ol>
	<li>Fosgerau, K., Hoffmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+therapeutics:+Current+status+and+future+directions.">Peptide therapeutics: Current status and future directions.</a> Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).</li><li>Gongora-Ben&#237;tez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+disulfide+bonds.+peptides+as+therapeutics.">Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).</li><li>Tietze, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+diverse+&#181;-conotoxin+PIIIA+isomers+block+sodium+channel+NaV1.4.">Structurally diverse &#181;-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).</li><li>Carstens, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Activity+Studies+of+Cysteine-Rich+&#945;-Conotoxins+that+Inhibit+High-Voltage-Activated+Calcium+Channels+via+GABABReceptor+Activation+Reveal+a+Minimal+Functional+Motif.">Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich &#945;-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).</li><li>Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bridges:+Bringing+together+frustrated+structure+in+a+bioactive+peptide.">Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide.</a> Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).</li><li>Nielsen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+&#181;-conotoxin+PIIIA,+a+preferential+inhibitor+of+persistent+tetrodotoxin-sensitive+sodium+channels.">Solution structure of &#181;-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).</li><li>Heimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+&#181;-Conotoxin+PIIIA+Isomers+Revisited:+Impact+of+Cysteine+Pairing+on+Disulfide-Bond+Assignment+and+Structure+Elucidation.">Conformational &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation.</a> Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).</li><li>Chang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+pathways+of+oxidative+folding+of+disulfide+proteins:+Underlying+causes+and+folding+models.">Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models.</a> Biochemistry. 50 (17), 3414-3431 (2011).</li><li>B&#246;hm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+structure+and+function+of+factor+XIIIa-inhibitor+tridegin.">Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).</li><li>Postma, T. M., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+Formation+Strategies+in+Peptide+Synthesis.">Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).</li><li>Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid-Protecting+Groups.">Amino Acid-Protecting Groups.</a> Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).</li><li>Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bond+formation+in+peptides.">Disulfide bond formation in peptides.</a> Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).</li><li>Kamber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Synthesis+of+Cystine+Peptides+by+Iodine+Oxidation+of+S-Trityl-cysteine+and+S-Acetamidomethyl-cysteine+Peptides.">The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides.</a> Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).</li><li>Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Modulators+of+Regulator+of+G-Protein+Signaling+(RGS)+Proteins.">Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins.</a> Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).</li><li>Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regioselective+formation+of+multiple+disulfide+bonds+with+the+aid+of+postsynthetic+S-tritylation.">Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation.</a> Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).</li><li>Peigneur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#948;-conotoxins+synthesized+using+an+acid-cleavable+solubility+tag+approach+reveal+key+structural+determinants+for+NaV+subtype+selectivity.">&#948;-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).</li><li>Heimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Room-Temperature+Aprotic+and+Protic+Ionic+Liquids+for+Oxidative+Folding+of+Cysteine-Rich+Peptides.">Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides.</a> ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).</li><li>Kates, S. A., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , (2000).</li><li>W&#252;thrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+studies+of+structure+and+function+of+biological+macromolecules+(Nobel+lecture).">NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture).</a> Angewandte Chemie - International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).</li></ol>

Den metod som beskrivs häri för syntesen av cystein-rika peptider som µ-PIIIA representerar en möjlighet att selektivt producera disulfid-bundna isomerer från den samma aminosyrasekvensen. Därför etablerade metoder såsom Fmoc-baserade fast fas peptid syntes18 och en definierad skydda koncernens strategi för regioselective bildandet av disulfide obligationer var används16. Den fasta fasen peptidsyntesen kan producera amino syra ordnar på en polymer support (kåda)...

Användning av bioaktiva peptider i farmaceutisk forskning och utveckling redovisas mycket, eftersom de representerar potent och mycket selektiv föreningar för specifika biologiska mål1. För deras bioaktivitet är tredimensionella struktur dock av stor betydelse för att kunna utföra struktur-aktivitetssamband relation studier2,3,4. Förutom den primära aminosyrasekvens som påverkar totala konformation, stabilisera disulfide obligationer avsevärt strukturen av cystein-rika peptider5. Flera disulfid-bridged peptider inkluderar conotoxins såsom µ-PIIIA från Conus purpurascens som innehåller sex cysteines i dess sekvens. Detta höga cystein innehåll kan teoretiskt bildandet av 15 disulfid isomerer. Den rätta disulfid connectivity är mycket viktigt för biologisk aktivitet6,7. Frågan är dock om det finns mer än en bioaktiva konformation av naturligt förekommande peptider och om så, vilken av dessa isomerer äger den högsta biologiska aktiviteten? När det gäller µ-conotoxins, de biologiska målen är spänningskänsliga natriumkanaler jonkanaler och µ-PIIIA i synnerhet är mest potenta för subtyper NaV1.2, NaV1.4 och NaV1,73.
Syntesen av disulfid-bridged peptider kan uppnås med olika metoder. Den mest praktiska metoden för bildandet av disulfide obligationer inom en peptid är den så kallade oxidativa själv fällbara metoden. Här, syntetiseras linjär föregångaren till den önskade cyklisk peptiden först använda fasta fasen peptid syntes, som är efter klyvning av Polymera stöd utsätts för oxidation i ett buffertsystem. Redox-aktiva ämnen såsom minskad och oxiderade glutation (GSH/GSSG) läggs ofta för att främja bildandet av disulfide obligationer. Den största nackdelen med buffert-stödda själv vikning är att de disulfide obligationerna inte bildas selektivt i en stegvis sätt. Jämfört med de infödda peptid, som ofta beskrivs endast en specifik disulfid isomer, är det möjligt att få många andra isomerer med denna metod8. µ-PIIIA har redan visat sig resultera i minst tre olika vikta isomerer vid själv vika i en tidigare studie3. Separation av sådan en isomer blandning är ganska svårt på grund av liknande retentionstiderna om använder kromatografisk rening metoder9. Riktade syntesen av en specifik isomeren är därför en fördel. Att specifikt producera en isomer med definierade disulfid anslutning, en särskild strategi krävs i som disulfide obligationer stängt successivt. Därför syntetiseras linjär föregångare bär distinkta skydda grupper på individuella cystein paren med polymer-stöd. Efter eliminering, cystein paren är individuellt och successivt deprotected och kopplade i ett oxidationsreaktionen ge önskad disulfide obligationer10,11,12,13, 14 , 15 , 16. efter syntesen och rening av reaktionsprodukten, det krävs att bekräfta identitet och disulfid anslutning av lämpliga analysmetoder. Det finns många analysmetoder för förtydligandet av den primära aminosyrasekvensen, t.ex., MS/MS, medan fastställandet av disulfid anslutning är fortfarande mycket mindre undersökta. Bortsett från komplexiteten i sådana flera disulfid-bundna peptider, produktrelaterade föroreningar (t.ex., från disulfid scrambling), på grund av prov förberedelse och arbete-up kan ytterligare komplicera analysen. I detta papper visar vi att användningen av en kombination av olika analysmetoder är nödvändigt att entydigt klargöra identiteten på de disulfide obligationerna i de µ-PIIIA isomererna. Vi har kombinerat kromatografiska metoder med masspektrometri och gett de samma proverna till NMR spektroskopi. Matrix-assisted laser desorption/ionization(MALDI) MS/MS-analys identifierade vi de disulfide obligationerna med partiell minskning och iodoacetamide derivatisering eftersom top-down-analys inte är möjligt för denna peptid. 2D NMR experiment utfördes för att erhålla en tredimensionell struktur för varje isomer. Således, genom att kombinera olika sofistikerade analysmetoder, det är möjligt att belysa ordentligt disulfid connectivity och tredimensionella strukturen på komplex flera disulfid-bundna peptider7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:979px;" width="979">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fmoc Rink amide resin</td>
			<td style="width:185px;">Novabiochem</td>
			<td style="width:191px;">855001</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Pyr(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">A-3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Arg(Pbf)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Asn(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Asp(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyp(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FAA1627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lys(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Ser(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gln(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Glu(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Trp(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Tyr(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">47623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Thr(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">His(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FDP1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">8510060</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">DMF</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">D119</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">DCM</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td>D37</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Piperidine</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td>A12442</td>
			<td>Flammable, Toxic, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">N-Methyl-Morpholin</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">224286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(Acm)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FAA1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">E-2495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">trifluoruacetic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">74564</td>
			<td>Toxic, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">phenol</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:191px;">1002060</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">thioanisol</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:191px;">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ethanedithiol</td>
			<td style="width:185px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:191px;">2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">diethyl ether</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:191px;">100,921</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">tert-butanol</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:191px;">L12338</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">A998</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">water</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">W5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">isopropanol</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:191px;">ACRO42383</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium hydroxide</td>
			<td style="width:185px;">AppliChem</td>
			<td style="width:191px;">A6579,1000</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">iodoacetamide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">iodine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">I0385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:191px;">110165</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ascorbic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">diphenylsulfoxide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">P35405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">anisol</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">96109</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">trichloromethylsilane</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">M85301</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sample dilution buffer</td>
			<td style="width:185px;">Laborservice Onken</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">106370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">disodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">795410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">citric acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium citrate dihydrate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tris-acetate</td>
			<td style="width:185px;">Carl Roth,&#160;</td>
			<td style="width:191px;">7125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">E26282&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">peptide calibration standard II</td>
			<td style="width:185px;">Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">8222570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;"></td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:185px;">Company</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">solid-phase peptide synthesizer</td>
			<td>Intavis Bioanalytical Instruments AG</td>
			<td style="width:191px;">EPS 221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:340px;">lyophilizer&#160;</td>
			<td>Martin Christ GmbH</td>
			<td style="width:191px;">&#160;Alpha 1-2 Ldplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">semipreparative HPLC</td>
			<td>Jasco</td>
			<td style="width:191px;">system PV-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Eurospher 100 C18 column (RP, 5 &#181;m particle size, 100 &#197; pore size, 250 x 32 mm)</td>
			<td style="width:185px;">Knauer</td>
			<td style="width:191px;">25QE181E2J</td>
			<td>purification of the linear peptide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:340px;">Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 &#181;m particle size, 300 &#197; pore size, 250 x 22 mm)</td>
			<td>Hichrom-VWR</td>
			<td style="width:191px;">HICH218TP1022</td>
			<td>purification of the oxidized peptide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:340px;">analytical HPLC&#160;</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td style="width:191px;">system LC-20AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 &#181;m particle size, 300 &#197; pore size, 250 x 4.6 mm)&#160;</td>
			<td>Hichrom-VWR</td>
			<td style="width:191px;">HICH218TP54</td>
			<td>analytical column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ground steel target (MTP 384)</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">NC0910436</td>
			<td>MALDI preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">C18-concentration filter (ZipTip)</td>
			<td style="width:185px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:191px;">ZTC18S096</td>
			<td>MALDI preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MALDI mass spectrometer</td>
			<td style="width:185px;">Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">ultraflex III TOF/TOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">amino acid analyzer</td>
			<td>Eppendorf-Biotronik GmbH</td>
			<td style="width:191px;">LC 3000 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">NMR spectrometer Bruker Avance III</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">Bruker Avance III 600 MHz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">computer program for molecular visualising</td>
			<td>YASARA Biosciences GmbH</td>
			<td style="width:191px;">Yasara structures</td>
			<td>NMR structure calculation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">computer program for MALDI data evaluation&#160;</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">flexAnalysis, BioTools</td>
			<td>MS/MS fragmentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">analog vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:191px;">VM 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:191px;">5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td style="width:191px;">EBA 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Rotational vacuum concentrator</td>
			<td style="width:185px;">Christ</td>
			<td style="width:191px;">2-18 Cdplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Analytical Balance</td>
			<td style="width:185px;">A&#38;D Instruments</td>
			<td style="width:191px;">GR-202-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and structure determination of &#181;-conotoxin piiia isomers with different disulfide connectivities

Peptider med ett stort antal cysteines påverkas vanligtvis angående tredimensionella strukturen av deras disulfid anslutning. Det är alltså mycket viktigt att undvika oönskad disulfide bond bildas under peptid syntes, eftersom det kan resultera i en helt annan peptid struktur, och följaktligen ändras bioaktivitet. Rätt bildandet av flera disulfide obligationer i en peptid är dock svårt att få med hjälp av egna fällbara standardmetoder som konventionella buffert oxidation protokoll, eftersom flera disulfid connectivities kan bildas. Detta protokoll representerar en avancerad strategi som krävs för riktade syntes av flera disulfid-bridged peptider som inte kan syntetiseras via buffert oxidation i hög kvalitet och kvantitet. Studien visar tillämpningen av en distinkt skydda koncernens strategi för syntesen av alla möjliga 3-disulfid-bundna peptid isomerer av µ-conotoxin PIIIA på ett målinriktat sätt. Peptiderna är beredda genom Fmoc-baserade fasta fasen peptid syntes med en skyddande koncernstrategi för definierade disulfide bond bildandet. Respektive parar av cysteines skyddas med trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) och tert-butyl (tBu) skydda grupper för att kontrollera att endast de nödvändiga cysteines under varje oxidation steg är deprotected och länkade. Utöver riktade syntesen används en kombination av flera analysmetoder att klargöra rätt vikning och generation av önskad peptid strukturerna. Jämförelse av de olika 3-disulfid-bundna isomererna indikerar vikten av noggrann bestämning och kunskap om disulfid anslutning för beräkningen av den tredimensionella strukturen och för tolkning av biologiskt aktivitet av de peptid isomererna. Analytiska karakterisering innehåller den exakta disulfide bond klarlägga via tandem masspektrometri (MS/MS) analys som utförs med delvis nedsatt och alkylerade derivat av intakt peptid isomeren produceras av ett anpassat protokoll. Dessutom bestäms strukturerna som peptiden med 2D kärnmagnetisk resonans (NMR) experiment och den kunskap som erhållits från MS/MS-analys.

15 olika disulfid-bridged isomerer av den µ-conotoxin PIIIA är syntetiserade och kännetecknas i detalj (figur 1). Disulfide obligationer identifieras genom partiell nedsättning och efterföljande MS/MS-analys (figur 2). NMR analys av de olika isomererna utförs (figur 3) för att avslöja de enskilda peptid strukturerna. Bland annat krävs en kombination av RP HPLC, MS/MS fragmentering och NMR an...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Structure Determination of Ã‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities at JoVE.com

Synthesis and Structure Determination of ÃƒÆ’Ã¢â‚¬Å¡Ãƒâ€šÃ‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Cystein-rika peptider vik distinkta tredimensionella strukturer beroende på deras disulfid anslutning. Riktade syntes av enskilda disulfid isomerer krävs när bufferten oxidation inte leder till önskad disulfid anslutning. Protokollet behandlar selektiv syntesen av 3-disulfid-bundna peptider och deras strukturella analys med hjälp av NMR- och MS/MS studier.

Syntes och strukturbestämning av µ-Conotoxin PIIIA isomerer med olika disulfid Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i peptid syntesfältet såsom syntetisera disulfid rika peptider och bestämma deras motsvarande disulfid bro mönster. Den största fördelen med denna teknik är att den möjliggör selektiv syntes av olika disulfid bondend peptid isomerer och deras efterföljande kemiska och strukturella karakterisering. Generellt individer nya till denna metod kommer att kämpa eftersom varje disulfid rika peptid beter sig annorlunda.Syntes och analys kan behöva delvis optimeras för enskilda peptid eller protein. Överför de reagenser som anges i textprotokollet till motsvarande kärl och placera dem i lämpliga racketar av den fasta fasen peptidsynthesizer. Lägg sedan till 100 milligram torr harts till reaktionskolumnerna och lägg dem i racketen på synthesizern.Starta den fasta faspeptidsyntesen som detaljerad i textprotokollet. Efter syntesen är klar, lyophilized hartset över natten. Nu klyver peptiden från hartset och utför djupt skydd av sidokedjorna.För att göra det kombinera den torkade hartset i en 12 milliliter rör och kyla den till noll grader Celsius på is. Först, tillsätt 150 mikroliter av en asätare blandning, tillsätt sedan en milliliter av 95%trifluoroättik syra per 100 milligram harts. Låt blandningen försiktigt skaka i tre timmar i rumstemperatur.Filtrera blandningen genom en glasfrit. Samla filtratet i rör, individuellt fyllda med iskallt 1500 meter av klyvningsblandning per åtta till 10 milliliter av diethyleter. Peptiden fälls ut som ett vitt fast ämne.Efter sköljning och centrifugering rören som beskrivs i textprotokollet, frystorka peptiderna. För att rena den linjära föregångaren med semi preparativ kromatografi lägga till cirka 70 milligram av rå peptid till en 15 milliliter rör. Lös sedan upp den råa peptiden i 0,1%TFA och en-till-en Acetonitril till vatten.Separera peptidblandningen med en gradient på noll till 50%Eluent B under 120 minuter vid en flödeshastighet på 10 milliliter per minut. Samla in bråken i enskilda rör när de visas och förbered utvalda bråk för Mass Spectrometry och HPLC-analys enligt beskrivningen i textprotokollet. Frystorka fraktionerna och kombinera peer-fraktionerna.Starta selektivt bildande av disulfidbindningar genom att utföra den första oxideringen. För att göra det, lös 15 milligram av frystorkad linjär peptid i 105 milliliter av en isopropanol vattenblandning. Låt blandningen röra om på luft under grundläggande förhållanden under 12 till 48 timmar.Den stegvisa oxidationen tillvägagångssättet är mycket kritiskt. Reaktionskontroller tas i alla tre oxidationsstegen för att säkerställa individuell disulfidrik bildning. Den tredje oxidationen är den mest avgörande eftersom disulfid scrambling kan uppstå när den optimala reaktionstiden överskrids.Nu utför den andra oxidation. Lös upp 15 milligram av den frystorkade peptiden i 105 milliliter av ett isopropanolvatten, en molar saltsyrablandning. Tillsätt 158 mikroliter av en 0,1 mololedlösning i metanol till lösningen.Rör om reaktionen i rumstemperatur tills oxidationen är avslutad. Stoppa sedan reaktionen genom att tillsätta 79 mikroliter av en molaskorbinsyra i vatten. Utför slutligen den tredje oxidationen.Lös upp 15 milligram av den frystorkade peptiden i 5,5 milliliter TFA som innehåller en asätareblandning. Fäll ut peptiden i rör som innehåller kallsytyleter vid en milliliter reaktionslösning per åtta till tio milliliter av diethyleter. Att utföra peptidrening vid 15 milligram av den frystorkade råprodukten till ett 15 milliliterrör.Lös råvaran i volymen av HPLC-provslingan med hjälp av en blandning av 0,1%TFA och en till en Acetonitril till vatten. Efter virvelning tills fullständig upplösning, centrifuger lösningen från en minut vid 3400 gånger G.Rita upp 3,6 milliliter blandningen i en 5 milliliter spruta och injicera provet utan några luftbubblor i injektionsslingan. Starta injektionen i HPLC-systemet.Rena peptidblandningen med hjälp av en gradient på noll till 50%Eluent B under 120 minuter vid en flödeshastighet på 10 milliliter per minut. Samla in bråken i enskilda rör när de visas. När körningen är klar, förbereda valda bråk för MS och HPLC analys som beskrivs i texten.Frystorka alla fraktioner och förvara dem på minus 20 grader Celsius. För att utföra analytisk HPLC överför du prover av peptidfraktionerna eller reaktionskontrollerna till en HPLC-injektionsflaska och löser upp den i blandningen av 0,1%TFA i en till en Acetonitril till vatten. Placera HPLC-injektionsflaskan i autoprovtagaren av den analytiska omvända fasen HPLC-set för att injicera 250 mikroliter av varje prov.Använd ett gradientejersystem på 0,1%TFA i vatten som Eluent A i 0,1%TFA i Acetonitril som eluent B.Analysera peptiden med hjälp av en gradient på 10%till 40%Eluent B över 30 minuter med en flödeshastighet på 1,0 milliliter per minut. För att utföra aminosyraanalys, överför 100 mikrogram av den rena peptiden till ett 1,5 milliliter mikro-centrifugrör och lös upp pulvret i 200 mikroliter av sex molar HCL. Efter överföring av lösningen till en glasambula, stäng ampule genom att värma halsen med en bunsen brännare flamma.Placera sedan ett glasrör som håller ampullen i ett värmeblock i 24 timmar vid 110 grader Celsius för hydrolys. Efter 24 timmar, öppna ampulen och överföra lösningen till ett två milliliter mikro-centrifugrör. Centrifugera lösningen i sex timmar vid sextio grader Celsius och 210 gånger G i en rotationsvakuumkoncentrator.Lös sedan upp den hydrolyserade produkten i 192 mikroliter av den provspädda spädningsbufferten och överför lösningen till ett mikrocentrifugalfilter. Efter centrifugering provet i en minut vid 2300 gånger G, överför 100 mikroliter av filtratet till ett provrör för aminosyraanalys. Placera röret i aminosyraanalysatorn och starta analysen.Under detta tidigare reduktionsprotokoll är det avgörande att ta flera reaktionskontroller för att få tag på två gånger eller fyra gånger kappa mido metylerade arter som är oumbärliga för efterföljande disulfidanalys via masspektrometri. Först lös 600 mikrogram av den rena peptiden i 1,2 milliliter av 0,05 molar citrat buffert som innehåller TCEP. Inkubera blandningen vid rumstemperatur med flera 100 mikroliter reaktionskontrollprover från noll till 30 minuter.Blanda proverna i ett 1,5 milliliter mikrocentrifugrör med 300 mikroliter alkylerbuffert för att stoppa reaktionen och utföra karbonylmetylering av de fria tiolergrupperna. Stoppa reaktionen efter fem minuter genom att tillsätta 100 mikroliter av 10%TFA och vatten och förvara proverna på torris. Nu utför HPLC på proverna som detaljerade i textprotokollet.Överför en liten mängd av varje uppsamlad fraktion till ett 1,5 milliliter mikrocentrifugrör för MS/MS-analys av de oxiderade formerna. Lös upp den återstående peptiden i 0,1%TFA i vatten och tillsätt en lämplig volym över en 100 millimolar TCEP-lösning för att få en slutlig TCEP-koncentration på 10 millimolar. Vid denna punkt, selektiv cystein alkylering kan kontrolleras via peptidsekvensering.Med de två peptiderna i mitten är en bestämning av disulfidbromönstret möjlig. NMR-analys av de olika isomerna utförs för att avslöja de enskilda peptidstrukturerna. De 20 strukturerna med de lägsta energierna samt de olika isomerernas disulfid-anslutning visas.Noterbart är att en kombination av omvänd fas HPLC MS/MS-fragmentering och NMR-analys krävs för entydig identifiering av disulfidanslutningen. Jämförelsen av roten medelvärdet kvadrat avvikelse värde klargjorde att en styv peptid mestadels leder till en bättre löst NMR struktur. Denna video bör ge dig ett exempel hur selektivt syntetisera peptider med en önskad disulfid bond mönster.Den visar också möjligheten att kontrollera korrekt disulfid-konnektivitet via anbudsmasspektrometri och att få en tredimensionell struktur via NMR-spektroskopi. Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom området peptidsyntes att utforska betydelsen av disulfid bond mönster för den tredimensionella strukturen och följaktligen aktiviteten hos sådana peptid isomerer. Efter detta förfarande, andra metoder som aktivitet ASAS kan utföras för att få insikt i struktur aktivitetssamband av olika peptid isomerer på det specifika biologiska målet.Även om denna metod kan ge insikt i syntes och analys av konotoxiner, kan den också tillämpas på andra disulfid bropeptider och proteiner som fenzens, disulfid-rika animaliska toxiner och andra flera cystein som innehåller molekyler.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Organic Chemistry

Chemistry

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Unit 1

Stereoisomerism

SCIENTISTS IN ACTION

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Produktion av disulfid-stabiliserade transmembran peptidkomplex för strukturstudier

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Struktur och samordning Fastställande av peptid-metallkomplex Använda 1D och 2D<sup&gt; 1</sup&gt; H-NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

From Constructs to Crystals ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Towards Structure Determination of ÃƒÅ½Ã‚Â²-barrel Outer Membrane Proteins

Från konstruktioner till kristaller - Mot strukturbestämning av β-fat yttermembranproteiner

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Syntes och karakterisering av Supramolekylära Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

X pulverröntgendiffraktionsmönster i Conservation Science: Mot Rutin Crystal strukturbestämning av korrosionsprodukter på Heritage konstföremål

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Synthesis and Characterization of Fe-doped Aluminosilicate Nanotubes with Enhanced Electron Conductive Properties

Syntes och karakterisering av Fe-dopad Aluminatsilikat Nanorör med förbättrad elektronledande egenskaper

The goal of the protocol is to synthesize Fe-doped aluminosilicate nanotubes of the imogolite type with the formula (OH)3Al2-xFexO3SiOH. Doping with Fe ...

Probing the Structure and Dynamics of Interfacial Water with Scanning Tunneling Microscopy and Spectroscopy

Sondera strukturen och dynamiken i gränsskiktspänning vatten med Scanning Tunneling mikroskopi och spektroskopi

Water/solid interfaces are ubiquitous and play a key role in many environmental, biophysical, and technological processes. Resolving the internal ...

Fabricating High-viscosity Droplets using Microfluidic Capillary Device with Phase-inversion Co-flow Structure

Fabricera High-viscosity droppar använder mikroflödessystem kapillär enhet med fas-inversion samtidig flöde struktur

The generation of monodisperse droplets with high viscosity has always been a challenge in droplet microfluidics. Here, we demonstrate a phase-inversion ...

Synthesis of Graphene Nanofluids with Controllable Flake Size Distributions

Syntes av Grafennanofluider med kontrollerbara Flingstorleks fördelningar

A method for synthesizing graphene nanofluids with controllable flake size distributions is presented. Graphene nanoflakes can be obtained by the ...

Organic Structure-directing Agent-free Synthesis for *BEA-type Zeolite Membrane

Organisk struktur-regi Agent-fri syntes för *BEA-typ Zeolitmembran

Membrane separation has drawn attention as a novel-energy saving separation process. Zeolite membranes have great potential for hydrocarbon separation in ...