Name: induction of endothelial differentiation in cardiac progenitor cells under low serum conditions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions at JoVE.com

Gli autori ringraziano Vera Lorenz per il suo sostegno utile durante gli esperimenti e il personale dell'impianto di citometria a flusso dal dipartimento di biomedicina (DBM), Università e ospedale universitario di Basilea. Questo lavoro è stato supportato dal soggiorno-su pista programma presso l'Università di Basilea (per Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster è sostenuta da una sovvenzione della Swiss National Science Foundation (concessione numero 310030_156953).

L'uso di topi per scopo di isolamento cellulare era in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e con la legge di protezione animale Svizzera ed è stato approvato dalle autorità cantonali svizzere.
Nota: L'isolamento di Sca-1+/CD31– SP-CPCs dal cuore del mouse essenzialmente è stato fatto come descritto in precedenza34 con alcune modifiche. Per i materiali e i reagenti utilizzati, Vedi Tabella materiali</s...

<ol>
	<li>Beltrami, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+support+myocardial+regeneration.">Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration.</a> Cell. 114 (6), 763-776 (2003).</li><li>Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+post-natal+heart+contains+a+myocardial+stem+cell+population.">The post-natal heart contains a myocardial stem cell population.</a> FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).</li><li>Sandstedt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+atrium+of+the+human+adult+heart+contains+a+population+of+side+population+cells.">Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells.</a> Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255 (2012).</li><li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+(SCIPIO):+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial.">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li><li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+(CADUCEUS):+a+prospective,+randomised+phase+1+trial.">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li><li>Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+fates+of+cardiovascular+progenitor+cells.">Origins and fates of cardiovascular progenitor cells.</a> Cell. 132 (4), 537-543 (2008).</li><li>Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocyte+progenitor+cells+differentiate+into+functional+mature+cardiomyocytes:+an+in+vitro+model+for+studying+human+cardiac+physiology+and+pathophysiology.">Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology.</a> Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).</li><li>Noseda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGFRalpha+demarcates+the+cardiogenic+clonogenic+Sca1++stem/progenitor+cell+in+adult+murine+myocardium.">PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium.</a> Nature Communications. 6, 6930 (2015).</li><li>Linke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+dog+heart+are+self-renewing,+clonogenic,+and+multipotent+and+regenerate+infarcted+myocardium,+improving+cardiac+function.">Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function.</a> Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).</li><li>El-Mounayri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+differentiation+of+functional+human+coronary-like+vascular+smooth+muscle+cells+from+embryonic+stem+cells.">Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).</li><li>Ellison, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+c-kit(pos)+cardiac+stem+cells+are+necessary+and+sufficient+for+functional+cardiac+regeneration+and+repair.">Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair.</a> Cell. 154 (4), 827-842 (2013).</li><li>Oh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cells+from+adult+myocardium:+homing,+differentiation,+and+fusion+after+infarction.">Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction.</a> Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).</li><li>Martin, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+expression+of+the+ATP-binding+cassette+transporter,+Abcg2,+identifies+cardiac+SP+cells+in+the+developing+and+adult+heart.">Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart.</a> Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).</li><li>Pfister, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD31-+but+Not+CD31++cardiac+side+population+cells+exhibit+functional+cardiomyogenic+differentiation.">CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation.</a> Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).</li><li>Pelekanos, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transcriptome+and+immunophenotype+analysis+of+renal+and+cardiac+MSC-like+populations+supports+strong+congruence+with+bone+marrow+MSC+despite+maintenance+of+distinct+identities.">Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities.</a> Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).</li><li>Laugwitz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+isl1++cardioblasts+enter+fully+differentiated+cardiomyocyte+lineages.">Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages.</a> Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).</li><li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ISL1+heart+progenitors+generate+diverse+multipotent+cardiovascular+cell+lineages.">Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages.</a> Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).</li><li>Smith, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+resident+endogenous+c-Kit++cardiac+stem+cells+from+the+adult+mouse+and+rat+heart.">Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).</li><li>Matsuura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+cardiac+Sca-1-positive+cells+differentiate+into+beating+cardiomyocytes.">Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).</li><li>Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+migration+of+Sca1+/CD31-+cardiac+side+population+cells+in+a+murine+myocardial+ischemic+model.">Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model.</a> International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).</li><li>Vicinanza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+robustly+myogenic:+c-kit+expression+is+necessary+but+not+sufficient+for+their+identification.">Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).</li><li>Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+c-kit+receptor,+stem+cell+factor,+and+mast+cells.+What+each+is+teaching+us+about+the+others.">The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others.</a> American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).</li><li>Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+c-kit+expression+in+human+endothelial+cells+by+inflammatory+stimuli.">Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli.</a> Blood. 90 (1), 148-155 (1997).</li><li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+c-kit+in+hemopoietic+progenitor+cells.">Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).</li><li>Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Sca-1+in+hematopoietic+stem/progenitor+cell+function.">Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function.</a> Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Pfister, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+ATP-binding+cassette+transporter+Abcg2+in+the+phenotype+and+function+of+cardiac+side+population+cells.">Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells.</a> Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).</li><li>Messina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem+cells+from+human+and+murine+heart.">Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart.</a> Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).</li><li>Davis, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+cardiosphere+method+to+culture+cardiac+progenitor+cells+from+myocardial+tissue.">Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue.</a> PLoS One. 4 (9), e7195 (2009).</li><li>Carr, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiosphere-derived+cells+improve+function+in+the+infarcted+rat+heart+for+at+least+16+weeks--an+MRI+study.">Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study.</a> PLoS One. 6 (10), e25669 (2011).</li><li>Martens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhesus+monkey+cardiosphere-derived+cells+for+myocardial+restoration.">Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration.</a> Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+roles+of+CD90+and+c-kit+to+the+regenerative+efficacy+of+cardiosphere-derived+cells+in+humans+and+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction.">Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260 (2014).</li><li>Mochizuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo-Like+Kinase+2+is+Dynamically+Regulated+to+Coordinate+Proliferation+and+Early+Lineage+Specification+Downstream+of+Yes-Associated+Protein+1+in+Cardiac+Progenitor+Cells.">Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).</li><li>Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+resident+cardiac+progenitor+cells+by+Hoechst+33342+staining.">Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining.</a> Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).</li><li>Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors,+matrices,+and+forces+combine+and+control+stem+cells.">Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells.</a> Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).</li><li>Plaisance, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+Lineage+Specification+in+Adult+Human+Cardiac+Precursor+Cells+Via+Modulation+of+Enhancer-Associated+Long+Noncoding+RNA+Expression.">Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression.</a> JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).</li></ol>

Vantaggi di questo protocollo:
Questo protocollo fornisce una tecnica di differenziazione endoteliale di CPC. Abbiamo trovato che una concentrazione bassa nel siero e la densità delle cellule basso potrebbe migliorare l'efficienza della differenziazione endoteliale, per cui LN ha dimostrato di essere un substrato più adatto di FN in queste condizioni. Abbiamo usato due tipi distinti di CPC: ratto CPCs, che sono stati utilizzati in maniera linea-come delle cellule e mouse SP-CPC, che sono stati ...

Gli studi recenti sostengono l'esistenza di cellule progenitrici cardiache residenti (CPCs) nel cuore di un mammifero adulto1,2,3, e CPC potrebbe essere una fonte utile per la terapia cellulare dopo lesione cardiaca4, 5. Inoltre, espanso CPCs può fornire un modello fecondo per lo screening di stupefacenti e lo studio dei meccanismi di malattia quando isolati da pazienti con rare malattie del miocardio o da malattia rispettiva modelli6,7.
CPC isolate da cuore adulto possiedono cellule staminali/progenitrici delle cellule caratteristiche1,2,3,8 come sono multipotenti, clonogeniche, e hanno la capacità di auto-rinnovamento. Tuttavia, ci sono molti differenti (sotto) popolazioni di CPC che presentino profili marcatore di superficie differenti, tra cui, ad esempio, c-kit, Sca-1 e altri, o estratto mediante tecniche di isolamento diverso (tabella 1). Diversi protocolli di differenziazione e cultura sono stati stabiliti1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Questi protocolli variano soprattutto per quanto riguarda il fattore di crescita e il contenuto di siero, che vengono regolati in base allo scopo della coltura e che possono causare differenze nei risultati e risultati, compresa l'efficienza differenziazione.
Tecniche di isolamento basati su marker:
CPC può essere isolato basato su un indicatore della superficie specifica espressione1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Gli studi precedenti suggeriscono che il c-kit e Sca-1 può essere i migliori marcatori per isolare residente CPCs1,11,14,19,20. Perché nessuno di questi indicatori è veramente specifica per CPCs, solitamente vengono applicate le combinazioni di marcatori diversi. Ad esempio, mentre CPCs esprimono bassi livelli di c-kit21, c-kit è espressa anche da altri tipi di cellule, tra cui mastociti22, cellule endoteliali23e di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche24. Un ulteriore problema è il fatto che non tutti gli indicatori sono espressi in tutte le specie. Questo è il caso per Sca-1, che si esprime nel topo ma non nell'umano25. Pertanto, utilizzando protocolli che sono indipendenti di marcatori di isolamento può essere vantaggioso in considerazione studi clinici e studi utilizzando campioni umani.
Tecniche di isolamento di marcatore indipendente:
Ci sono diverse tecniche principali di isolamento CPC, che sono principalmente indipendenti dell'espressione dei marker di superficie, ma che può essere affinata dalla selezione consecutiva di specifici marcatori positivi subfractions come necessario (vedere anche tabella 1). (1) la tecnica di popolazione (SP) lato originalmente è stata caratterizzata in una primitiva popolazione di cellule staminali ematopoietiche basato sulla capacità di deflusso il colorante DNA Hoechst 3334226 di ATP-binding cassette (ABC) trasportatori27. Cellule cardiache SP sono state isolate da diversi gruppi e segnalate per esprimere una varietà di indicatori con alcune lievi differenze tra rapporti2,8,13,14. (2) le cellule del fibroblasto unità formazione di colonie (CFU-Fs) originalmente sono state definite basato su una cellula stromal mesenchymal (MSC)-come il fenotipo. MSCs isolato sono coltivate su piatti per indurre la formazione della Colonia. Tale formazione di colonie MSC-come CFU-Fs possono essere isolate da cuore adulto e sono in grado di differenziarsi in lignaggi cardiaco15. (3) cellule cardiosfere (CDC) sono singole cellule derivate da aggregati di cellule coltivate da biopsie dei tessuti o espianti28,29,30,31. Recentemente è stato dimostrato che per lo più il CD105+/CD90 frazione di cellule /c-kit– –esibisce cardiomiogenici e potenziale rigenerativo32.
Qui, utilizzando SP-CPCs isolate da topi, forniamo un protocollo per l'induzione efficiente di stirpe endothelial basato su uno studio precedente in ratto CPCs e mouse SP-CPCs33. Il protocollo contiene specifici adattamenti alla cultura e tecnica di espansione per quanto riguarda la densità delle cellule, il contenuto di siero del mezzo e il substrato. Esso può essere applicato non solo al mouse SP-CPC ma di diversi tipi di CPC per lo scopo di indurre un interruttore di destino da un'amplificazione di un CPC endoteliale commesso, sia esso in considerazione il trapianto di queste cellule o dal loro impiego per gli studi meccanicistici in vitro .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Culture medium</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#12440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>#SH30071</td>
			<td>3.5% (0.1% for lineage induction)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td>#25030</td>
			<td>Final concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thrombin</td>
			<td>Diagontech AG, Switzerland</td>
			<td>#100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.05 % Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T75 Flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial differentiation&#160;&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ham&#39;s F-12K (Kaighn&#39;s) Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fibronectin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#F4759</td>
			<td>Dilute in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#F1635</td>
			<td>Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#93420</td>
			<td>0.1% in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#50062Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-von Willebrand Factor antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab6994</td>
			<td>1:100 in 10% goat serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#A11010</td>
			<td>1:500 in 10% goat serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#62247</td>
			<td>1:500 in ddH2O&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SlowFade Antifade Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#S2828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BX63 widefield microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube formation</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >#352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Matrigel Growth Factor Reduced</td>
			<td >Corning</td>
			<td >#354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX50 widefield microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet.</td>
			<td >in house hospital pharmacy</td>
			<td >#9077862</td>
			<td>Working solution: 200 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#14175</td>
			<td>Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS&#160; for quenching Collagenase B activity&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#331885</td>
			<td>Prepare DMEM + 10% FBS&#160; + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES 1 M</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#15630080</td>
			<td>Final concentration 25 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >#SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RBC LysisBuffer (10X)</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >#420301/100mL</td>
			<td>Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collagenase B</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#11088807001</td>
			<td>Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#B2261</td>
			<td>Prepare 1 mg/mL in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Verapamil-hydrochloride&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#V4629</td>
			<td>Final concentration 83.3 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#551262</td>
			<td>0.25 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#557405</td>
			<td>0.6 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-Aminoactinomycin D (7-ADD)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#A1310</td>
			<td>0.15 &#181;g/106cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC rat IgG2a k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#553932</td>
			<td>0.25 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC Rat IgG2a k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554688</td>
			<td>0.6 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Material</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles 27G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>#NN-2719R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles 18G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>#NN-1838S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Use Syringes 1 mL sterile</td>
			<td>CODAN</td>
			<td>#62.1640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transferpipette 3.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#86.1171.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Strainer 40 &#181;m blue</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>#352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Strainer 100 &#181;m yellow</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lumox Dish 50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#94.6077.305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture Dishes P100</td>
			<td>Corning</td>
			<td >#353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture Dishes P60</td>
			<td>Corning</td>
			<td >#353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Line</td>
			<td>Age</td>
			<td>Breeding</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6NRj / male</td>
			<td>12 weeks</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Product Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue No.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#12440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>#SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td>#25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thrombin</td>
			<td>Diagontech AG, Switzerland&#160;</td>
			<td>#100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Product Name</td>
			<td>Medium 18</td>
			<td>Medium 2</td>
			<td>Medium 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td>Culture</td>
			<td>Lineage induction</td>
			<td>Endothelial diff.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>35%</td>
			<td>35%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>65%</td>
			<td>65%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>1%</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>3.5%</td>
			<td>&#8804;0.1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>0.2 nM</td>
			<td>0.2 nM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>1.3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>6.5 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>13 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>0.65 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of endothelial differentiation in cardiac progenitor cells under low serum conditions

Cellule progenitrici cardiache (CPCs) possono avere potenziale terapeutico per la rigenerazione cardiaca dopo la ferita. Nel cuore dei mammiferi adulto, intrinseca CPC sono estremamente scarse, ma espanso CPCs potrebbe essere utile per la terapia cellulare. Un prerequisito per il loro uso è la loro capacità di differenziarsi in modo controllato nei vari lignaggi cardiaci utilizzando protocolli definiti ed efficienti. Inoltre, all'espansione in vitro , CPCs isolati da pazienti o malattia preclinica modelli possono offrire strumenti di ricerca fruttuosa per l'indagine sui meccanismi della malattia.
Gli studi correnti utilizzano differenti marcatori per identificare CPCs. Tuttavia, non tutti sono espressi in esseri umani, che limita l'impatto traslazionale di alcuni studi preclinici. Protocolli di differenziazione che siano applicabili indipendentemente dall'espressione tecnica e marcatore di isolamento consentirà l'espansione standardizzati e adescamento di CPC per scopo di terapia cellulare. Qui descriviamo che facilita l'innesco di CPC sotto una concentrazione bassa nel siero bovino fetale (FBS) e condizioni di densità bassa delle cellule la differenziazione endoteliale del CPCs. utilizzando due differenti sottopopolazioni di topo e di ratto CPCs, indichiamo che laminin è un più substrato adatto di fibronectina per questo scopo sotto il seguente protocollo: dopo la coltura per 2-3 giorni in mezzo compresi gli integratori che mantenere multipotenza e con 3,5% FBS, CPC sono seminati su laminina a < 60% confluenza e coltivate in medium senza supplemento con basse concentrazioni di FBS (0,1%) per 20-24 ore prima differenziazione in mezzo di differenziazione endoteliale. Perché CPC sono una popolazione eterogenea, le concentrazioni nel siero e tempi di incubazione potrebbero essere necessario essere regolata a seconda delle proprietà della sottopopolazione rispettiva CPC. Considerando questo, la tecnica può essere applicata ad altri tipi di CPC anche e fornisce un metodo utile per studiare i meccanismi di differenziazione e come essi sono influenzati dalla malattia quando si utilizza il CPCs isolato dai modelli rispettivi malattia e potenziale.

Isolamento di SP-CPC del mouse:
In questo studio, abbiamo usato del mouse CPCs isolato secondo il fenotipo di SP, considerando che risultati da ratto CPC sono modificati e aggiunto da una precedente relazione con autorizzazione (Figura 8)33.
Proliferazione delle cellule in cella ad alta e bassa densità e con le concentra...

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Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Questo protocollo descrive una tecnica di differenziazione endoteliale di cellule progenitrici cardiache. Si concentra in particolare su come la concentrazione nel siero e la densità di semina delle cellule influenzano il potenziale di differenziazione endoteliale.

Induzione di differenziazione endoteliale in cellule progenitrici cardiache in condizioni di basso del siero

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

La differenziazione delle cellule progenitrici cardiache, o CPC, all'amplificazione richiede un passaggio di fase da una fase proliferazione a una fase impegnata, e questo protocollo utilizza un'efficiente discendenza endoteliale nei CPC. Uno dei principali vantaggi della tecnica è che è applicabile ai CPC isolati sulla base di diverse tecniche e di specie diverse. Questo protocollo può essere utilizzato per migliorare le potenzialità terapeutiche dei CPC per la terapia cellulare.Può anche essere utilizzato per indagare i potenziali e i meccanismi di differenziazione e come questi sono influenzati da malattie cardiache. I CPC sono una popolazione disomogenea di cellule che può differire per forma, dimensione e potenza. Pertanto, il protocollo deve essere adeguato in base alla sottopopolazione specifica dei CPC utilizzati.Dopo aver anestetizzato il topo, pulire il petto con il 70% di etanolo. Usando le forbici, tagliare la pelle e la parete toracica per esporre la cavità toracica. Utilizzare le forcep per sollevare il cuore e quindi usare le forbici per tagliarlo alla base.Trasferire il cuore in un piatto di coltura P60 contenente cinque millilitri di PBS freddo, quindi utilizzare pinzi per pompare il cuore ed espellere il sangue dalle cavità. Mettere il cuore in un piatto P60 contenente cinque millilitri di PBS freddo e lavarlo. Usa piccole forbici per rimuovere gli atri, tagliare il cuore in due pezzi longitudinali e lavarli in cinque millilitri di PBS ghiacciato.Usando piccole forbici, tagliare i pezzi del cuore in sezioni più piccole. Aggiungere una goccia di soluzione salina bilanciata di Hank contenente collagenasi B a una concentrazione di un milligrammo per millilitro e utilizzare una lama sterile per tritare accuratamente i piccoli pezzi cardiaci. Quindi, aggiungere 2,5 millilitri della soluzione di collagenasi B al piatto.Posizionare il piatto con un angolo di 30 gradi in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Lasciare incubare i pezzi di cuore tritati per un massimo di 30 minuti mentre li passano ripetutamente attraverso una pipetta Pasteur ogni 10 minuti durante l'incubazione. In primo luogo, aggiungere cinque millilitri di HBSS freddi integrati con 2%FBS ai pezzi cardiaci tritati e omogeneizzati.Utilizzando un filtro da 100 micrometri, filtrare i pezzi cardiaci per rimuovere qualsiasi tessuto non digerito. Centrifuga a 470 volte G e a temperatura ambiente per cinque minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in cinque millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi.Incubare sul ghiaccio per cinque minuti con scuotimenti occasionali. Successivamente, aggiungere 10 millilitri di PBS e filtrare il campione attraverso un filtro da 40 micrometri per escludere le cellule più grandi, compresi i cardiomiociti residui. Centrifuga a 470 volte G e a temperatura ambiente per cinque minuti senza pausa.Quindi, sospendere nuovamente le cellule in DMEM integrate con 10%FBS, mirando a una concentrazione cellulare finale di un milione di cellule per millilitro. Distribuire le celle in due tubi per la colorazione e lo smistamento, aggiungendo 1,5 millilitri della soluzione cellulare a un tubo e 3,5 millilitri al secondo tubo. Aggiungere la soluzione di Hoechst e incubare a 37 gradi Celsius per 90 minuti con capovolgimento occasionale per garantire un'equa distribuzione del colorante e prevenire la coagulazione delle cellule.La popolazione laterale appare nell'angolo in basso a sinistra di Hoechst a parte la popolazione principale. Nel grafico FACS può essere identificato in base al controllo negativo in cui verapamil spinge la popolazione laterale a scomparire. Riscaldare medio da uno a 37 gradi Celsius e raffreddare la centrifuga a quattro gradi Celsius.Centrifugare i tubi di cernita a 470 volte G e a quattro gradi Celsius per sei minuti. Quindi, sospendere di nuovo le celle in una media. Trasferire le celle in un piatto P60 permeabile al gas contenente quattro millilitri di medio.Cambiare il mezzo ogni tre giorni fino a quando le celle non hanno raggiunto una confluenza compresa tra 70 e 80%Culture SP-CPC per due o tre giorni in flaconi T75 utilizzando otto millilitri di uno medio in ogni pallone. Successivamente, aspirare con cura il mezzo e sciacquare delicatamente il pallone con cinque millilitri di HBSS caldo. Trattare le cellule con cinque millilitri di tripside EDTA per cinque minuti a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%.Quindi, aggiungere cinque millilitri di uno medio per interrompere l'attività della tripina e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri. Centrifuga a 470 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, sospendere di nuovo le celle in due medie o medie.Placcare le celle su piatti P60, placcando 250.000 SP-CPC per piatto con tre millilitri di mezzo contenenti diverse concentrazioni siere. Dopo due giorni di coltura, raccogli il mezzo da ogni piatto in un tubo da 15 millilitri per raccogliere le cellule morte. Tripinare le cellule aderenti come descritto in precedenza e raccogliere la sospensione cellulare nel tubo da 15 millilitri che contiene il mezzo raccolto.Centrifugare a 840 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi aspirare il supernatante e aggiungere un millilitro di uno medio o medio due per il conteggio delle cellule. Macchiare gli SP-CPC con tripano blu e contare le cellule vitali e morte. In primo luogo, aspirare il mezzo dalle cellule preparate e sciacquarle delicatamente con cinque millilitri di HBSS caldo.Trattare le cellule con cinque millilitri di tripside EDTA per cinque minuti nell'incubatrice cellulare. Quindi, aggiungere cinque millilitri di uno medio per interrompere l'attività della tripina. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 470 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente.Aspirare il supernatante e aggiungerne due medi per il conteggio delle celle. Successivamente, semina 80.000 cellule in ogni pozzo di una piastra di coltura pre-rivestita a sei pozzi con tre millilitri di due medie. Mantenere la piastra a 37 gradi Celsius per 20-24 ore, quindi cambiare il mezzo in ogni pozzo a tre millilitri di media tre.Coltura del piatto per 21 giorni, cambiando il mezzo ogni tre giorni. Successivamente, macchiare le cellule con un marcatore endoteliale ed eseguire la microscopia a fluorescenza per verificare la natura endoteliale delle cellule differenziate. In primo luogo, aspirare il mezzo dalle cellule preparate e sciacquarle delicatamente con cinque millilitri di HBSS caldo.Trattare le cellule con due millilitri di tripside EDTA per cinque minuti nell'incubatore di cellule, quindi aggiungere tre millilitri di media tre per interrompere l'attività della tripina. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 470 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e aggiungere un millilitro di tre medi, pipettando delicatamente per mescolare.Contare le cellule e il seme tra 2.000 e 4.000 cellule in 100 microlitri di media tre per ogni matrice rivestita di pozzo di una piastra da 96 porri. Incubare il piatto a 37 gradi Celsius per 16 ore. Successivamente, utilizzare un microscopio a campo luminoso con un ingrandimento due volte superiore per scattare una foto delle cellule.In questo studio vengono esplorate le condizioni adeguate per facilitare l'impegno di lignaggio endoteliale delle cellule progenitrici cardiache. Quando la confluenza cellulare è al 60% o al di sotto di esso, non si vede alcuna differenza significativa nei campioni trattati con FBS al 3,5%. Quando le cellule a questa confluenza vengono trattate con 0,1%FBS, mostrano una diminuzione della proliferazione cellulare sulla laminina rispetto alla fibronectina, ma non mostrano alcun aumento della morte cellulare.Al contrario, le cellule ad alta confluenza non mostrano alcuna differenza significativa nella proliferazione cellulare o nella morte cellulare tra le due condizioni. I cambiamenti nella forma cellulare sembrano essere un indicatore di condizioni di coltura adeguate in cui la differenziazione endoteliale avrà successo. Entro sette o 14 giorni nel mezzo di differenziazione endoteliale, si vede che le colture di successo contengono cellule più grandi con morfologia diversa.È interessante notare che queste cellule scomparvero verso la fine della fase di differenziazione e tendevano ad apparire in numero inferiore e in poi punti in colture ad alta densità. La formazione del tubo ha costantemente successo nelle cellule placcate a bassa densità e differenziate sulla laminina, mentre si vede per lo più fallire nelle cellule placcate ad alta densità. Mentre la formazione del tubo non ha successo nelle cellule coltivate con fibronectina indipendentemente dalla densità cellulare, quelle differenziate a bassa densità a volte formano tubi rudimentali.La concentrazione siere e la densità cellulare per indurre il lignaggio endoteliale sono fondamentali e devono essere regolate per garantire il rallentamento della proliferazione mantenendo la vitalità. Dopo l'induzione del lignaggio, i CPC dell'uomo o i modelli di malattia preclinica possono essere utilizzati per studi di trapianto cellulare per valutare il loro potenziale di differenziazione in vivo. Questo protocollo potrebbe aiutare a studiare o stabilire nuovi strumenti di rigenerazione cardiaca, ed è stato precedentemente utilizzato per studiare il meccanismo molecolare dell'impegno di discendenza precoce.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Derivazione di cellule cardiache progenitrici di cellule staminali embrionali

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

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