Name: induction of endothelial differentiation in cardiac progenitor cells under low serum conditions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions at JoVE.com

Les auteurs remercient Vera Lorenz pour son soutien utile pendant les expériences et le personnel de l’installation de cytométrie en flux du département de biomédecine (DBM), l’université et hôpital de l’Université Bâle. Ce travail a été soutenu par le séjour-sur piste programme de l’Université de Bâle (Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster est soutenu par une subvention de la Swiss National Science Foundation (subvention numéro 310030_156953).

L’utilisation de souris aux fins de l’isolement cellulaire a été conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et avec la loi de Protection animale Suisse et a été approuvée par les autorités cantonales suisses.
Remarque : L’isolement de Sca-1+/CD31– SP-CPC du coeur de souris se faisait essentiellement comme décrit précédemment34 avec quelques modifications. Pour le matériel et les réactifs ut...

<ol>
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What each is teaching us about the others.</a> American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).</li><li>Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+c-kit+expression+in+human+endothelial+cells+by+inflammatory+stimuli.">Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli.</a> Blood. 90 (1), 148-155 (1997).</li><li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+c-kit+in+hemopoietic+progenitor+cells.">Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).</li><li>Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. 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Avantages du présent protocole :
Ce protocole prévoit une technique de différenciation endothéliale des SCD. Nous avons constaté qu’une concentration sérique et la densité cellulaire faible pourraient améliorer l’efficacité de la différenciation endothéliale, auquel cas LN s’est avéré pour être un substrat plus adapté que le FN dans ces conditions. Nous avons utilisé deux types distincts de CPCs : rat CPC, qui ont été utilisés dans une manière ligne cellulaire et souri...

Des études récentes soutiennent l’existence de progéniteurs cardiaques résidents (CPCs) dans le cœur des mammifères adultes1,2,3, et CPC pourraient constituer une source utile pour la thérapie cellulaire après lésion cardiaque4, 5. en outre, CPCs élargis peuvent fournir un modèle fructueux pour le dépistage des drogues et l’étude des mécanismes de la maladie quand isolées de patients atteints de cardiomyopathie rare, ou contre les maladies modèles6,7.
SCD isolé du cœur adultes possède des souches/progénitrices cellule caractéristiques1,2,3,8 car ils sont multipotentes, clonogéniques, et ont la capacité d’auto-renouvellement. Cependant, il y a beaucoup de populations différentes (void) des SCD présentant des profils de différents marqueurs de surface, y compris, par exemple, c-kit, Sca-1 et autres, ou récupérée par les techniques d’isolation différents (tableau 1). Plusieurs protocoles de culture et de la différenciation ont été établies1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Ces protocoles varient principalement en ce qui concerne le facteur de croissance et de la teneur en sérum, qui sont ajustés selon le dessein de la culture et qui peut conduire à des différences dans les résultats, y compris l’efficacité de la différenciation.
Techniques d’isolement basé sur le marqueur :
Les CPC peuvent être isolés basé sur un marqueur de surface spécifique expression1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Des études antérieures suggèrent que le c-kit et Sca-1 peuvent être les meilleurs marqueurs pour isoler les résidents SCD1,11,14,19,20. Car aucun de ces marqueurs est vraiment spécifique pour les CPC, combinaisons de différents marqueurs sont généralement appliqués. Par exemple, tandis que la SCD expriment des niveaux faibles de c-kit21, c-kit s’exprime également par d’autres types de cellules, y compris les mastocytes22, cellules endothéliales23et de cellules souches/progénitrices hématopoïétiques24. Un autre problème est le fait que pas tous les marqueurs sont exprimés dans l’ensemble de toutes les espèces. C’est le cas pour Sca-1, qui se déclare chez la souris mais pas chez les humains25. Par conséquent, en utilisant les protocoles qui sont indépendants des marqueurs de l’isolement peut être avantageuse au vu des essais cliniques et études à l’aide d’échantillons humains.
Techniques d’isolement indépendant du marqueur :
Il y a plusieurs techniques majeurs d’isolement de la CPC, qui dépendent principalement de l’expression du marqueur de surface, mais qui peut être affinée par la sélection consécutive des sous-fractions de marqueurs positifs spécifiques si nécessaire (voir également tableau 1). (1) la technique de population (SP) de côté a initialement été caractérisée chez une population primitive de cellules souches hématopoïétiques, basé sur la capacité d’efflux de la teinture d’ADN Hoechst 3334226 par ATP-binding cassette (ABC) transporteurs27. Les cellules cardiaques de SP ont été isolés par différents groupes et signalés d’exprimer une variété de marqueurs avec quelques différences mineures entre les rapports2,8,13,14. (2) cellules de fibroblaste unité formant colonie (UFC-Fs) ont été définis initialement basé sur une cellule stromale mésenchymateuse (CSM)-comme le phénotype. MSCs isolés sont cultivées sur la vaisselle pour induire la formation de colonies. Tel formatrices MSC-comme UFC-Fs peut être isolé du cœur adult et sont capables de se différencier en lignées cardiaque15. (3) Cardiosphere-dérivés des cellules (CDC) sont de simples cellules provenant d’amas de cellules issues de biopsies tissulaires ou explants28,29,30,31. Il a été démontré récemment que pour la plupart la CD105+/CD90 fraction de cellules /c-kit– –pièces cardiomyogénique et potentiel régénératif32.
Ici, à l’aide de SP-CPCs isolés de souris, nous fournissons un protocole pour l’induction efficace de lignée endothéliale basée sur une étude antérieure au SCD de rat et souris SP-SCD33. Le protocole contient des adaptations spécifiques à la culture et technique de l’expansion en ce qui concerne la densité de la cellule, le contenu du sérum du milieu et le substrat. Il peut être appliqué non seulement aux souris SP-SCD, mais aux différents types de CPC dans le but d’induire un commutateur sort d’une amplification à un CPC endothéliales-commis, que ce soit en vue de la transplantation de ces cellules ou leur utilisation pour des études mécanistiques in vitro .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Culture medium</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#12440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>#SH30071</td>
			<td>3.5% (0.1% for lineage induction)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td>#25030</td>
			<td>Final concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thrombin</td>
			<td>Diagontech AG, Switzerland</td>
			<td>#100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.05 % Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T75 Flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial differentiation&#160;&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ham&#39;s F-12K (Kaighn&#39;s) Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fibronectin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#F4759</td>
			<td>Dilute in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#F1635</td>
			<td>Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#93420</td>
			<td>0.1% in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#50062Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-von Willebrand Factor antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab6994</td>
			<td>1:100 in 10% goat serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#A11010</td>
			<td>1:500 in 10% goat serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#62247</td>
			<td>1:500 in ddH2O&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SlowFade Antifade Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#S2828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BX63 widefield microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube formation</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >#352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Matrigel Growth Factor Reduced</td>
			<td >Corning</td>
			<td >#354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX50 widefield microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet.</td>
			<td >in house hospital pharmacy</td>
			<td >#9077862</td>
			<td>Working solution: 200 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#14175</td>
			<td>Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS&#160; for quenching Collagenase B activity&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#331885</td>
			<td>Prepare DMEM + 10% FBS&#160; + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES 1 M</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#15630080</td>
			<td>Final concentration 25 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >#SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RBC LysisBuffer (10X)</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >#420301/100mL</td>
			<td>Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collagenase B</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#11088807001</td>
			<td>Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#B2261</td>
			<td>Prepare 1 mg/mL in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Verapamil-hydrochloride&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#V4629</td>
			<td>Final concentration 83.3 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#551262</td>
			<td>0.25 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#557405</td>
			<td>0.6 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-Aminoactinomycin D (7-ADD)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#A1310</td>
			<td>0.15 &#181;g/106cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC rat IgG2a k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#553932</td>
			<td>0.25 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC Rat IgG2a k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554688</td>
			<td>0.6 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Material</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles 27G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>#NN-2719R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles 18G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>#NN-1838S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Use Syringes 1 mL sterile</td>
			<td>CODAN</td>
			<td>#62.1640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transferpipette 3.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#86.1171.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Strainer 40 &#181;m blue</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>#352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Strainer 100 &#181;m yellow</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lumox Dish 50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#94.6077.305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture Dishes P100</td>
			<td>Corning</td>
			<td >#353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture Dishes P60</td>
			<td>Corning</td>
			<td >#353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Line</td>
			<td>Age</td>
			<td>Breeding</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6NRj / male</td>
			<td>12 weeks</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Product Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue No.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#12440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>#SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td>#25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thrombin</td>
			<td>Diagontech AG, Switzerland&#160;</td>
			<td>#100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Product Name</td>
			<td>Medium 18</td>
			<td>Medium 2</td>
			<td>Medium 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td>Culture</td>
			<td>Lineage induction</td>
			<td>Endothelial diff.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>35%</td>
			<td>35%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>65%</td>
			<td>65%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>1%</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>3.5%</td>
			<td>&#8804;0.1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>0.2 nM</td>
			<td>0.2 nM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>1.3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>6.5 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>13 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>0.65 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of endothelial differentiation in cardiac progenitor cells under low serum conditions

Progéniteurs cardiaques (CPCs) peuvent avoir un potentiel thérapeutique pour la régénération cardiaque après une blessure. Dans le cœur des mammifères adult, CPCs intrinsèques sont extrêmement rares, mais élargis CPC pourraient être utiles pour la thérapie cellulaire. Une condition préalable à leur utilisation est leur capacité à se différencier de manière contrôlée dans les diverses lignées cardiaques à l’aide de protocoles définis et efficaces. En outre, lors de l’expansion in vitro , CPCs isolement de patients ou modèles précliniques de maladies peuvent offrir des outils de recherche fructueux pour l’étude des mécanismes des maladies.
Les études en cours permet d’identifier les CPCs différents marqueurs. Cependant, tous ne sont exprimés chez les humains, qui limite l’impact translationnelle de certaines études précliniques. Protocoles de différenciation qui s’appliquent quelle que soit l’expression technique et marqueur d’isolation permettra l’expansion normalisée et l’amorçage des SCD fins de thérapie cellulaire. Nous décrivons ici que l’amorçage des SCD dans des conditions de densité faible et une concentration faible sérum fœtal (SVF) facilite la différenciation endothéliale de CPCs. à l’aide de deux différentes sous-populations de souris et rat CPCs, nous montrons que la laminine est un plus substrat approprié que la fibronectine, à cet effet sous le protocole suivant : après mise en culture pour 2 ou 3 jours en moyenne, y compris les suppléments qui maintenir multipotentialité et avec 3,5 % FBS, SCD sont ensemencées sur laminin à < 60 % confluence et cultivées dans milieu sans supplément avec de faibles concentrations de FBS (0,1 %) pendant 20 à 24 heures avant la différenciation dans le milieu de la différenciation endothéliale. CPCs étant une population hétérogène, les concentrations sériques et temps d’incubation devrez peut-être être ajustée en fonction des propriétés de la sous-population de CPC respectif. Compte tenu de cela, la technique peut être appliquée à d’autres types de CPCs ainsi et fournit une méthode utile pour étudier le potentiel et les mécanismes de différenciation et comment ils sont touchés par la maladie lors de l’utilisation de CPCs isolées de modèles de maladies respectives.

Isolement de souris de SP-CPC :
Dans cette étude, nous avons utilisé des souris CPCs isolés selon le phénotype de la SP, considérant que les résultats de rat CPC sont modifiés et ajoutés dans un rapport antérieur avec permission (Figure 8),33.
Prolifération cellulaire sous haute et basse densité et avec diffé...

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Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Ce protocole décrit une technique de différenciation endothéliale de cellules progénitrices cardiaque. Il se concentre particulièrement sur comment la concentration sérique et la densité cellulaire-ensemencement affectent le potentiel de différenciation endothéliale.

Induction de la différenciation endothéliale dans les cellules progénitrices cardiaque dans des Conditions de faible taux sérique

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

La différenciation des cellules progénitrices cardiaques, ou CPC, lors de l’amplification nécessite un passage de phase d’un stade proliférant à un stade engagé, et ce protocole utilise une lignée endothéliale efficace dans les CPC. Un avantage majeur de la technique est qu’elle s’applique aux CPC isolés sur la base de plusieurs techniques et de différentes espèces. Ce protocole peut être utilisé pour améliorer les potentiels thérapeutiques des CPC pour la thérapie cellulaire.Il peut également être utilisé pour étudier les potentiels et les mécanismes de différenciation et comment ceux-ci sont affectés par les maladies cardiaques. Les CPC sont une population inhomogène de cellules dont la forme, la taille et la puissance peuvent différer. Par conséquent, le protocole doit être ajusté en fonction de la sous-population spécifique des CPC utilisés.Après anesthésier la souris, essuyez sa poitrine avec 70% d’éthanol. À l’aide de ciseaux, couper la peau et la paroi thoracique pour exposer la cavité thoracique. Utilisez des forceps pour soulever le cœur, puis utilisez des ciseaux pour le couper à la base.Transférer le cœur dans un plat de culture P60 contenant cinq millilitres de PBS froid, puis utiliser des forceps pour pomper le cœur et éjecter le sang des cavités. Placez le cœur dans un plat P60 contenant cinq millilitres de PBS froid et lavez-le. Utilisez de petits ciseaux pour enlever les airs, couper le cœur en deux morceaux longitudinals et les laver en cinq millilitres de PBS glacé.À l’aide de petits ciseaux, couper les morceaux de cœur en plus petites sections. Ajouter une goutte de solution de sel équilibrée d’un Hank contenant de la collagène B à une concentration d’un milligramme par millilitre, et utiliser une lame de rasoir stérile pour hacher les petits morceaux de cœur à fond. Ensuite, ajouter 2,5 millilitres de la solution collagène B au plat.Placez le plat à un angle de 30 degrés dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Laissez les morceaux de cœur hachés couver pendant un maximum de 30 minutes tout en les passant à plusieurs reprises à travers une pipette Pasteur toutes les 10 minutes pendant l’incubation. Tout d’abord, ajouter cinq millilitres de HBSS froid complété par 2%FBS aux morceaux de cœur hachés et homogénéisés.À l’aide d’un filtre de 100 micromètres, filtrer les morceaux du cœur pour enlever tout tissu non digéré. Centrifugeuse à 470 fois G et à température ambiante pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et suspendez la pastille en cinq millilitres de tampon de lyse de globule rouge.Incuber sur la glace pendant cinq minutes avec des secousses occasionnelles. Après cela, ajouter 10 millilitres de PBS et filtrer l’échantillon à travers un filtre de 40 micromètres pour exclure les cellules plus grandes, y compris les cardiomyocytes résiduels. Centrifugeuse à 470 fois G et à température ambiante pendant cinq minutes sans la pause.Puis, re-suspendre les cellules dans DMEM complété par 10%FBS, visant une concentration cellulaire finale d’un million de cellules par millilitre. Répartir les cellules en deux tubes pour la coloration et le tri, en ajoutant 1,5 millilitres de la solution cellulaire à un tube et 3,5 millilitres au deuxième tube. Ajouter la solution Hoechst et incuber à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes avec retournement occasionnel pour assurer une distribution égale du colorant et empêcher la coagulation des cellules.La population latérale apparaît au coin inférieur gauche de Hoechst de côté de la population principale. Dans la parcelle FACS, il peut être identifié en fonction du contrôle négatif dans lequel verapamil incite la population latérale à disparaître. Réchauffez-vous de 1 à 37 degrés Celsius et refroidissez la centrifugeuse à quatre degrés Celsius.Centrifugez les tubes de tri à 470 fois G et à quatre degrés Celsius pendant six minutes. Puis, re-suspendre les cellules en moyenne. Transférez les cellules dans un plat P60 perméable au gaz contenant quatre millilitres d’un plat moyen.Changez le milieu tous les trois jours jusqu’à ce que les cellules aient atteint une confluence entre 70 et 80%Culture SP-CPCs pendant deux à trois jours dans les flacons T75 à l’aide de huit millilitres de milieu un dans chaque flacon. Ensuite, aspirez soigneusement le milieu et rincez doucement le flacon avec cinq millilitres de HBSS chaud. Traiter les cellules avec cinq millilitres de trypsine EDTA pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.Ensuite, ajoutez cinq millilitres de milieu pour arrêter l’activité de la trypsine, et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Centrifugeuse à 470 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, suspendez à nouveau les cellules en deux moyennes ou moyennes.Plaquez les cellules sur des plats P60, placage 250.000 SP-CPCs par plat avec trois millilitres de milieu contenant différentes concentrations de sérum. Après deux jours de culture, recueillir le milieu de chaque plat dans un tube de 15 millilitres pour recueillir les cellules mortes. Essayez de trypsiniser les cellules adhérentes comme décrit précédemment et de recueillir la suspension cellulaire dans le tube de 15 millilitres qui contient le milieu recueilli.Centrifugeuse à 840 fois G pendant cinq minutes à température ambiante, puis aspirer le supernatant et ajouter un millilitre de moyen un ou moyen deux pour le comptage cellulaire. Tacher les SP-CPCs avec du bleu trypan et compter les cellules viables et mortes. Tout d’abord, aspirer le milieu à partir des cellules préparées, et les rincer doucement avec cinq millilitres de HBSS chaud.Traiter les cellules avec cinq millilitres de trypsine EDTA pendant cinq minutes dans l’incubateur cellulaire. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de moyenne pour arrêter l’activité de la trypsine. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et une centrifugeuse à 470 fois G pendant cinq minutes à température ambiante.Aspirer le supernatant et ajouter deux moyens pour le comptage cellulaire. Ensuite, grainez 80 000 cellules dans chaque puits d’une plaque de culture pré-enduite de six puits avec trois millilitres de deux moyens. Gardez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 20 à 24 heures, puis changez le milieu de chaque puits à trois millilitres de trois moyens.Culture de la plaque pendant 21 jours, en changeant le milieu tous les trois jours. Après cela, tacher les cellules avec un marqueur endothélial et effectuer la microscopie de fluorescence pour vérifier la nature endothéliale des cellules différenciées. Tout d’abord, aspirez le milieu des cellules préparées et rincez-les doucement avec cinq millilitres de HBSS chaud.Traiter les cellules avec deux millilitres de trypsine EDTA pendant cinq minutes dans l’incubateur cellulaire, puis ajouter trois millilitres de trois moyens pour arrêter l’activité de la trypsine. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et une centrifugeuse à 470 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Aspirer le supernatant et ajouter un millilitre de trois moyens, pipetting doucement pour mélanger.Comptez les cellules et les graines entre 2000 et 4000 cellules dans 100 microlitres de trois à chaque matrice enduite bien d’une plaque de 96 puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 16 heures. Après cela, utilisez un microscope à champ lumineux à deux reprises grossissement pour prendre une photo des cellules.Dans cette étude, des conditions appropriées sont explorées pour la facilitation de l’engagement endothélial de lignée des cellules progénitrices cardiaques. Lorsque la confluence cellulaire est à ou en dessous de 60%, aucune différence significative n’est observée dans les échantillons traités avec 3,5%FBS. Quand les cellules à cette confluence sont traitées avec 0.1%FBS, elles montrent une diminution de la prolifération cellulaire sur la laminine par rapport à la fibronectine, mais ne montrent aucune augmentation de la mort cellulaire.En revanche, les cellules à une confluence élevée ne montrent aucune différence significative dans la prolifération cellulaire ou la mort cellulaire entre les deux conditions. Les changements dans la forme des cellules semblent être un indicateur des conditions de culture appropriées dans lesquelles la différenciation endothéliale va être couronnée de succès. Dans les sept à 14 jours dans le milieu de différenciation endothéliale, les cultures réussies sont considérées comme contenant de plus grandes cellules avec la morphologie différente.Fait intéressant, ces cellules ont disparu vers la fin de la phase de différenciation et ont tendance à apparaître en nombre inférieur et à des moments ultérieurs dans les cultures à haute densité. La formation de tube est toujours réussie dans les cellules plaquées à la basse densité et différenciées sur la laminine, alors qu’elle est vue pour la plupart échouer dans les cellules plaquées à haute densité. Tandis que la formation de tube est la plupart du temps infructueuse dans les cellules cultivés sur la fibronectine indépendamment de la densité cellulaire, ceux différenciés à une basse densité forment parfois des tubes rudimentaires.La concentration de sérum et la densité cellulaire pour induire la lignée endothéliale sont cruciales, et elles doivent être ajustées pour garantir le ralentissement de la prolifération tout en maintenant la viabilité. Lors de l’induction de lignée, les CPC des humains ou les modèles de maladies précliniques peuvent être utilisés pour des études de transplantation cellulaire afin d’évaluer leur potentiel de différenciation in vivo. Ce protocole pourrait aider à étudier ou à établir de nouveaux outils de régénération cardiaque, et il a été précédemment utilisé pour étudier le mécanisme moléculaire de l’engagement précoce de lignée.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Dérivation des cellules cardiaques progénitrices de cellules souches embryonnaires

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Recherche

Biologie du développement

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Induction directe de neurales humaines cellules souches à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques du sang périphérique

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Différenciation neurale des souris de cellules souches embryonnaires dans le sérum sans culture monocouche

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Lancement de différenciation dans immortalisées cellules multipotentes progénitrices otique

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Régulation épigénétique de Cardiac Différenciation des cellules et tissus souches embryonnaires

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Chondrogène Différenciation Induction des cellules souches adipeuses par gravité centrifuge

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Isolement des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical humain

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

In Vitro Generation of Mouse Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells In Vitro Generation of Mouse Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells In Vitro Generation of Mouse Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells In Vitro

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