Name: induction of endothelial differentiation in cardiac progenitor cells under low serum conditions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions at JoVE.com

המחברים תודה ורה לורנץ את תמיכתה מועיל במהלך הניסויים, והעובדים מהמתקן Flow Cytometry מן המחלקה וההתערבות (DBM), האוניברסיטה אוניברסיטת בית החולים באזל. עבודה זו נתמכה על ידי השהייה בעל המסלול לתוכנית של אוניברסיטת בזל (Michika מוצ'יזוקי). גבריאלה מ Kuster נתמך על ידי מענק של קרן המדע הלאומית השוויצרית (310030_156953 מספר גרנט).

השימוש של עכברים תא בידוד מטרה לפי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה ועם חוק ההגנה שוויצרי, אושרה על-ידי השלטונות הקנטונים שוויצרי.
הערה: את ניתוקה של Sca-1+/CD31– SP-CPCs מהלב עכבר נעשה בעיקרו של דבר כפי שתואר לעיל34 עם מספר שינויים. החומרים והשירותים ר...

<ol>
	<li>Beltrami, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+support+myocardial+regeneration.">Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration.</a> Cell. 114 (6), 763-776 (2003).</li><li>Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+post-natal+heart+contains+a+myocardial+stem+cell+population.">The post-natal heart contains a myocardial stem cell population.</a> FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).</li><li>Sandstedt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+atrium+of+the+human+adult+heart+contains+a+population+of+side+population+cells.">Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells.</a> Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255 (2012).</li><li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+(SCIPIO):+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial.">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li><li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+(CADUCEUS):+a+prospective,+randomised+phase+1+trial.">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li><li>Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+fates+of+cardiovascular+progenitor+cells.">Origins and fates of cardiovascular progenitor cells.</a> Cell. 132 (4), 537-543 (2008).</li><li>Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocyte+progenitor+cells+differentiate+into+functional+mature+cardiomyocytes:+an+in+vitro+model+for+studying+human+cardiac+physiology+and+pathophysiology.">Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology.</a> Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).</li><li>Noseda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGFRalpha+demarcates+the+cardiogenic+clonogenic+Sca1++stem/progenitor+cell+in+adult+murine+myocardium.">PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium.</a> Nature Communications. 6, 6930 (2015).</li><li>Linke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+dog+heart+are+self-renewing,+clonogenic,+and+multipotent+and+regenerate+infarcted+myocardium,+improving+cardiac+function.">Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function.</a> Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).</li><li>El-Mounayri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+differentiation+of+functional+human+coronary-like+vascular+smooth+muscle+cells+from+embryonic+stem+cells.">Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).</li><li>Ellison, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+c-kit(pos)+cardiac+stem+cells+are+necessary+and+sufficient+for+functional+cardiac+regeneration+and+repair.">Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair.</a> Cell. 154 (4), 827-842 (2013).</li><li>Oh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cells+from+adult+myocardium:+homing,+differentiation,+and+fusion+after+infarction.">Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction.</a> Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).</li><li>Martin, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+expression+of+the+ATP-binding+cassette+transporter,+Abcg2,+identifies+cardiac+SP+cells+in+the+developing+and+adult+heart.">Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart.</a> Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).</li><li>Pfister, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD31-+but+Not+CD31++cardiac+side+population+cells+exhibit+functional+cardiomyogenic+differentiation.">CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation.</a> Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).</li><li>Pelekanos, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transcriptome+and+immunophenotype+analysis+of+renal+and+cardiac+MSC-like+populations+supports+strong+congruence+with+bone+marrow+MSC+despite+maintenance+of+distinct+identities.">Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities.</a> Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).</li><li>Laugwitz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+isl1++cardioblasts+enter+fully+differentiated+cardiomyocyte+lineages.">Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages.</a> Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).</li><li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ISL1+heart+progenitors+generate+diverse+multipotent+cardiovascular+cell+lineages.">Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages.</a> Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).</li><li>Smith, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+resident+endogenous+c-Kit++cardiac+stem+cells+from+the+adult+mouse+and+rat+heart.">Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).</li><li>Matsuura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+cardiac+Sca-1-positive+cells+differentiate+into+beating+cardiomyocytes.">Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).</li><li>Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+migration+of+Sca1+/CD31-+cardiac+side+population+cells+in+a+murine+myocardial+ischemic+model.">Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model.</a> International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).</li><li>Vicinanza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+robustly+myogenic:+c-kit+expression+is+necessary+but+not+sufficient+for+their+identification.">Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).</li><li>Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+c-kit+receptor,+stem+cell+factor,+and+mast+cells.+What+each+is+teaching+us+about+the+others.">The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others.</a> American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).</li><li>Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+c-kit+expression+in+human+endothelial+cells+by+inflammatory+stimuli.">Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli.</a> Blood. 90 (1), 148-155 (1997).</li><li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+c-kit+in+hemopoietic+progenitor+cells.">Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).</li><li>Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Sca-1+in+hematopoietic+stem/progenitor+cell+function.">Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function.</a> Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Pfister, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+ATP-binding+cassette+transporter+Abcg2+in+the+phenotype+and+function+of+cardiac+side+population+cells.">Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells.</a> Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).</li><li>Messina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem+cells+from+human+and+murine+heart.">Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart.</a> Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).</li><li>Davis, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+cardiosphere+method+to+culture+cardiac+progenitor+cells+from+myocardial+tissue.">Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue.</a> PLoS One. 4 (9), e7195 (2009).</li><li>Carr, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiosphere-derived+cells+improve+function+in+the+infarcted+rat+heart+for+at+least+16+weeks--an+MRI+study.">Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study.</a> PLoS One. 6 (10), e25669 (2011).</li><li>Martens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhesus+monkey+cardiosphere-derived+cells+for+myocardial+restoration.">Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration.</a> Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+roles+of+CD90+and+c-kit+to+the+regenerative+efficacy+of+cardiosphere-derived+cells+in+humans+and+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction.">Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260 (2014).</li><li>Mochizuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo-Like+Kinase+2+is+Dynamically+Regulated+to+Coordinate+Proliferation+and+Early+Lineage+Specification+Downstream+of+Yes-Associated+Protein+1+in+Cardiac+Progenitor+Cells.">Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).</li><li>Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+resident+cardiac+progenitor+cells+by+Hoechst+33342+staining.">Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining.</a> Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).</li><li>Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors,+matrices,+and+forces+combine+and+control+stem+cells.">Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells.</a> Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).</li><li>Plaisance, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+Lineage+Specification+in+Adult+Human+Cardiac+Precursor+Cells+Via+Modulation+of+Enhancer-Associated+Long+Noncoding+RNA+Expression.">Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression.</a> JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).</li></ol>

היתרונות של פרוטוקול זה:
פרוטוקול זה מספק טכניקה בידול אנדותל של CPCs. מצאנו כי ריכוז בסרום נמוכה בעלת צפיפות נמוכה תא יכול לשפר את היעילות של בידול אנדותל, לפיה LN נוכחו להיות מצע מתאים יותר מאשר FN בתנאים אלה. . היינו שני סוגים שונים של CPCs: עכברוש CPCs, אשר היו בשימוש של התא, כמו קו בא...

מחקרים שנעשו לאחרונה לתמוך את קיומו של תושב ובתאים הלב (CPCs) של הלב יונקים בוגרים1,2,3, CPCs יכול להיות מקור שימושי עבור טיפול בתאי לאחר פציעה לב4, 5. בנוסף, CPCs המורחב עשוי לספק מודל פורה והתרופות הקרנה, החקירה של מנגנוני המחלה כאשר מבודדים מחולים עם cardiomyopathies נדירים, או ממחלת בהתאמה מודלים6,7.
CPCs מבודד בלב למבוגרים בעלי גזע/קדמון תא מאפיינים1,2,3,8 כפי שהם multipotent, clonogenic, יש יכולת התחדשות עצמית. עם זאת, ישנן אוכלוסיות שונות (sub) רבים של CPCs מפגין סמן משטח שונה פרופילים, כולל, למשל, c-kit, Sca-1 ואחרים, או שאוחזרו באמצעות טכניקות שונות בידוד (טבלה 1). מספר פרוטוקולים תרבות ובידול כבר הוקמה1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. פרוטוקולים אלה משתנים בעיקר ביחס גורם גדילה והתוכן סרום, אשר מותאמים בהתאם לצורך culturing, אשר יכול להוביל הבדלי תוצאות ותוצאות, לרבות יעילות בידול.
טכניקות בידוד המבוסס על סמן:
CPCs ניתן לבודד המבוסס על סמן משטח מסוים ביטוי1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. מחקרים קודמים מצביעים כי c-kit, Sca-1 ייתכן הסמנים הכי טוב כדי לבודד תושב CPCs1,11,14,19,20. כי אף אחד סמנים אלה הוא באמת ספציפי CPCs, שילובים של סמנים שונים בדרך כלל מוחלים. לדוגמה, בעוד CPCs אקספרס רמות נמוכות של c-kit21, c-kit מתבטאת גם על ידי סוגי תאים אחרים, כולל תאי פיטום22, תאי אנדותל23של תאי גזע hematopoietic/קדמון24. בעיה נוספת היא העובדה כי לא כל הסמנים מבוטאים על-פני כל המינים. זהו המקרה Sca-1, אשר מבטא את העכבר אך לא אנושי25. לכן, באמצעות פרוטוקולים שאינן תלויות סמני בידוד עשוי להיות יתרון על רקע ניסויים קליניים ומחקרים באמצעות דגימות אנושי.
סמן תלויית בידוד טכניקות:
ישנן מספר טכניקות העיקריים של עלות לקליק בידוד, אשר אינם תלויים בראש ובראשונה ביטוי סמן משטח, אך אשר יכול להיות מעודן על-ידי בחירת ברציפות subfractions סמן-חיובית מסוימת. כנדרש (ראה גם לוח 1). (1) הטכניקה האוכלוסייה (SP) צד במקור מלווה בקרב אוכלוסיה פרימיטיבית של תאי גזע hematopoietic מבוסס על היכולת בזרימת לצבוע דנ א Hoechst 3334226 ב- ATP-איגוד קלטת (ABC) מובילי27. תאי SP לב מבודדת על ידי קבוצות שונות ודיווח לבטא מגוון של סמנים עם כמה הבדלים משניים בין דוחות2,8,13,14. (2) יחידה המושבה יוצרי תאי פיברובלסט (CFU-Fs) במקור הוגדרו בהתבסס על תא סטרומה mesenchymal (MSC)-כמו פנוטיפ. MSCs מבודד מתורבתים על מנות לזירוז הקמת המושבה. כגון המושבה יוצרי MSC דמוי CFU-Fs ניתן לבודד מהלב למבוגרים, והם מסוגלים להתמיין שושלות לב15. (3) Cardiosphere נגזר תאים (CDC) הם תאים בודדים נגזר אשכולות של התאים גדלו של ביופסיות רקמות או explants28,29,30,31. זה הוצג לאחרונה זה בעיקר את CD105+/CD90–/c-kit– תא שבר מוצגים cardiomyogenic, פוטנציאל הרגנרציה32.
כאן, אנו באמצעות SP-CPCs מבודד מן העכברים, מספקים פרוטוקול אינדוקציה יעיל של השושלת אנדותל מבוסס על מחקר קודם CPCs חולדה, עכבר SP-CPCs33. הפרוטוקול מכיל עיבודים ספציפית לתרבות, טכניקה הרחבה לגבי צפיפות התאים, התוכן סרום של המדיום, ואת המצע. זה יכול לחול לא רק על העכבר SP-CPCs אך לסוגים שונים של CPCs למטרה לזירוז מתג גורל מ הגברה ל CPC אנדותל שבוצעו, יהיה זה על רקע השתלת תאים אלה או השימוש בהם ללימודי מכניסטית במבחנה .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Culture medium</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#12440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>#SH30071</td>
			<td>3.5% (0.1% for lineage induction)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td>#25030</td>
			<td>Final concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thrombin</td>
			<td>Diagontech AG, Switzerland</td>
			<td>#100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.05 % Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T75 Flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial differentiation&#160;&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ham&#39;s F-12K (Kaighn&#39;s) Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fibronectin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#F4759</td>
			<td>Dilute in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#F1635</td>
			<td>Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#93420</td>
			<td>0.1% in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#50062Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-von Willebrand Factor antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab6994</td>
			<td>1:100 in 10% goat serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#A11010</td>
			<td>1:500 in 10% goat serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#62247</td>
			<td>1:500 in ddH2O&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SlowFade Antifade Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#S2828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BX63 widefield microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube formation</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >#352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Matrigel Growth Factor Reduced</td>
			<td >Corning</td>
			<td >#354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX50 widefield microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet.</td>
			<td >in house hospital pharmacy</td>
			<td >#9077862</td>
			<td>Working solution: 200 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#14175</td>
			<td>Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS&#160; for quenching Collagenase B activity&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#331885</td>
			<td>Prepare DMEM + 10% FBS&#160; + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES 1 M</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#15630080</td>
			<td>Final concentration 25 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >#SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RBC LysisBuffer (10X)</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >#420301/100mL</td>
			<td>Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collagenase B</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#11088807001</td>
			<td>Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#B2261</td>
			<td>Prepare 1 mg/mL in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Verapamil-hydrochloride&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#V4629</td>
			<td>Final concentration 83.3 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#551262</td>
			<td>0.25 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#557405</td>
			<td>0.6 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-Aminoactinomycin D (7-ADD)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#A1310</td>
			<td>0.15 &#181;g/106cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC rat IgG2a k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#553932</td>
			<td>0.25 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC Rat IgG2a k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554688</td>
			<td>0.6 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Material</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles 27G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>#NN-2719R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles 18G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>#NN-1838S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Use Syringes 1 mL sterile</td>
			<td>CODAN</td>
			<td>#62.1640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transferpipette 3.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#86.1171.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Strainer 40 &#181;m blue</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>#352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Strainer 100 &#181;m yellow</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lumox Dish 50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#94.6077.305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture Dishes P100</td>
			<td>Corning</td>
			<td >#353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture Dishes P60</td>
			<td>Corning</td>
			<td >#353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Line</td>
			<td>Age</td>
			<td>Breeding</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6NRj / male</td>
			<td>12 weeks</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Product Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue No.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#12440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>#SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td>#25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thrombin</td>
			<td>Diagontech AG, Switzerland&#160;</td>
			<td>#100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Product Name</td>
			<td>Medium 18</td>
			<td>Medium 2</td>
			<td>Medium 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td>Culture</td>
			<td>Lineage induction</td>
			<td>Endothelial diff.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>35%</td>
			<td>35%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>65%</td>
			<td>65%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>1%</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>3.5%</td>
			<td>&#8804;0.1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>0.2 nM</td>
			<td>0.2 nM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>1.3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>6.5 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>13 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>0.65 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of endothelial differentiation in cardiac progenitor cells under low serum conditions

ובתאים הלב (CPCs) ייתכן טיפולית פוטנציאל התחדשות לב לאחר פציעה. בלב יונקים בוגרים, CPCs מהותי נדיר, אך CPCs המורחב יכול להיות שימושי עבור טיפול בתאי. תנאי הכרחי לשימוש שלהם הוא היכולת להתמיין בצורה מבוקרת שושלות לב שונים באמצעות פרוטוקולי מוגדר ויעיל. בנוסף, על הרחבת במבחנה , CPCs מבודדים מחולים או מחלות פרה מודלים עשויים להציע כלי מחקר פורה לחקירה של מנגנוני המחלה.
מחקרים נוכחיים להשתמש סמנים שונים לזיהוי CPCs. עם זאת, לא כולם באים לידי ביטוי אצל בני אדם, אשר מגביל את השפעת translational מחקרים פרה. פרוטוקולים בידול הרלוונטיים ללא קשר ההבעה טכניקה, סמן בידוד יאפשר הרחבת מתוקננת ואת לקרקע של CPCs לצורך טיפול תא. כאן נתאר כי לקרקע של CPCs תחת ריכוז נמוך סרום שור עוברית (FBS) ותנאי צפיפות נמוכה תא מקלה את הבידול אנדותל של CPCs. באמצעות שתי subpopulations שונות של עכבר, חולדה CPCs, אנו מראים ש-laminin את זה יותר המצע מתאימה יותר fibronectin למטרה זו תחת פרוטוקול הבאים: לאחר culturing במשך 2-3 ימים בינוני כולל תוספי תזונה זה לשמור על multipotency ועם 3.5% FBS, CPCs נזרע על laminin ב < 60% הנהרות ותרבותית ב ללא תוספת בינוני עם ריכוזים נמוכים של FBS (0.1%) 20-24 שעות לפני בידול בידול אנדותל בינוני. מאחר CPCs הם אוכלוסיה הטרוגנית, סרום ריכוזים ושעות הדגירה עשוי צריכים להיות מותאמים בהתאם המאפיינים של subpopulation בהתאמה עלות לקליק. בהתחשב בכך, הטכניקה ניתן להחיל על סוגים אחרים של CPCs כמו גם והוא מספק שיטה שימושית כדי לחקור את הפוטנציאל ואת המנגנונים של בידול, כיצד הן מושפעות על ידי מחלת בעת שימוש CPCs מבודד מן המחלה בהתאמה מודלים.

בידוד SP-CPC העכבר:
במחקר זה, השתמשנו CPCs העכבר מבודד על פי פנוטיפ SP, ואילו תוצאות של עכברוש CPCs ששינה והוסיף מן הדוח הקודם עם הרשאה (איור 8)33.
התפשטות תאים מתחת הצפיפויות גבוהות ונמוכות...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions at JoVE.com

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

פרוטוקול זה מתאר שיטת בידול אנדותל עבור ובתאים הלב. הוא מתמקד במיוחד כיצד סרום ריכוז וצפיפות זורעות תא משפיעים על פוטנציאל התמיינות אנדותל.

אינדוקציה של אנדותל התמיינות בתאים לב בתנאים בסרום נמוך

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

ההידול של תאי הצאצאים הלבביים, או CPCs, בעת הגברה דורש מעבר פאזה מהתרבות לשלב מחויב, ופרוטוקול זה משתמש בשושלת אנדותל יעילה ב- CPCs. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שהיא חלה על CPCs מבודדים על סמך מספר טכניקות ומינים שונים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לשפר את הפוטנציאל הטיפולי של CPCs לטיפול בתאים.זה יכול לשמש גם כדי לחקור את הפוטנציאלים ואת המנגנונים של ההתברות וכיצד אלה מושפעים ממחלות לב. CPCs הם אוכלוסייה לא אנושית של תאים שעשויים להיות שונים בצורה, בגודל ובעוצמה. לכן, יש להתאים את הפרוטוקול בהתאם לתת-תפוקה הספציפית של CPCs המשמשים.לאחר הרדמה של העכבר, לנגב את החזה שלה עם 70% אתנול. באמצעות מספריים, לחתוך את העור ואת קיר בית החזה כדי לחשוף את חלל בית החזה. השתמש מדפים כדי להרים את הלב, ולאחר מכן להשתמש במספריים לחתוך אותו בבסיס.מעבירים את הלב לצלחת תרבות P60 המכילה חמישה מיליליטר של PBS קר, ולאחר מכן להשתמש במטלפים כדי לשאוב את הלב ולפלט את הדם מתוך החללים. מניחים את הלב בצלחת P60 המכילה חמישה מיליליטר של PBS קר ולשטוף אותו. השתמש מספריים קטנים כדי להסיר את האטריה, לחתוך את הלב לשתי חתיכות אורך, ולשטוף אותם חמישה מיליליטר של קרח קר PBS.באמצעות מספריים קטנים, לחתוך את חתיכות הלב לחלקים קטנים יותר. הוסיפו טיפת תוסף מלח מאוזן של האנק המכיל קולגן B בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר, ולהשתמש בסכין גילוח סטרילי כדי לטחון את חתיכות הלב הקטנות ביסודיות. לאחר מכן, מוסיפים 2.5 מיליליטר של תוסף הקולגנס B לצלחת.מניחים את המנה בזווית של 30 מעלות באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס. תן חתיכות לב טחון דגירה לכל היותר 30 דקות תוך העברת אותם שוב ושוב דרך פיפטה פסטר כל 10 דקות במהלך הדגירה. ראשית, הוסיפו חמישה מיליליטר של HBSS קר בתוספת 2%FBS לחתיכות הלב הטחון וההומוגני.באמצעות מסנן 100 מיקרומטר, לסנן את חתיכות הלב כדי להסיר כל רקמה מעוכל. צנטריפוגה ב 470 פעמים G ו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת הכדור בחמישה מיליליטר של חיץ תותלי דם אדומים.דגירה על קרח במשך חמש דקות עם רעידות מדי פעם. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של PBS ולסנן את המדגם באמצעות מסנן 40 מיקרומטר כדי לא לכלול תאים גדולים יותר כולל שאריות cardiomyocytes. צנטריפוגה ב 470 פעמים G ו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות ללא הפסקה.לאחר מכן, להשעות מחדש את התאים ב- DMEM בתוספת 10%FBS, מכוון ריכוז התא הסופי של מיליון תאים למיליליטר. פזרו את התאים לשני צינורות להכתמה ומיון, והוסיפו 1.5 מיליליטר של תפתור התא לצינור אחד ו-3.5 מיליליטר לצינור השני. מוסיפים את פתרון Hoechst ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות עם היפוך מדי פעם כדי להבטיח הפצה שווה של הצבע ולמנוע קרישה של התאים.האוכלוסייה הצדדית מופיעה בפינה השמאלית התחתונה הנמוכה של הויצ'אסט מלבד האוכלוסייה הראשית. בעלילה FACS ניתן לזהות אותו בהתבסס על הפקד השלילי שבו verapamil מבקש האוכלוסייה הצדדית להיעלם. מחממים בינוני אחד עד 37 מעלות צלזיוס ומצננים את הצנטריפוגה לארבע מעלות צלזיוס.צנטריפוגה צינורות המיון ב 470 פעמים G וב ארבע מעלות צלזיוס במשך שש דקות. לאחר מכן, השהה מחדש את התאים בתא בינוני אחד. מעבירים את התאים לצלחת P60 חדירה לגז המכילה ארבעה מיליליטר של בינוני אחד.שנה את המדיום כל שלושה ימים עד שהתאים הגיעו להתכנסות בין 70% ל- 80%Culture SP-CPCs למשך יומיים עד שלושה בבקבוקי T75 באמצעות שמונה מיליליטר של בינוני אחד בכל בקבוקון. לאחר מכן, שאפו בזהירות את המדיום ושטוף בעדינות את הבקבוק בחמישה מיליליטר של HBSS חם. לטפל בתאים עם חמישה מיליליטר של טריפסין EDTA במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.לאחר מכן, להוסיף חמישה מיליליטר של בינוני אחד כדי לעצור את פעילות טריפסין, ולהעביר את ההשעיה התא לצינור 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 470 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השהה מחדש את התאים בתא בינוני אחד או בשניים בינוניים.צלחת התאים על מנות P60, ציפוי 250, 000 SP-CPCs למנה עם שלושה מיליליטר של בינוני המכיל ריכוזי סרום שונים. לאחר יומיים של culturing, לאסוף את המדיום מכל מנה לתוך צינור 15 מיליליטר כדי לאסוף את התאים המתים. טריפסין התאים חסיד כפי שתואר בעבר ולאסוף את ההשעיה התא לתוך הצינור 15 מיליליטר המכיל את המדיום שנאסף.צנטריפוגה ב 840 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שאף את supernatant ולהוסיף מיליליטר אחד של בינוני אחד או בינוני שתיים לספירת תאים. הכתם את ה- SP-CPCs בכחול טריפאן וספיר את התאים בני קיימא ומתים. ראשית, שאפו את המדיום מהתאים המוכנים, ושטוף אותם בעדינות בחמישה מיליליטר של HBSS חם.לטפל בתאים עם חמישה מיליליטר של טריפסין EDTA במשך חמש דקות באינקובטור התא. לאחר מכן, להוסיף חמישה מיליליטר של בינוני אחד כדי לעצור את פעילות טריפסין. מעבירים את מתלי התא לצינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 470 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.שאפו את העל-טבעי והוסיפו שניים בינוניים לספירת תאים. לאחר מכן, זרע 80, 000 תאים לתוך כל באר של צלחת תרבות מצופה מראש שש באר עם שלושה מיליליטר של בינוני שתיים. שמור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 עד 24 שעות, ולאחר מכן לשנות את המדיום בכל באר לשלושה מיליליטר של בינוני שלוש.תרבות הצלחת במשך 21 ימים, שינוי המדיום כל שלושה ימים. לאחר מכן, להכתים את התאים עם סמן אנדותל ולבצע מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאמת את האופי ה אנדותל של התאים המובחנים. ראשית, שאפו את המדיום מהתאים המוכנים ושטוף אותם בעדינות בחמישה מיליליטר של HBSS חם.לטפל בתאים עם שני מיליליטר של טריפסין EDTA במשך חמש דקות באינקובטור התא, ולאחר מכן להוסיף שלושה מיליליטר של בינוני שלוש כדי לעצור את פעילות טריפסין. מעבירים את מתלי התא לצינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 470 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את העל-טבעי והוסיפו מיליליטר אחד של מדיום 3, תוך כדי ערבוב עדין.לספור את התאים ואת הזרע בין 2, 000 ו 4, 000 תאים ב 100 microliters של בינוני שלוש לכל מטריצה מצופה היטב של צלחת 96 באר. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ שדה בהיר בהגדלה פעמיים כדי לצלם את התאים.במחקר זה, תנאים מתאימים נחקרים להקלה על מחויבות שושלת אנדותל של תאי לב. כאשר קונפלינציית התא היא ב- 60% או מתחת לה, לא נראה הבדל משמעותי בדגימות שטופלו ב- 3.5%FBS. כאשר תאים ב confluency זו מטופלים עם 0.1%FBS, הם מראים ירידה בהתפשטות התא על למינין בהשוואה פיברונאקטין, אבל לא מראים עלייה במוות התא.לעומת זאת, תאים בקונפלות גבוהה מראים שאין הבדל משמעותי בהתפשטות התאים או במוות התאים בין שני התנאים. שינויים בצורת התא נראים כאינדיקטור לתנאי תרבות מתאימים שבהם דיפרנציאלי אנדותל הולך להיות מוצלח. בתוך שבעה עד 14 ימים במדיום דיפרנציאלי אנדותל, תרבויות מוצלחות נתפסות להכיל תאים גדולים יותר עם מורפולוגיה שונה.באופן מעניין, תאים אלה נעלמו לקראת סוף שלב ההידול ונטה להופיע במספרים נמוכים יותר ובזמן מאוחר יותר מצביעים על תרבויות בצפיפות גבוהה. היווצרות צינור הוא מוצלח באופן עקבי בתאים מצופים בצפיפות נמוכה מובחן על למינין, בעוד הוא נראה בעיקר להיכשל בתאים מצופים בצפיפות גבוהה. בעוד היווצרות הצינור הוא בעיקר לא מוצלח בתאים מתורבתים על fibronectin ללא קשר לצפיפות התא, אלה מובחנים בצפיפות נמוכה לפעמים יוצרים צינורות בסיסיים.ריכוז הסרום וצפיפות התאים כדי לגרום לשושלת אנדותל הם קריטיים, ויש להתאים אותם כדי להבטיח האטה של התפשטות תוך שמירה על הכדאיות. עם אינדוקציה שושלת, CPCs מבני אדם או מודלים מחלה פרה-קלינית עשוי לשמש עבור מחקרים השתלת תאים כדי להעריך את פוטנציאל ההידול in vivo שלהם. פרוטוקול זה יכול לעזור ללמוד או להקים כלי התחדשות לב חדשניים, והוא שימש בעבר לחקר מנגנון מולקולרי של מחויבות שושלת מוקדמת.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

גזירה של תאי לב ותאים מתאי גזע עובריים

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

ייזום בידול בתאי multipotent otic אב הונצחו

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Chondrogenic בידול האינדוקציה של תאי גזע שמקורם שומן על ידי הכביד צנטריפוגלי

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

בדור מחוץ לתחום של לב העכבר שדה מסוים בתאי לב

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

פאן-מיאלואיד הבידול של האדם כבל דם נגזר CD34+ המטפאות גזע ותאים מחולל

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine ...

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

יעיל הבידול של הנוירונים האוהדים הסימפתטית באמצעות בתאי גזע האדם Pluriפוטנטי תחת ממזין-חינם ומוגדר כימית תנאים תרבות

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...