Name: induction of endothelial differentiation in cardiac progenitor cells under low serum conditions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions at JoVE.com

Die Autoren danken Vera Lorenz für ihre hilfreiche Unterstützung während der Experimente und das Personal von der Flow Cytometry Einrichtung der Abteilung Biomedizin (DBM), Universität und Universitätsspital Basel. Diese Arbeit wurde durch den Aufenthalt auf Track-Programm an der Universität Basel (um Michika Mochizuki) unterstützt. Gabriela M. Kuster wird unterstützt durch ein Stipendium des Schweizerischen Nationalfonds (Grant Nummer 310030_156953).

Die Verwendung von Mäusen zu Zelle Isolierung Zweck wurde gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und mit dem Schweizer Tier-Schutz-Gesetz und wurde von den Schweizer Kantonen genehmigt.
Hinweis: Die Isolation der Sca-1+/CD31– SP-CPCs aus dem Herzen der Maus erfolgte im Wesentlichen als zuvor beschriebenen34 mit einigen Änderungen. Die Materialien und Reagenzien verwendet finden Sie unter Tabelle der Materia...

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	<li>Beltrami, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+support+myocardial+regeneration.">Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration.</a> Cell. 114 (6), 763-776 (2003).</li><li>Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+c-kit(pos)+cardiac+stem+cells+are+necessary+and+sufficient+for+functional+cardiac+regeneration+and+repair.">Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair.</a> Cell. 154 (4), 827-842 (2013).</li><li>Oh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cells+from+adult+myocardium:+homing,+differentiation,+and+fusion+after+infarction.">Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction.</a> Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).</li><li>Martin, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+expression+of+the+ATP-binding+cassette+transporter,+Abcg2,+identifies+cardiac+SP+cells+in+the+developing+and+adult+heart.">Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart.</a> Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).</li><li>Pfister, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD31-+but+Not+CD31++cardiac+side+population+cells+exhibit+functional+cardiomyogenic+differentiation.">CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation.</a> Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).</li><li>Pelekanos, R. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+isl1++cardioblasts+enter+fully+differentiated+cardiomyocyte+lineages.">Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages.</a> Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).</li><li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ISL1+heart+progenitors+generate+diverse+multipotent+cardiovascular+cell+lineages.">Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages.</a> Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).</li><li>Smith, A. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors,+matrices,+and+forces+combine+and+control+stem+cells.">Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells.</a> Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).</li><li>Plaisance, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+Lineage+Specification+in+Adult+Human+Cardiac+Precursor+Cells+Via+Modulation+of+Enhancer-Associated+Long+Noncoding+RNA+Expression.">Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression.</a> JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).</li></ol>

Vorteile dieses Protokolls:
Dieses Protokoll bietet eine Technik der endothelialen Differenzierung des CPCs. Wir fanden, dass eine niedrige Serumkonzentration und geringer Zelldichte die Effizienz der endothelialen Differenzierung, wobei LN erwies sich als ein geeigneter Substrat als FN unter diesen Bedingungen verbessern könnte. Wir haben zwei verschiedene Arten von CPCs: Ratte CPCs, die in einer Zelle der Zeile-Manier und Maus SP-CPCs verwendet wurden, die isoliert und erweitert wurden. Vor al...

Neuere Studien unterstützen die Existenz von resident kardialen Vorläuferzellen (CPC) in den Erwachsenen Säugetier-Herz1,2,3könnte, und CPCs eine nützliche Quelle für die Zelltherapie nach kardialen Schädigung4, 5. Darüber hinaus erweiterte CPCs können eine fruchtbare Modell vorsehen, dass Drogen-Screening und die Untersuchung der Krankheitsmechanismen bei Patienten mit seltenen Kardiomyopathien, oder vom jeweiligen Krankheit isoliert Modelle6,7.
CPCs isoliert aus dem Erwachsenen Herzen besitzen Stamm/Stammvater Zelle Eigenschaften1,2,3,8 , sind multipotent, klonogenen, und haben die Fähigkeit zur Selbsterneuerung. Allerdings gibt es viele verschiedene (Teil-) Populationen des CPCs präsentiert verschiedene Oberfläche Marker Profile, einschließlich, zum Beispiel c-Kit, Sca-1 und andere, oder von unterschiedlichen Isolierungstechniken (Tabelle 1) abgerufen. Verschiedene Kultur und Differenzierung Protokolle wurden etablierte1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Diese Protokolle unterscheiden sich vor allem in Bezug auf den Wachstumsfaktor und Serum Inhalte, die nach dem Zweck der Kultivierung angepasst sind und zu unterschiedlichen Ergebnisse und Ergebnisse, einschließlich Differenzierung Effizienz führen kann.
Marker-basierte Isolationstechniken:
CPC-Gebote können isoliert werden, basierend auf einer bestimmten Oberfläche Marker Ausdruck1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Frühere Studien deuten darauf hin, dass c-Kit und Sca-1 der beste Marker resident CPCs1,11,14,19,20isoliert werden kann. Da keiner dieser Marker für CPC-Gebote wirklich spezifisch ist, sind Kombinationen von verschiedenen Markern in der Regel angewendet. Z. B. während CPCs niedrige Konzentrationen von c-Kit21auszudrücken, ist c-Kit auch andere Zelltypen, einschließlich Mastzellen22, Endothelzellen23und hämatopoetischen Stammzellen/Progenitor Zellen24zum Ausdruck. Ein weiteres Problem ist die Tatsache, dass nicht alle Markierungen auf allen Arten ausgedrückt werden. Dies ist der Fall für Sca-1, die Maus aber nicht in menschlichen25zum Ausdruck bringt. Daher kann die Protokolle verwendet, die unabhängig von der Isolierung Marker sind vorteilhaft im Hinblick auf klinische Studien und Untersuchungen mit humanen Proben sein.
Marker-unabhängige Isolierungstechniken:
Es gibt mehrere Haupttechniken der CPC-Isolation, die in erster Linie unabhängig von Surface Marker Ausdruck, aber das kann durch die aufeinander folgenden Auswahl der spezifischen Marker-positiven Unterfraktionen verfeinert werden, je nach Bedarf (siehe auch Tabelle 1). (1) die Seite Bevölkerung (SP) Technik wurde ursprünglich in einer primitiven Bevölkerung von hämatopoetischen Stammzellen, die auf der Fähigkeit basiert, Ausfluss der DNA-Farbstoff Hoechst 3334226 von ATP-bindende Kassette (ABC) Transporter27gekennzeichnet. Herzmuskelzellen SP wurden durch verschiedene Gruppen isoliert und berichtet, dass eine Vielzahl von Markern mit einigen kleinen Unterschieden zwischen Berichte2,8,13,14zum Ausdruck bringen. (2) koloniebildenden Einheit Fibroblastenzellen (KBE-Fs) ursprünglich definiert wurden basierend auf einer mesenchymaler Stromazellen Zelle (MSC)-wie Phänotyp. Isolierte MSCs sind auf Speisen induzieren Kolonie Bildung kultiviert. Koloniebildenden MSC-wie KBE-Fs kann von Erwachsenen Herzen getrennt werden und sind in der Lage, in kardialen Linien15zu unterscheiden. (3) Cardiosphere-abgeleitete Zellen (CDC) sind einzelne Zellen aus Gruppen von Zellen aus Gewebebiopsien gewachsen oder explants28,29,30,31. Es wurde kürzlich gezeigt, die meist die CD105+/CD90–/c-kit– Zelle Bruchteil Exponate, Cardiomyogenic und regenerative potenzielle32.
Hier bieten mit SP-CPCs von Mäusen isoliert, wir ein Protokoll zur effizienten Einarbeitung von endothelialen Linie basierend auf einer früheren Studie CPCs Ratte und Maus SP-CPCs33. Das Protokoll enthält spezifische Anpassungen an die Kultur und Ausbau Technik in Bezug auf die Zelldichte, der Serum-Inhalt des Mediums und dem Substrat. Es kann nicht nur auf Maus SP-CPCs angewendet werden, aber zu verschiedenen Arten von CPC-Gebote für den Zweck, einen Schicksal Wechsel von einer Verstärkung zu einer endothelialen begangen CPC zu induzieren, sei es im Hinblick auf die Transplantation dieser Zellen sowie deren Nutzung für mechanistische in-vitro- Studien.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Culture medium</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#12440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>#SH30071</td>
			<td>3.5% (0.1% for lineage induction)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td>#25030</td>
			<td>Final concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thrombin</td>
			<td>Diagontech AG, Switzerland</td>
			<td>#100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.05 % Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T75 Flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial differentiation&#160;&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ham&#39;s F-12K (Kaighn&#39;s) Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fibronectin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#F4759</td>
			<td>Dilute in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#F1635</td>
			<td>Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#93420</td>
			<td>0.1% in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#50062Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-von Willebrand Factor antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab6994</td>
			<td>1:100 in 10% goat serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#A11010</td>
			<td>1:500 in 10% goat serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#62247</td>
			<td>1:500 in ddH2O&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SlowFade Antifade Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#S2828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BX63 widefield microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube formation</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >#352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Matrigel Growth Factor Reduced</td>
			<td >Corning</td>
			<td >#354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX50 widefield microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet.</td>
			<td >in house hospital pharmacy</td>
			<td >#9077862</td>
			<td>Working solution: 200 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#14175</td>
			<td>Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS&#160; for quenching Collagenase B activity&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#331885</td>
			<td>Prepare DMEM + 10% FBS&#160; + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES 1 M</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#15630080</td>
			<td>Final concentration 25 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >#SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RBC LysisBuffer (10X)</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >#420301/100mL</td>
			<td>Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collagenase B</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#11088807001</td>
			<td>Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#B2261</td>
			<td>Prepare 1 mg/mL in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Verapamil-hydrochloride&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#V4629</td>
			<td>Final concentration 83.3 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#551262</td>
			<td>0.25 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#557405</td>
			<td>0.6 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-Aminoactinomycin D (7-ADD)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#A1310</td>
			<td>0.15 &#181;g/106cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC rat IgG2a k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#553932</td>
			<td>0.25 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC Rat IgG2a k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554688</td>
			<td>0.6 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Material</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles 27G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>#NN-2719R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles 18G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>#NN-1838S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Use Syringes 1 mL sterile</td>
			<td>CODAN</td>
			<td>#62.1640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transferpipette 3.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#86.1171.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Strainer 40 &#181;m blue</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>#352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Strainer 100 &#181;m yellow</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lumox Dish 50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#94.6077.305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture Dishes P100</td>
			<td>Corning</td>
			<td >#353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture Dishes P60</td>
			<td>Corning</td>
			<td >#353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Line</td>
			<td>Age</td>
			<td>Breeding</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6NRj / male</td>
			<td>12 weeks</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Product Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue No.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#12440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>#SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td>#25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thrombin</td>
			<td>Diagontech AG, Switzerland&#160;</td>
			<td>#100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Product Name</td>
			<td>Medium 18</td>
			<td>Medium 2</td>
			<td>Medium 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td>Culture</td>
			<td>Lineage induction</td>
			<td>Endothelial diff.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>35%</td>
			<td>35%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>65%</td>
			<td>65%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>1%</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>3.5%</td>
			<td>&#8804;0.1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>0.2 nM</td>
			<td>0.2 nM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>1.3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>6.5 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>13 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>0.65 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of endothelial differentiation in cardiac progenitor cells under low serum conditions

Kardialen Vorläuferzellen (CPCs) möglicherweise therapeutisches Potenzial zur kardialen Regeneration nach Verletzungen. Mitten in Erwachsenen Säugetier intrinsische CPCs sind extrem selten, aber erweiterte CPCs nützlich sein könnte für Zelltherapie. Voraussetzung für die Nutzung ist ihre Fähigkeit, in einer kontrollierten Weise in die verschiedenen kardialen Linien mit definierten und effiziente Protokolle zu differenzieren. Darüber hinaus auf in-vitro- Erweiterung CPCs von Patienten isoliert oder präklinischen Krankheitsmodelle können fruchtbare Recherche-Tools für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen anbieten.
Aktuelle Studien mit, dass verschiedene Marker CPCs bestimmt werden kann. Jedoch sind nicht alle von ihnen beim Menschen geäußert, beschränkt die translationale Auswirkungen einiger präklinischen Studien. Differenzierung-Protokolle, die unabhängig von der Isolation Technik und Marker Ausdruck gelten ermöglicht den standardisierten Ausbau und Grundieren der CPC-Gebote für Zelle Therapie Zweck. Hier beschreiben wir, dass die Grundierung des CPCs unter einer niedrigen fetalen bovine (FBS) Serumkonzentration und niedrigen Zelle Dichte Bedingungen erleichtert die endotheliale Differenzierung des CPCs. mit zwei verschiedenen Subpopulationen von Maus und Ratte CPCs, wir zeigen, dass Laminin a mehr geeignetes Substrat als Fibronektin zu diesem Zweck unter das folgende Protokoll: nach Kultivierung für 2-3 Tage in Medium einschließlich Ergänzungen, dass Multipotenz behaupten mit 3,5 % FBS, CPCs sind ausgesät und auf Laminin an < 60 % Zusammenfluss und kultiviert in Ergänzung-freies Medium mit niedrigen Konzentrationen des FBS (0,1 %) für 20-24 Stunden vor der Differenzierung in endothelialen Differenzierung Medium. Da CPCs eine heterogene Bevölkerung sind, Serumkonzentrationen und Inkubationszeiten möglicherweise je nach den Eigenschaften der jeweiligen CPC Subpopulation angepasst werden. Vor diesem Hintergrund kann auch auf andere Arten von CPCs sowie die Technik und bietet eine nützliche Methode, um das Potenzial und die Mechanismen der Differenzierung und wie sie von der Krankheit betroffen sind, bei CPCs isoliert vom jeweiligen Krankheitsmodelle zu untersuchen.

Maus SP-CPC Isolation:
In dieser Studie verwendeten wir Maus CPCs isoliert nach SP Phänotypus, während Ergebnisse von Ratte CPCs sind geändert und aus einem früheren Bericht mit Erlaubnis (Abbildung 8)33hinzugefügt.
Zellproliferation unter hohen und niedrigen Zelldichten und mit unterschiedlichen Serumkonzentrationen...

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Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik der endothelialen Differenzierung für kardiale Vorläuferzellen. Es konzentriert sich besonders auf wie Serum-Konzentration und Dichte Zelle Aussaat der endothelialen Differenzierung Potenzial auswirken.

Induktion der endothelialen Differenzierung in kardialen Vorläuferzellen unter niedrigen Serum-Bedingungen

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

Die Differenzierung von Kardialvorläuferzellen oder CPCs bei der Amplifikation erfordert einen Phasenwechsel von einer Vermehrung in ein festgeschriebenes Stadium, und dieses Protokoll verwendet eine effiziente endotheliale Abstammung in CPCs. Ein großer Vorteil der Technik besteht darin, dass sie auf CPCs anwendbar ist, die auf der Grundlage verschiedener Techniken und verschiedener Arten isoliert sind. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die therapeutischen Potenziale von CPCs für die Zelltherapie zu verbessern.Es kann auch verwendet werden, um die Potenziale und Mechanismen der Differenzierung zu untersuchen und wie diese von Herzerkrankungen betroffen sind. CPCs sind eine inhomogene Population von Zellen, die sich in Form, Größe und Potenz unterscheiden können. Daher muss das Protokoll entsprechend der spezifischen Teilpopulation der verwendeten CPCs angepasst werden.Nach der Anästhesisierung der Maus, wischen Sie seine Brust mit 70%Ethanol. Schneiden Sie mit einer Schere die Haut und die Brustwand, um die Brusthöhle freizulegen. Verwenden Sie Zangen, um das Herz zu heben, und verwenden Sie dann eine Schere, um es an der Basis zu schneiden.Übertragen Sie das Herz auf eine P60-Kulturschale mit fünf Millilitern kalter PBS, und verwenden Sie dann Zangen, um das Herz zu pumpen und das Blut aus den Hohlräumen auszustoßen. Legen Sie das Herz in eine P60-Schale mit fünf Millilitern kalten PBS und waschen Sie es. Verwenden Sie eine kleine Schere, um die Vorhöfe zu entfernen, schneiden Sie das Herz in zwei Längsstücke und waschen Sie sie in fünf Milliliter eiskalte PBS.Schneiden Sie die Herzteile mit einer kleinen Schere in kleinere Abschnitte. Fügen Sie einen Tropfen einer ausgewogenen Salzlösung von Hank, die Kollagennase B in einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter enthält, und verwenden Sie eine sterile Rasierklinge, um die kleinen Herzstücke gründlich zu zerkleinern. Als nächstes fügen Sie 2,5 Milliliter der Kollagenase B-Lösung in die Schale.Legen Sie das Gericht in einem 30-Grad-Winkel in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius. Lassen Sie die gehackten Herzstücke für maximal 30 Minuten brüten, während sie während der Inkubation alle 10 Minuten durch eine PasteurPipette passieren. Zuerst fügen Sie fünf Milliliter kalte HBSS, ergänzt mit 2%FBS, zu den gehackten und homogenisierten Herzstücken hinzu.Filtern Sie die Herzteile mit einem 100-Mikrometer-Filter, um unverdautes Gewebe zu entfernen. Zentrifuge bei 470 mal G und bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in fünf Millilitern roter Blutkörperchen-Lysepuffer wieder auf.Fünf Minuten auf Eis mit gelegentlichem Schütteln bebrüten. Danach fügen Sie 10 Milliliter PBS hinzu und filtern Sie die Probe durch einen 40-Mikrometer-Filter, um größere Zellen einschließlich Restkardiomyozyten auszuschließen. Zentrifuge bei 470 mal G und bei Raumtemperatur für fünf Minuten ohne Pause.Dann, Re-Suspend die Zellen in DMEM mit 10%FBS ergänzt, mit dem Ziel einer endgültigen Zellkonzentration von einer Million Zellen pro Milliliter. Verteilen Sie die Zellen in zwei Röhren für die Färbung und Sortierung, indem Sie 1,5 Milliliter der Zelllösung zu einem Rohr und 3,5 Milliliter zum zweiten Rohr hinzufügen. Fügen Sie Hoechst-Lösung hinzu und brüten Sie bei 37 Grad Celsius für 90 Minuten mit gelegentlichem Kippen, um eine gleichmäßige Verteilung des Farbstoffs zu gewährleisten und eine Gerinnung der Zellen zu verhindern.Die Seitenbevölkerung erscheint an der unteren linken Ecke von Hoechst neben der Hauptbevölkerung. Im FACS-Plot kann es anhand der negativen Kontrolle identifiziert werden, in der verapamil die Seitenpopulation zum Verschwinden auffordert. Erwärmen Sie mittlere ein bis 37 Grad Celsius und kühlen Sie die Zentrifuge auf vier Grad Celsius ab.Zentrifugieren Sie die Sortierrohre bei 470 mal G und bei vier Grad Celsius für sechs Minuten. Setzen Sie dann die Zellen in Medium 1 erneut aus. Übertragen Sie die Zellen auf eine gasdurchlässige P60-Schale, die vier Milliliter Medium eins enthält.Ändern Sie das Medium alle drei Tage, bis die Zellen einen Zusammenfluss zwischen 70 und 80% Kultur-SP-CPCs für zwei bis drei Tage in T75-Flaschen erreicht haben, wobei acht Milliliter Medium eins in jedem Kolben verwendet werden. Als nächstes das Medium vorsichtig ansaugen und den Kolben vorsichtig mit fünf Millilitern warmer HBSS abspülen. Behandeln Sie die Zellen mit fünf Milliliter Natschnass edTA fünf Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.Fügen Sie dann fünf Milliliter Medium eins hinzu, um die Trypsin-Aktivität zu stoppen, und übertragen Sie die Zellsuspension in eine 15-Milliliter-Röhre. Zentrifuge bei 470 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Als Nächstes setzen Sie die Zellen in mittleren zwei oder mittleren zwei wieder aus.Die Zellen auf P60-Schalen, beschichtungen 250, 000 SP-CPCs pro Schale mit drei Millilitern Medium mit unterschiedlichen Serumkonzentrationen. Nach zwei Tagen der Kultivierung, sammeln Sie das Medium aus jeder Schale in eine 15 Milliliter Tube, um die abgestorbenen Zellen zu sammeln. Trypsinize die anhaftenden Zellen wie zuvor beschrieben und sammeln Sie die Zellsuspension in die 15 Milliliter Tube, die das gesammelte Medium enthält.Zentrifuge bei 840 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur, dann den Überstand aspirieren und einen Milliliter entweder mittlere ein oder mittlere zwei für die Zellzählung hinzufügen. Stain die SP-CPCs mit Trypan blau und zählen Sie die lebensfähigen und abgestorbenen Zellen. Zuerst das Medium aus den vorbereiteten Zellen ansaugen und mit fünf Millilitern warmer HBSS sanft abspülen.Behandeln Sie die Zellen mit fünf Milliliter Trypsin EDTA für fünf Minuten im Zellinkubator. Fügen Sie dann fünf Milliliter Medium eins hinzu, um die Trypsin-Aktivität zu stoppen. Übertragen Sie die Zellsuspension bei raumhohen Temperaturen fünf Minuten lang in ein 15-Milliliter-Rohr und eine Zentrifuge bei 470-fachm G.Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie Medium zwei für die Zellzählung hinzu. Als nächstes säen Sie 80.000 Zellen in jeden Brunnen einer vorbeschichteten Sechs-Brunnen-Kulturplatte mit drei Millilitern mittlerer zwei. Halten Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 20 bis 24 Stunden, und ändern Sie dann das Medium in jedem Brunnen auf drei Milliliter medium drei.Kultur die Platte für 21 Tage, das Medium alle drei Tage wechseln. Danach färben Sie die Zellen mit einem endotheliale Marker und führen Sie Fluoreszenzmikroskopie durch, um die endotheliale Natur der differenzierten Zellen zu überprüfen. Zuerst das Medium aus den vorbereiteten Zellen ansaugen und mit fünf Millilitern warmer HBSS sanft abspülen.Behandeln Sie die Zellen mit zwei Milliliter Trypsin EDTA für fünf Minuten im Zellinkubator, dann fügen Sie drei Milliliter Medium drei hinzu, um die Trypsin-Aktivität zu stoppen. Übertragen Sie die Zellsuspension bei raumhohen Temperaturen fünf Minuten lang in ein 15-Milliliter-Rohr und eine Zentrifuge bei 470-fachm G. Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie einen Milliliter Medium drei, Pipettieren sanft zu mischen.Zählen Sie die Zellen und Samen zwischen 2 000 und 4 000 Zellen in 100 Mikrolitern des Mediums drei zu jeder Matrix, die gut mit einer 96-Well-Platte beschichtet ist. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 16 Stunden. Verwenden Sie anschließend ein Hellfeldmikroskop bei der zweifachen Vergrößerung, um ein Bild der Zellen zu machen.In dieser Studie werden geeignete Bedingungen für die Erleichterung der endotheliaalen Abstammung Engagement von Herzvorläuferzellen untersucht. Wenn die Zellkonfluency bei oder unter 60% liegt, ist kein signifikanter Unterschied in den proben gesehen, die mit 3,5%FBS behandelt wurden. Wenn Zellen in dieser Konfluenz mit 0,1%FBS behandelt werden, zeigen sie eine Abnahme der Zellproliferation auf Laminin im Vergleich zu Fibronectin, zeigen aber keine Zunahme des Zelltodes.Im Gegensatz dazu zeigen Zellen mit hoher Konfluenz keinen signifikanten Unterschied in der Zellproliferation oder dem Zelltod zwischen den beiden Bedingungen. Veränderungen in der Zellform scheinen ein Indikator für geeignete Kulturbedingungen zu sein, in denen die endotheliale Differenzierung erfolgreich sein wird. Innerhalb von sieben bis 14 Tagen im endotheliaalen Differenzierungsmedium werden erfolgreiche Kulturen gesehen, die größere Zellen mit unterschiedlicher Morphologie enthalten.Interessanterweise verschwanden diese Zellen gegen Ende der Differenzierungsphase und neigten dazu, in niedrigeren Zahlen und später in Kulturen mit hoher Dichte zu erscheinen. Die Rohrbildung ist durchweg erfolgreich in Zellen, die mit geringer Dichte plattiert und auf Laminin differenziert sind, während sie in Zellen, die mit hoher Dichte plattiert sind, meist versagen. Während die Rohrbildung in Zellen, die unabhängig von der Zelldichte auf Fibronectin kultiviert werden, meist erfolglos ist, bilden die bei geringer Dichte differenzierten manchmal rudimentäre Röhren.Die Serumkonzentration und die Zelldichte, um endotheliale Abstammung zu induzieren, sind von entscheidender Bedeutung, und sie müssen angepasst werden, um eine Verlangsamung der Proliferation bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit zu gewährleisten. Bei der Lineage-Induktion können CPCs von Menschen oder präklinische Krankheitsmodelle für Zelltransplantationsstudien verwendet werden, um ihr In-vivo-Differenzierungspotenzial zu bewerten. Dieses Protokoll könnte helfen, neue Herzregenerationswerkzeuge zu studieren oder zu etablieren, und es wurde zuvor verwendet, um molekulare Mechanismen der frühen Abstammung Sitte zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Ableitung von Herzvorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Serum-freiem Monolayer-Kultur

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Initiieren Differenzierung in Immortalisierte multipotenten Vorläuferzellen Otic

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetische Regulation der Herz Differenzierung von embryonalen Stammzellen und Gewebe

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Chondrogene Differenzierung Induktion von Fettgewebe gewonnene Stammzellen durch Zentrifugalkraft Gravity

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Isolierung der endothelialen Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurblut

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

In Vitro-Generierung von Mausherzfeldspezifischen Herzvorläuferzellen

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Panmyeloische Differenzierung von humanem Cordblood abgeleitet CD34+ hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine ...

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

Effiziente Differenzierung postganglionischer Sympathika-Neuronen mit humanen pluripotenten Stammzellen unter feederfreien und chemisch definierten Kulturbedingungen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...