Name: induction of endothelial differentiation in cardiac progenitor cells under low serum conditions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions at JoVE.com

De auteurs bedanken Vera Lorenz voor haar nuttige ondersteuning tijdens de experimenten en het personeel van de Stroom Cytometry faciliteit van het departement van biogeneeskunde (DBM), de Universiteit en de Universiteit ziekenhuis Bazel. Dit werk werd gesteund door het verblijf-on track program van de Universiteit van Bazel (tot Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster wordt ondersteund door een subsidie van de Zwitserse National Science Foundation (subsidie nummer 310030_156953).

Het gebruik van muizen voor cel isolatie doel was volgens de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren en met de Zwitserse wet op dier en werd goedgekeurd door de Zwitserse kantonnale autoriteiten.
Opmerking: De isolatie van Sca-1+/CD31- SP-CPC's vanuit het hart van de muis was in wezen gedaan als eerder beschreven34 met enkele wijzigingen. Zie Tabel van materialenvoor de materialen en de gebruikte reagentia. Voor al...

<ol>
	<li>Beltrami, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+support+myocardial+regeneration.">Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration.</a> Cell. 114 (6), 763-776 (2003).</li><li>Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+post-natal+heart+contains+a+myocardial+stem+cell+population.">The post-natal heart contains a myocardial stem cell population.</a> FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).</li><li>Sandstedt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+atrium+of+the+human+adult+heart+contains+a+population+of+side+population+cells.">Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells.</a> Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255 (2012).</li><li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+(SCIPIO):+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial.">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li><li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+(CADUCEUS):+a+prospective,+randomised+phase+1+trial.">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li><li>Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+fates+of+cardiovascular+progenitor+cells.">Origins and fates of cardiovascular progenitor cells.</a> Cell. 132 (4), 537-543 (2008).</li><li>Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocyte+progenitor+cells+differentiate+into+functional+mature+cardiomyocytes:+an+in+vitro+model+for+studying+human+cardiac+physiology+and+pathophysiology.">Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology.</a> Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).</li><li>Noseda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGFRalpha+demarcates+the+cardiogenic+clonogenic+Sca1++stem/progenitor+cell+in+adult+murine+myocardium.">PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium.</a> Nature Communications. 6, 6930 (2015).</li><li>Linke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+dog+heart+are+self-renewing,+clonogenic,+and+multipotent+and+regenerate+infarcted+myocardium,+improving+cardiac+function.">Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function.</a> Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).</li><li>El-Mounayri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+differentiation+of+functional+human+coronary-like+vascular+smooth+muscle+cells+from+embryonic+stem+cells.">Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).</li><li>Ellison, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+c-kit(pos)+cardiac+stem+cells+are+necessary+and+sufficient+for+functional+cardiac+regeneration+and+repair.">Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair.</a> Cell. 154 (4), 827-842 (2013).</li><li>Oh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cells+from+adult+myocardium:+homing,+differentiation,+and+fusion+after+infarction.">Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction.</a> Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).</li><li>Martin, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+expression+of+the+ATP-binding+cassette+transporter,+Abcg2,+identifies+cardiac+SP+cells+in+the+developing+and+adult+heart.">Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart.</a> Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).</li><li>Pfister, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD31-+but+Not+CD31++cardiac+side+population+cells+exhibit+functional+cardiomyogenic+differentiation.">CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation.</a> Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).</li><li>Pelekanos, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transcriptome+and+immunophenotype+analysis+of+renal+and+cardiac+MSC-like+populations+supports+strong+congruence+with+bone+marrow+MSC+despite+maintenance+of+distinct+identities.">Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities.</a> Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).</li><li>Laugwitz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+isl1++cardioblasts+enter+fully+differentiated+cardiomyocyte+lineages.">Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages.</a> Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).</li><li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ISL1+heart+progenitors+generate+diverse+multipotent+cardiovascular+cell+lineages.">Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages.</a> Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).</li><li>Smith, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+resident+endogenous+c-Kit++cardiac+stem+cells+from+the+adult+mouse+and+rat+heart.">Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).</li><li>Matsuura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+cardiac+Sca-1-positive+cells+differentiate+into+beating+cardiomyocytes.">Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).</li><li>Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+migration+of+Sca1+/CD31-+cardiac+side+population+cells+in+a+murine+myocardial+ischemic+model.">Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model.</a> International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).</li><li>Vicinanza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+robustly+myogenic:+c-kit+expression+is+necessary+but+not+sufficient+for+their+identification.">Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).</li><li>Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+c-kit+receptor,+stem+cell+factor,+and+mast+cells.+What+each+is+teaching+us+about+the+others.">The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others.</a> American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).</li><li>Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+c-kit+expression+in+human+endothelial+cells+by+inflammatory+stimuli.">Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli.</a> Blood. 90 (1), 148-155 (1997).</li><li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+c-kit+in+hemopoietic+progenitor+cells.">Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).</li><li>Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Sca-1+in+hematopoietic+stem/progenitor+cell+function.">Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function.</a> Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Pfister, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+ATP-binding+cassette+transporter+Abcg2+in+the+phenotype+and+function+of+cardiac+side+population+cells.">Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells.</a> Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).</li><li>Messina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem+cells+from+human+and+murine+heart.">Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart.</a> Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).</li><li>Davis, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+cardiosphere+method+to+culture+cardiac+progenitor+cells+from+myocardial+tissue.">Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue.</a> PLoS One. 4 (9), e7195 (2009).</li><li>Carr, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiosphere-derived+cells+improve+function+in+the+infarcted+rat+heart+for+at+least+16+weeks--an+MRI+study.">Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study.</a> PLoS One. 6 (10), e25669 (2011).</li><li>Martens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhesus+monkey+cardiosphere-derived+cells+for+myocardial+restoration.">Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration.</a> Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+roles+of+CD90+and+c-kit+to+the+regenerative+efficacy+of+cardiosphere-derived+cells+in+humans+and+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction.">Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260 (2014).</li><li>Mochizuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo-Like+Kinase+2+is+Dynamically+Regulated+to+Coordinate+Proliferation+and+Early+Lineage+Specification+Downstream+of+Yes-Associated+Protein+1+in+Cardiac+Progenitor+Cells.">Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).</li><li>Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+resident+cardiac+progenitor+cells+by+Hoechst+33342+staining.">Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining.</a> Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).</li><li>Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors,+matrices,+and+forces+combine+and+control+stem+cells.">Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells.</a> Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).</li><li>Plaisance, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+Lineage+Specification+in+Adult+Human+Cardiac+Precursor+Cells+Via+Modulation+of+Enhancer-Associated+Long+Noncoding+RNA+Expression.">Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression.</a> JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).</li></ol>

Voordelen van dit Protocol:
Dit protocol biedt een endothelial differentiatie techniek van het CPCs. We vonden dat een lage serumconcentratie en lage celdichtheid de efficiëntie van endothelial differentiatie, waarbij LN bleek te zijn een meer geschikte substraat dan FN onder deze omstandigheden zou kunnen verbeteren. We gebruikten twee verschillende soorten CPCs: rat CPCs, die werden gebruikt in een cel lijn-achtige wijze, en muis SP-CPC's, die werden geïsoleerd en uitgebreid. Met name het pro...

Recente studies ondersteunen het bestaan van resident cardiale voorlopercellen (CPC) in de2,van volwassen zoogdieren hart1,3, en CPC's zou een nuttige bron voor celtherapie na cardiale letsel4, 5. Bovendien uitgebreide CPCs kunnen voorzien in een vruchtbare model drug screening en het onderzoek naar de ziekte mechanismen als geïsoleerde patiënten met zeldzame aandoeningen, of aan respectieve ziekte modellen6,7.
CPC's geïsoleerd van de volwassen hart bezitten stam/progenitor cel kenmerken1,2,3,8 , zoals ze multipotente zijn, clonogenic, en hebben de capaciteit voor zelf-vernieuwing. Echter, er zijn veel verschillende (sub) bevolking van CPC's verschillende oppervlakte marker profielen, met inbegrip van, bijvoorbeeld, c-kit, Sca-1 en anderen, tentoonstellen of opgehaald door verschillende isolatie technieken (tabel 1). Diverse protocollen van de cultuur en de differentiatie zijn gevestigde1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Deze protocollen verschillen meestal met betrekking tot de groeifactor en serum inhoud, die zijn aangepast aan het doel van het kweken en die kan leiden tot verschillen in de resultaten en effecten, met inbegrip van differentiatie efficiëntie.
Marker gebaseerde isolatie technieken:
CPC's kunnen worden geïsoleerd op basis van een specifieke oppervlakte marker expressie1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Eerdere studies suggereren dat de c-kit en Sca-1 de beste markers zijn kunnen te isoleren van de resident CPCs1,11,14,19,20. Omdat geen van deze markers echt specifiek voor CPC is, worden combinaties van verschillende markeringen gewoonlijk toegepast. Bijvoorbeeld, terwijl het CPCs express lage niveaus van c-kit21, is c-kit ook uitgedrukt door andere celtypes, met inbegrip van mestcellen22, endotheliale cellen23en hematopoietische stamcellen/voorlopercellen cellen24. Een bijkomend probleem is het feit dat niet alle markeertekens worden uitgedrukt in alle soorten. Dit is het geval voor Sca-1, die in de muis maar niet in menselijke25 uitdrukt. Met behulp van protocollen die onafhankelijk van isolatie markeringen zijn kan dus voordelig met het oog op klinische proeven en studies met menselijke specimens.
Marker-onafhankelijke isolatie technieken:
Er zijn verschillende belangrijke technieken voor CPC-isolatie, die vooral onafhankelijk zijn van oppervlakte marker expressie, maar die kunnen worden verfijnd door de opeenvolgende selectie van specifieke marker-positieve subfractions zo nodig (Zie ook tabel 1). (1) de kant bevolking (SP) techniek was oorspronkelijk gekenmerkt in een primitieve bevolking van hematopoietische stamcellen, gebaseerd op de mogelijkheid om de DNA kleurstof Hoechst 3334226 efflux van ATP-binding cassette (ABC) vervoerders27. SP hartcellen zijn geïsoleerd door verschillende groepen en gerapporteerd om uit te drukken een scala aan markeringen met enkele kleine verschillen tussen rapporten2,8,13,14. (2) kolonie-vormende eenheid fibroblast cellen (CFU-Fs) zijn oorspronkelijk vastgesteld gebaseerd op een mesenchymale stromale cel (MSC)-als fenotype. Geïsoleerde MSCs worden gekweekt op gerechten voor het opwekken van de vorming van de kolonie. Dergelijke kolonie-vormende MSC-achtige CFU-Fs kunnen worden geïsoleerd uit het volwassen hart en zijn in staat om het verschil in cardiale lineages15. (3) Cardiosphere-afgeleide cellen (CDC) zijn afzonderlijke cellen afgeleid van clusters van cellen gegroeid van weefsel biopsieën of28,29,30,31explants. Het werd onlangs aangetoond dat meestal de CD105+/CD90-/c-kit- cel breuk vertoont cardiomyogenic en regeneratieve potentiële32.
Hier, voorzien wij een protocol met behulp van SP-CPC's geïsoleerd van muizen, voor de efficiënte inductie van endothelial overdrachtslijn op basis van een eerdere studie in het CPCs rat en muis SP-CPCs33. Het protocol bevat specifieke aanpassingen aan de cultuur en techniek van de uitbreiding met betrekking tot de celdichtheid, de serum-inhoud van het medium, en het substraat. Het kan worden toegepast op muis SP-CPC's niet alleen maar aan verschillende soorten-CPC's voor het doel voor het opwekken van de overstap van een lot van een sturen naar een CPC endotheel-begaan, zij het met het oog op de transplantatie van deze cellen of het gebruik ervan voor mechanistische in vitro studies.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Culture medium</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#12440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>#SH30071</td>
			<td>3.5% (0.1% for lineage induction)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td>#25030</td>
			<td>Final concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thrombin</td>
			<td>Diagontech AG, Switzerland</td>
			<td>#100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.05 % Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T75 Flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial differentiation&#160;&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ham&#39;s F-12K (Kaighn&#39;s) Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fibronectin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#F4759</td>
			<td>Dilute in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#F1635</td>
			<td>Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#93420</td>
			<td>0.1% in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#50062Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-von Willebrand Factor antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab6994</td>
			<td>1:100 in 10% goat serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#A11010</td>
			<td>1:500 in 10% goat serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#62247</td>
			<td>1:500 in ddH2O&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SlowFade Antifade Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#S2828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BX63 widefield microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube formation</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >#352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Matrigel Growth Factor Reduced</td>
			<td >Corning</td>
			<td >#354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX50 widefield microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet.</td>
			<td >in house hospital pharmacy</td>
			<td >#9077862</td>
			<td>Working solution: 200 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#14175</td>
			<td>Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS&#160; for quenching Collagenase B activity&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#331885</td>
			<td>Prepare DMEM + 10% FBS&#160; + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES 1 M</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#15630080</td>
			<td>Final concentration 25 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >#SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RBC LysisBuffer (10X)</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >#420301/100mL</td>
			<td>Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collagenase B</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#11088807001</td>
			<td>Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#B2261</td>
			<td>Prepare 1 mg/mL in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Verapamil-hydrochloride&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#V4629</td>
			<td>Final concentration 83.3 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#551262</td>
			<td>0.25 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#557405</td>
			<td>0.6 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-Aminoactinomycin D (7-ADD)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#A1310</td>
			<td>0.15 &#181;g/106cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC rat IgG2a k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#553932</td>
			<td>0.25 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC Rat IgG2a k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554688</td>
			<td>0.6 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Material</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles 27G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>#NN-2719R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles 18G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>#NN-1838S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Use Syringes 1 mL sterile</td>
			<td>CODAN</td>
			<td>#62.1640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transferpipette 3.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#86.1171.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Strainer 40 &#181;m blue</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>#352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Strainer 100 &#181;m yellow</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lumox Dish 50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#94.6077.305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture Dishes P100</td>
			<td>Corning</td>
			<td >#353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture Dishes P60</td>
			<td>Corning</td>
			<td >#353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Line</td>
			<td>Age</td>
			<td>Breeding</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6NRj / male</td>
			<td>12 weeks</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Product Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue No.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#12440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>#SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td>#25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thrombin</td>
			<td>Diagontech AG, Switzerland&#160;</td>
			<td>#100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Product Name</td>
			<td>Medium 18</td>
			<td>Medium 2</td>
			<td>Medium 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td>Culture</td>
			<td>Lineage induction</td>
			<td>Endothelial diff.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>35%</td>
			<td>35%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>65%</td>
			<td>65%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>1%</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>3.5%</td>
			<td>&#8804;0.1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>0.2 nM</td>
			<td>0.2 nM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>1.3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>6.5 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>13 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>0.65 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of endothelial differentiation in cardiac progenitor cells under low serum conditions

Cardiale voorlopercellen (CPC) wellicht therapeutisch potentieel voor cardiale herstel na blessure. In de volwassen zoogdieren hart, intrinsieke CPCs zijn uiterst schaars, maar uitgebreide CPCs zou nuttig voor celtherapie. Een voorwaarde voor het gebruik ervan is hun vermogen om te onderscheiden op een gecontroleerde manier in de diverse cardiale geslachten gedefinieerd en efficiënte protocollen gebruiken. Bovendien, bij in vitro expansie, CPC's die bij patiënten geïsoleerd zijn of preklinische ziekte modellen vruchtbare onderzoeksmiddelen voor het onderzoek naar de ziekte mechanismen kunnen bieden.
Huidige studies gebruiken verschillende markeringen ter identificatie van CPC. Echter zijn niet alle van hen uitgedrukt in mens, die beperkt de translationeel impact van sommige Preklinische studies. Differentiatie-protocollen die zijn van toepassing ongeacht de isolatie-techniek en marker-expressie zal voor de gestandaardiseerde uitbreiding en priming van CPC's voor cel therapie doel toestaan. Hier beschrijven we dat de priming van CPC's onder een lage foetale runderserum (FBS) concentratie laag cel dichtheid vergemakkelijkt de endothelial differentiatie van het CPCs. met behulp van twee verschillende subpopulaties van muis en rat CPCs, we laten zien dat laminin is een meer geschikt substraat dan fibronectine daartoe krachtens het volgende protocol: na het kweken voor 2-3 dagen in medium met inbegrip van de supplementen die multipotent handhaven en met 3,5% FBS, CPCs worden overgeënt op laminin op < 60% samenvloeiing en gekweekte in supplement-gratis medium met lage concentraties van FBS (0,1%) voor 20-24 uur voor differentiatie in endotheel differentiatie medium. Omdat het CPCs zijn een heterogene populatie, wellicht serum concentraties en incubatie tijden worden aangepast afhankelijk van de eigenschappen van de respectieve CPC subpopulatie. Gezien dit, de techniek kan worden toegepast op andere soorten CPCs ook en biedt een handige methode om te onderzoeken van het potentieel en de mechanismen van differentiatie en hoe ze worden beïnvloed door ziekte bij het gebruik van CPC's geïsoleerd van de respectieve ziekte modellen.

Muis SP-CPC-isolatie:
In deze studie gebruikten we muis CPCs geïsoleerd volgens de SP fenotype, overwegende dat de resultaten van rat CPCs zijn gewijzigd en toegevoegd van een vorig rapport met toestemming (Figuur 8)33.
Celproliferatie onder hoge en lage cel dichtheden en met verschillende Serum concentraties:
<p cla...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions at JoVE.com

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Dit protocol beschrijft een endothelial differentiatie techniek voor cardiale voorlopercellen. Het richt zich vooral op de invloed van serumconcentratie en cel-zaaien dichtheid op de endotheliale differentiatie mogelijkheden.

Inductie van Endothelial differentiatie in cardiale voorlopercellen onder lage Serum voorwaarden

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

Differentiatie van hartvererver cellen, of CPC's, bij versterking vereist een fase omschakeling van een prolifererende naar een geëngageerde fase, en dit protocol maakt gebruik van efficiënte endotheel afstamming in CPC's. Een groot voordeel van de techniek is dat deze van toepassing is op CPC's die geïsoleerd zijn op basis van verschillende technieken en van verschillende soorten. Dit protocol kan worden gebruikt om de therapeutische mogelijkheden van CPC's voor celtherapie te verbeteren.Het kan ook worden gebruikt om de mogelijkheden en mechanismen van differentiatie te onderzoeken en hoe deze worden beïnvloed door hartziekten. CPC's zijn een inhomogene populatie cellen die kunnen verschillen in vorm, grootte en potentie. Daarom moet het protocol worden aangepast aan de specifieke subpopulatie van gebruikte CPC's.Na het verdoven van de muis, veeg de borst met 70% ethanol. Snijd met een schaar de huid en de thoracale wand om de borstholte bloot te leggen. Gebruik tangen om het hart op te tillen, en gebruik vervolgens een schaar om het te snijden aan de basis.Breng het hart naar een P60 cultuur schotel met vijf milliliter koude PBS, en gebruik tangen om het hart te pompen en het bloed uit de holtes te werpen. Plaats het hart in een P60 schotel met vijf milliliter koude PBS en was het. Gebruik een kleine schaar om de atria te verwijderen, snijd het hart in twee stukken in de lengterichting en was ze in vijf milliliter ijskoude PBS.Met behulp van kleine schaar, snijd de hartstukken in kleinere secties. Voeg een druppel van een Hank's evenwichtige zoutoplossing met collagenase B op een concentratie van een milligram per milliliter, en gebruik een steriel scheermesje om de kleine stukjes hart grondig gehakt. Voeg vervolgens 2,5 milliliter van de collagenase B-oplossing toe aan de schotel.Plaats de schotel in een hoek van 30 graden in een couveuse op 37 graden Celsius. Laat de gehakte hartstukken maximaal 30 minuten uitbroeden terwijl u ze tijdens de incubatie herhaaldelijk door een Pasteur pipet passeert. Voeg eerst vijf milliliter koude HBSS toe, aangevuld met 2%FBS aan de gehakte en gehomogeniseerde hartstukken.Met behulp van een filter van 100 micrometer filtert u de hartstukken om onverteerd weefsel te verwijderen. Centrifuge op 470 keer G en bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en hang de pellet opnieuw op in vijf milliliter rode bloedcelbuffer.Broed op ijs gedurende vijf minuten met af en toe schudden. Voeg hierna 10 milliliter PBS toe en filter het monster door een filter van 40 micrometer om grotere cellen, waaronder restnocyten, uit te sluiten. Centrifuge op 470 keer G en bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten zonder de pauze.Dan, opnieuw schorsen van de cellen in DMEM aangevuld met 10%FBS, gericht op een definitieve celconcentratie van een miljoen cellen per milliliter. Verdeel de cellen in twee buizen voor het beitsen en sorteren, voeg 1,5 milliliter van de celoplossing toe aan één buis en 3,5 milliliter aan de tweede buis. Voeg Hoechst oplossing en incubeer op 37 graden Celsius gedurende 90 minuten met af en toe flippen om gelijke verdeling van de kleurstof te garanderen en stolling van de cellen te voorkomen.De zijbevolking verschijnt bij Hoechst lage lagere linkerhoek naast de belangrijkste bevolking. In de FACS plot kan worden geïdentificeerd op basis van de negatieve controle waarin verapamil vraagt de zijpopulatie te verdwijnen. Warm medium 1 tot 37 graden Celsius op en koel de centrifuge af tot vier graden Celsius.Centrifugeer de sorteerbuizen op 470 keer G en zes minuten bij vier graden Celsius. Stel de cellen vervolgens opnieuw op in middelbaar gebied. Breng de cellen over op een gas-permeabele P60 schotel met vier milliliter van medium een.Verander het medium om de drie dagen totdat de cellen een samenvloeiing tussen 70 en 80% Culture SP-CPC's hebben bereikt gedurende twee tot drie dagen in T75-kolven met behulp van acht milliliter medium in elke kolf. Spoel vervolgens voorzichtig het medium aan en spoel de kolf voorzichtig af met vijf milliliter warme HBSS. Behandel de cellen met vijf milliliter trypsine EDTA gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide.Voeg vervolgens vijf milliliter medium één toe om de trypsineactiviteit te stoppen en breng de celsuspensie over naar een buis van 15 milliliter. Centrifuge op 470 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens worden de cellen opnieuw onderbroken in medium één of medium twee.Plaat de cellen op P60 schotels, plating 250,000 SP-CPC's per schotel met drie milliliter medium met verschillende serumconcentraties. Na twee dagen van kweken, verzamel het medium van elk gerecht in een 15 milliliter buis om de dode cellen te verzamelen. Probeer de aanhangende cellen zoals eerder beschreven en verzamel de celsuspensie in de 15 milliliter buis die het verzamelde medium bevat.Centrifuge op 840 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, dan aspirate de supernatant en voeg een milliliter van een of medium een of medium twee voor cel tellen. Vlek de SP-CPC's met trypan blauw en tel de levensvatbare en dode cellen. Spoel eerst het medium aan uit de bereide cellen en spoel ze voorzichtig af met vijf milliliter warme HBSS.Behandel de cellen met vijf milliliter trypsine EDTA gedurende vijf minuten in de cel incubator. Voeg vervolgens vijf milliliter medium één toe om de trypsineactiviteit te stoppen. Breng de celsuspensie over op een buis van 15 milliliter en centrifuge op 470 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Aspirate de supernatant en voeg medium twee voor cel tellen. Vervolgens zaad 80,000 cellen in elke put van een pre-gecoate zes-put cultuur plaat met drie milliliter van medium twee. Houd de plaat op 37 graden Celsius gedurende 20 tot 24 uur, en verander het medium in elke put tot drie milliliter van medium drie.Kweek de plaat voor 21 dagen, het veranderen van het medium om de drie dagen. Vlek hierna de cellen met een endotheelmarkering en voer fluorescentiemicroscopie uit om de endotheelaard van de gedifferentieerde cellen te verifiëren. Spoel eerst het medium uit de voorbereide cellen aan en spoel ze voorzichtig af met vijf milliliter warme HBSS.Behandel de cellen met twee milliliter trypsine EDTA gedurende vijf minuten in de cel incubator, voeg vervolgens drie milliliter van medium drie om de trypsine activiteit te stoppen. Breng de celsuspensie over op een buis van 15 milliliter en centrifuge op 470 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Aspirate de supernatant en voeg een milliliter van medium drie, pipetting zachtjes te mengen.Tel de cellen en het zaad tussen 2.000 en 4.000 cellen in 100 microliter van medium drie tot elke matrix gecoat goed van een 96-put plaat. Broed de plaat 16 uur lang op 37 graden Celsius. Gebruik hierna twee keer een helderveldmicroscoop om een foto van de cellen te maken.In deze studie worden geschikte voorwaarden onderzocht voor het vergemakkelijken van endotheellijnengagement van hartvererverensysatorcellen. Wanneer de celvloeiing op of onder 60% is, wordt geen significant verschil gezien in de met 3,5% FBS behandelde monsters. Wanneer cellen op deze samenvloeiing worden behandeld met 0,1%FBS, vertonen ze een afname van celproliferatie op laminine in vergelijking met fibronectine, maar tonen geen toename van celdood.Cellen met een hoge samenloop vertonen daarentegen geen significant verschil in celproliferatie of celdood tussen de twee aandoeningen. Veranderingen in de celvorm lijken een indicator te zijn van geschikte kweekomstandigheden waarin endotheeldifferentiatie succesvol zal zijn. Binnen zeven tot 14 dagen in het endotheliale differentiatiemedium, worden de succesvolle culturen gezien om grotere cellen met verschillende morfologie te bevatten.Interessant is dat deze cellen verdwenen tegen het einde van de differentiatiefase en de neiging hadden om in lagere aantallen en op latere punten in culturen met een hoge dichtheid te verschijnen. Buisvorming is consequent succesvol in cellen verguld met een lage dichtheid en gedifferentieerd op laminine, terwijl het wordt gezien om meestal te mislukken in cellen verguld met een hoge dichtheid. Terwijl buisvorming meestal niet succesvol is in cellen gekweekt op fibronectine, ongeacht de celdichtheid, vormen die gedifferentieerd bij een lage dichtheid soms rudimentaire buizen.De serumconcentratie en celdichtheid om endotheliale afstamming te veroorzaken zijn cruciaal en moeten worden aangepast om vertraging van proliferatie te garanderen met behoud van de levensvatbaarheid. Bij inductie van afstamming kunnen CPC's van mensen of preklinische ziektemodellen worden gebruikt voor celtransplantatiestudies om hun in vivo differentiatiepotentieel te beoordelen. Dit protocol zou kunnen helpen bij het bestuderen of vestigen van nieuwe cardiale regeneratie tools, en het werd eerder gebruikt om moleculaire mechanisme van vroege afstamming inzet te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Afleiding van Cardiac stamcellen uit embryonale stamcellen

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Direct Inductie van Human neurale stamcellen uit perifeer bloed hematopoïetische voorlopercellen

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Neurale differentiatie van muis embryonale stamcellen in serum-vrije monolaagkweek

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Initiëren Differentiatie in Onsterfelijk Multipotent Otic Progenitor Cellen

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetische regulatie van Cardiac Differentiatie van embryonale stamcellen en weefsels

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Chondrogene differentiatie Inductie van vetcellen afgeleide stamcellen door Centrifugaal Zwaartekracht

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

In vitro generatie van muis Hartveld-specifieke hart voorlopercellen

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Pan-myeloïde differentiatie van menselijk snoer bloed afgeleid CD34+ hematopoietische stam en voorlopercellen

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine ...

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

Efficiënte differentiatie van postganglionic Sympathische neuronen met behulp van menselijke pluripotente stamcellen onder Feeder-vrije en chemisch gedefinieerde cultuurvoorwaarden

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...