Name: induction of endothelial differentiation in cardiac progenitor cells under low serum conditions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions at JoVE.com

著者実験と生物医学部 (DBM)、大学、バーゼル大学病院から流れ Cytometry 施設からスタッフの中には彼女の役に立つサポート ベラ ローレンツをありがちましょう。この作品は、滞在のトラック プログラム バーゼル大学から (享香望月) によって支えられました。ガブリエラ m. 型は、スイスの全米科学財団 (許可番号 310030_156953) からの助成金によってサポートされます。

細胞分離目的でマウスの使用スイスの動物保護法とケアと実験動物の使用のためのガイドに従ってされ、スイスのカントン当局によって承認されました。
注: Sca 1+/CD31 の分離-マウスの心臓から SP 単価本質的として行われていたいくつかの変更と前述の34 。材料および使用試薬、材料表を参照してください。すべての実験マ?...

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	<li>Beltrami, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+support+myocardial+regeneration.">Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration.</a> Cell. 114 (6), 763-776 (2003).</li><li>Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. 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What each is teaching us about the others.</a> American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).</li><li>Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+c-kit+expression+in+human+endothelial+cells+by+inflammatory+stimuli.">Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli.</a> Blood. 90 (1), 148-155 (1997).</li><li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+c-kit+in+hemopoietic+progenitor+cells.">Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).</li><li>Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. 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I., Liao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+resident+cardiac+progenitor+cells+by+Hoechst+33342+staining.">Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining.</a> Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).</li><li>Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. 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このプロトコルの利点:
このプロトコルは、クリック単価の内皮への分化技術を提供します。低血清濃度と細胞密度が低いが LN がこれらの条件の下で FN よりもより適切な基質をあることを証明という内皮への分化の効率を改善できるとわかった。クリック単価の 2 つのタイプを使いました: ラット分離され拡大した単価を細胞ラインのような方法とマウス SP クリック単価?...

最近の研究は大人の哺乳類心臓1,2,3居住者心臓前駆細胞 (クリック単価) の存在をサポートし、単価後心臓傷害4,細胞療法の有用な源になりうる5します。 さらに、拡張クリック単価が薬剤スクリーニングの有益なモデルを提供する、6、7モデルのまれな心筋症患者やそれぞれの病気から分離したときの疾病のメカニズムの調査研究。
成人の心臓から分離されたクリック単価が幹細胞/前駆細胞特性1,2,3,8を所有している彼らは、多能性、クローン、自己複製の能力を持っているとします。ただし、単価の異なる表面マーカー プロファイルを含む、たとえば、c キット、Sca 1、および他を展示または別の分離テクニック (表 1) によって取得の多くの異なる (サブ) 集団があります。いくつかの文化および分化のプロトコルが確立された1,2,8,9,10、11,12をされています。 13,14,15,16,17,18。これらのプロトコルは、主に対して、成長因子と血清量、培養の目的に応じて調整して、結果と分化効率を含む成果の違いにつながることができる変化します。
マーカーに基づく分離技術:
クリック単価は、特異的表面マーカー式1,2,8,9,10、11,12,13 に基づいて分離することができます。、14,15,16,17,18。以前の研究では、c キットと Sca 1 に常駐単価1,11,14,19,20を分離する最高のマーカーをかもしれないことを示唆しています。これらのマーカーのどれもが本当にクリック単価の特定、別のマーカーの組み合わせが通常適用されます。たとえば、クリック単価は、c キット21の低レベルを表現するのに対し c キットはまた22マスト細胞、血管内皮細胞23、および造血幹細胞/前駆細胞24を含む他の細胞型で表されます。その他の問題は、いないすべてのマーカーがすべての種の間で表されること事実です。これは、Sca 1、マウスではなく、人間25を表現するためのケースです。したがって、分離マーカーに依存しないプロトコルを使用した臨床試験やひと試料を用いた研究の観点から有利であるかもしれません。
マーカーに依存しない分離手法:
表面マーカー式の主に独立系であるが、これは、特定のマーカー陽性の亜分画の連続選択が (表 1を参照してください) を必要に応じてに洗練、CPC 分離のいくつかの主要な技法があります。(1) サイドの人口 (SP) 技術はもともと造血幹細胞による流出 DNA 色素ヘキスト 3334226機能 ATP 結合カセット (ABC) トランスポーター27の原始的な人口で特徴づけられています。心臓 SP 細胞は異なるグループによって分離されさまざまなレポート2,8,13,14のいくつかのマイナーな違いを使用してマーカーを表現する報告します。(2) コロニー形成線維芽細胞 (CFU Fs) もともと上で定義されたベース間葉系間質細胞 (MSC)-表現のような。コロニー形成を誘導するために料理に分離 MSCs を培養しています。このような MSC のような CFU Fs のコロニー形成は大人の心から分離できるので、心臓系統15に区別することができます。(組織生検から育つセルのクラスターから得られる単一のセルまたは28,29,30,31を外植体 3) 丹治派生セル (CDC)。主に CD105 最近示された+/CD90 cardiomyogenic と再生の潜在的な32-/c-kit-細胞画分を展示します。
ここで、マウスから隔離された SP クリック単価を使用して、クリック単価ラット、マウス SP 単価33の以前の研究に基づく内皮細胞系列の効率的な誘導プロトコルを提供します。プロトコルには、特定文化適応と拡張法細胞密度に対して、媒体、及び基板の血清量が含まれています。それはマウス SP 単価だけでなく、適用することができますが、内皮コミットのクリック単価を増幅するから運命のスイッチを誘発する目的のためのクリック単価の種類は、これらの細胞やその機構の in vitro研究用の移植の観点からします。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Culture medium</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#12440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>#SH30071</td>
			<td>3.5% (0.1% for lineage induction)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td>#25030</td>
			<td>Final concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thrombin</td>
			<td>Diagontech AG, Switzerland</td>
			<td>#100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.05 % Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T75 Flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial differentiation&#160;&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ham&#39;s F-12K (Kaighn&#39;s) Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fibronectin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#F4759</td>
			<td>Dilute in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#F1635</td>
			<td>Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#93420</td>
			<td>0.1% in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#50062Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-von Willebrand Factor antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab6994</td>
			<td>1:100 in 10% goat serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#A11010</td>
			<td>1:500 in 10% goat serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#62247</td>
			<td>1:500 in ddH2O&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SlowFade Antifade Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#S2828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BX63 widefield microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube formation</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >#352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Matrigel Growth Factor Reduced</td>
			<td >Corning</td>
			<td >#354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX50 widefield microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet.</td>
			<td >in house hospital pharmacy</td>
			<td >#9077862</td>
			<td>Working solution: 200 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#14175</td>
			<td>Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS&#160; for quenching Collagenase B activity&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#331885</td>
			<td>Prepare DMEM + 10% FBS&#160; + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES 1 M</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#15630080</td>
			<td>Final concentration 25 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >#SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RBC LysisBuffer (10X)</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >#420301/100mL</td>
			<td>Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collagenase B</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#11088807001</td>
			<td>Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#B2261</td>
			<td>Prepare 1 mg/mL in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Verapamil-hydrochloride&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#V4629</td>
			<td>Final concentration 83.3 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#551262</td>
			<td>0.25 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#557405</td>
			<td>0.6 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-Aminoactinomycin D (7-ADD)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#A1310</td>
			<td>0.15 &#181;g/106cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC rat IgG2a k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#553932</td>
			<td>0.25 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC Rat IgG2a k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554688</td>
			<td>0.6 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Material</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles 27G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>#NN-2719R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles 18G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>#NN-1838S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Use Syringes 1 mL sterile</td>
			<td>CODAN</td>
			<td>#62.1640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transferpipette 3.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#86.1171.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Strainer 40 &#181;m blue</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>#352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Strainer 100 &#181;m yellow</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lumox Dish 50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#94.6077.305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture Dishes P100</td>
			<td>Corning</td>
			<td >#353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture Dishes P60</td>
			<td>Corning</td>
			<td >#353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Line</td>
			<td>Age</td>
			<td>Breeding</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6NRj / male</td>
			<td>12 weeks</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Product Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue No.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#12440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>#SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td>#25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thrombin</td>
			<td>Diagontech AG, Switzerland&#160;</td>
			<td>#100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Product Name</td>
			<td>Medium 18</td>
			<td>Medium 2</td>
			<td>Medium 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td>Culture</td>
			<td>Lineage induction</td>
			<td>Endothelial diff.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>35%</td>
			<td>35%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>65%</td>
			<td>65%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>1%</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>3.5%</td>
			<td>&#8804;0.1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>0.2 nM</td>
			<td>0.2 nM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>1.3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>6.5 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>13 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>0.65 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of endothelial differentiation in cardiac progenitor cells under low serum conditions

心臓前駆細胞 (CPCs) 外傷後心臓再生治療の可能性があります。大人の哺乳類の心臓で本質的な単価が極端に乏しいが拡張クリック単価は細胞治療の役に立つかもしれない。使用するための前提条件は、制御された方法で定義され、効率的なプロトコルを使用して様々 な心臓系統に分化する能力です。さらに、体外の拡大、患者から分離されたクリック単価または臨床病モデル疾患のメカニズムの調査のため有益な研究ツールを提供するかもしれない。
現在の研究では、クリック単価を識別するために異なるマーカーを使用します。しかし、それらのすべてはいくつかの臨床研究の橋渡しの影響を制限する人間で表現されます。標準化された拡張と細胞療法の目的のためのクリック単価のプライミングの分離技術とマーカーの発現に関係なく適用される微分のプロトコルになります。ここで述べる低ウシ胎児血清 (FBS) 濃度と低細胞密度条件下でクリック単価のプライミング マウスおよびラットのクリック単価の 2 つの異なる集団を使用してクリック単価の内皮への分化を促進、そのラミニンはよりことを示す次のプロトコルの下でこの目的のためフィブロネクチンより適当な基板: FBS、クリック単価をにおけるラミニンのシードの率を維持するサプリメントを含む培地で 2-3 日培養後と 3.5% < 60% 合流と培養政府短期証券 (0.1%) の内皮への分化培地で分化する前に 20-24 時間低濃度サプリメント自由な媒体。クリック単価は異種集団なので血清濃度とインキュベーション時間はそれぞれクリック単価個体の特性に応じて調整する必要があります。これを考慮し技術は同様にクリック単価の他のタイプに適用できる可能性とそれぞれ疾患モデルから分離されたクリック単価を使用する場合、どのようには病気によって影響と分化のメカニズムを検討する有用な方法を提供しています。

マウスのクリック単価 SP 分離:
本研究ではラット単価から結果を変更およびアクセス許可 (図 8)33で以前のレポートから追加に対し SP 表現型によると分離されたマウスのクリック単価を使用しました。
細胞増殖の血清濃度と高、低細胞密度?...

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Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

このプロトコルでは、心臓前駆細胞の内皮への分化技術について説明します。特に、血清濃度と細胞播種密度が内皮細胞の分化に及ぼす影響について焦点を当てています。

低血清条件下で心臓前駆細胞の内皮への分化の誘導

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

増幅時の心臓前駆細胞(CPC)の分化には、増殖からコミットされた段階への相切り替えが必要であり、このプロトコルはCPCで効率的な内皮系を使用する。この技術の主な利点は、いくつかの技術に基づいて、異なる種から分離されたCPCに適用可能であるということです。このプロトコルは、細胞治療のためのCPCの治療可能性を高めるために使用することができる。また、分化の可能性とメカニズムを調べ、これらが心臓病によってどのように影響を受けるかを調べることもできます。CPCは、形状、サイズ、および効力が異なる可能性がある細胞の不均一な集団です。したがって、プロトコルは、使用するCPCの特定のサブ人口に応じて調整する必要があります。マウスを麻酔した後、70%エタノールで胸を拭き取ります。はさみを使用して、胸腔を露出させるために皮膚と胸壁を切断します。鉗子を使って心臓を持ち上げ、ハサミを使ってベースで切ります。5ミリリットルの冷たいPBSを含むP60培養皿に心臓を移し、鉗子を使って心臓をポンピングし、空洞から血液を排出する。冷たいPBSの5ミリリットルを含むP60皿に心臓を置き、それを洗います。小さなはさみを使って心房を取り除き、心臓を2つの縦方向に切り、5ミリリットルの氷冷PBSで洗います。小さいはさみを使って、心臓の部分を小さな切り分けに切ります。コラゲターゼBを含むハンクのバランスのとれた塩溶液を1ミリリットル当たり1ミリグラムの濃度で加え、滅菌カミソリブレードを使用して小さな心臓片を十分にミンチします。次に、2.5ミリリットルのコラゲターゼB溶液を皿に加えます。30度の角度で、37度のインキュベーターに置きます。インキュベーション中に10分ごとにパスツールピペットを通して繰り返しそれらを渡しながら、最大30分間インキュベートするひき肉の部分をしてみましょう。まず、2%FBSを補った冷たいHBSSを5ミリリットル加え、細かく均質化された心臓片に加えます。100マイクロメートルのフィルターを使用して、未消化の組織を除去するために心臓片をフィルター処理する。470倍Gで遠心分離機、室温で5分間。上清を捨て、5ミリリットルの赤血球のリシスバッファーでペレットを再中断します。時折揺れで5分間氷の上でインキュベートします。この後、PBSを10ミリリットル加え、40マイクロメートルのフィルターを通してサンプルをフィルターし、残留心筋細胞を含むより大きな細胞を除外します。470倍Gで遠心分離機、休憩なしで5分間室温で。その後、10%FBSを補ったDMEM中の細胞を再懸濁し、1ミリリットル当たり100万個の細胞の最終的な細胞濃度を目指す。染色と選別のために細胞を2つのチューブに分配し、1つのチューブに1.5ミリリットルの細胞溶液を加え、2番目のチューブに3.5ミリリットルを加えます。Hoechst溶液を加え、時折反転して摂氏37度で90分間インキュベートし、色素の均等な分配を確実にし、細胞の凝固を防ぎます。側の人口は、主要な人口の脇のHoechst低い左下隅に表示されます。FACSプロットでは、ベラパミルがサイドの集団を消滅させる負のコントロールに基づいて識別することができます。中程度の1〜37度を温め、遠心分離機を摂氏4度に冷やします。470倍Gで選別管を6分間摂氏4度で遠心分離します。次に、培地1で細胞を再懸濁する。培地1の4ミリリットルを含むガス透過性P60皿に細胞を移します。細胞が各フラスコに8ミリリットルの培地1を使用してT75フラスコで2〜3日間、細胞が70〜80%の培養SP-CPCの合流点に達するまで、3日ごとに培地を変更します。次に、慎重に媒体を吸引し、温かいHBSSの5ミリリットルでフラスコを穏やかにすすります。5%の二酸化炭素で摂氏37度で5分間、5ミリリットルのトリプシンEDTAで細胞を治療します。次いで、ミディアム1の5ミリリットルを加えてトリプシン活性を停止し、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移した。室温で5分間Gの470倍の遠心分離機。次に、培地1または培地2のいずれかで細胞を再中断する。P60皿に細胞をプレートし、異なる血清濃度を含む3ミリリットルの培地で1皿あたり250,000 SP-CPCをメッキします。培養の2日後、各皿から15ミリリットルのチューブに培地を集めて死んだ細胞を採取する。先に述べたように付着細胞をトリプシン化し、回収された培地を含む15ミリリットルのチューブに細胞懸濁液を集める。840倍Gで室温で5分間遠心分離機を行い、その後上清を吸引し、セルカウント用に1または2個の培地を1ミリリットル加える。SP-CPCをトリパンブルーで染色し、生存可能な細胞と死んだ細胞を数えます。まず、調製した細胞から培地を吸引し、5ミリリットルの温かいHBSSで穏やかにすすいます。5ミリリットルのトリプシンEDTAで細胞インキュベーターで5分間治療します。次に、5ミリリットルのミディアム1を加えてトリプシン活性を停止する。セル懸濁液を15ミリリットルチューブに移し、遠心分離機を470倍Gで室温で5分間移動します。上清を吸引し、セルカウント用にミディアム2を加えます。次に、シード80,000細胞を、培地2の3ミリリットルを用いた事前コーティングされた6ウェル培養プレートの各ウェルに入る。プレートを摂氏37度に20~24時間置き、各ウェルの培地をミディアム3の3ミリリットルに変更します。プレートを21日間培養し、3日ごとに培地を交換する。この後、細胞を内皮マーカーで染色し、蛍光顕微鏡を行い、分化した細胞の内皮性を検証する。まず、調製した細胞から培地を吸引し、5ミリリットルの温かいHBSSで穏やかにすすいます。細胞インキュベーターで2ミリリットルのトリプシンEDTAを5分間処理し、3ミリリットルの培地を加えてトリプシン活性を停止します。セル懸濁液を15ミリリットルチューブに移し、遠心分離機を470倍Gで室温で5分間移動します。上清を吸引し、ミディアム3の1ミリリットルを加え、軽くピペットして混ぜます。96ウェルプレートのウェルをコーティングした各マトリックスに培地3の100マイクロリットルの2,000と4,000の細胞と種子の間の細胞および種子を数える。プレートを摂氏37度で16時間インキュベートします。この後、2倍倍の明視野顕微鏡を使用して細胞の写真を撮ります。本研究では、心臓前駆細胞の内皮系統コミットメントの促進のために適切な条件が検討される。細胞の合流率が60%以下の場合、3.5%FBSで処理したサンプルに有意差は見られない。この合流の細胞を0.1%FBSで処理すると、フィブロネクチンと比較するとラミニンの細胞増殖が減少するが、細胞死の増加は示さない。対照的に、高い合流度の細胞は、2つの条件間の細胞増殖または細胞死のいずれにも有意な差を示さない。細胞形状の変化は、内皮分化が成功する適切な培養条件の指標であるように見える。内皮分化培地において7~14日以内に、異なる形態を有する大きな細胞を含む培養が成功することが分かる。興味深いことに、これらの細胞は分化段階の終わりに向かって消失し、高密度培養においてより低い数および後の時点で出現する傾向があった。チューブ形成は、低密度でめっきし、ラミニンで分化した細胞で一貫して成功していますが、高密度でメッキされた細胞ではほとんど失敗することが見られます。チューブ形成は、細胞密度に関係なくフィブロネクチン上で培養された細胞ではほとんど失敗するが、低密度で分化したものは初歩的なチューブを形成することがある。内皮系統を誘導する血清濃度と細胞密度は非常に重要であり、生存率を維持しながら増殖の減速を保証するように調整する必要があります。系統誘導の際に、ヒトまたは前臨床疾患モデルからのCPCを細胞移植研究に使用して生体内分化の可能性を評価することができる。このプロトコルは、新しい心臓再生ツールの研究や確立に役立つ可能性があり、以前は初期の系統コミットメントの分子メカニズムを研究するために使用されていました。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

胚性幹細胞から心臓前駆細胞の誘導

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

無血清単層培養中のマウス胚性幹細胞の神経分化

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

不死化多能耳の前駆細胞に分化を開始

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

胚性幹細胞や組織の心臓分化のエピジェネティック制御

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

遠心重力によって脂肪由来幹細胞の軟骨形成分化誘導

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

ひと臍帯血由来の血管内皮前駆細胞の分離

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

マウス心臓分野特異的心臓前駆細胞のインビトロ生成

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

ヒト臍帯血由来CD34+造血幹細胞および前駆細胞のパンミエロイド分化

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine ...

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

フィーダーフリーおよび化学的に定義された培養条件下でのヒト多能性幹細胞を用いた後神経節系交感神経ニューロンの効率的な分化

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...