Name: induction of endothelial differentiation in cardiac progenitor cells under low serum conditions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions at JoVE.com

Forfatterne takker Vera Lorenz for hennes nyttig støtte under forsøkene og ansatte fra funksjonen Flow cytometri fra Institutt for biomedisin (DBM), University og University Hospital Basel. Dette arbeidet ble støttet av oppholdet på sporet skal fra universitet i Basel (Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster støttes av et stipend fra det sveitsiske National Science Foundation (gi nummer 310030_156953).

Bruk mus for cellen isolasjon formål var i samsvar med veiledningen og bruk av forsøksdyr og med sveitsiske dyr beskyttelse loven og ble godkjent av den sveitsiske Cantonal myndigheter.
Merk: Isolering av Sca-1+/CD31- SP-CPC fra musen hjertet ble i hovedsak gjort som beskrevet tidligere34 med noen modifikasjoner. For materialer og anvendte reagensene, kan du se Tabellen for materiale. For alle eksperimenter, ble hjerte SP-CPC iso...

<ol>
	<li>Beltrami, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+support+myocardial+regeneration.">Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration.</a> Cell. 114 (6), 763-776 (2003).</li><li>Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+post-natal+heart+contains+a+myocardial+stem+cell+population.">The post-natal heart contains a myocardial stem cell population.</a> FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).</li><li>Sandstedt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+atrium+of+the+human+adult+heart+contains+a+population+of+side+population+cells.">Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells.</a> Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255 (2012).</li><li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+(SCIPIO):+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial.">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li><li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+(CADUCEUS):+a+prospective,+randomised+phase+1+trial.">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li><li>Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+fates+of+cardiovascular+progenitor+cells.">Origins and fates of cardiovascular progenitor cells.</a> Cell. 132 (4), 537-543 (2008).</li><li>Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocyte+progenitor+cells+differentiate+into+functional+mature+cardiomyocytes:+an+in+vitro+model+for+studying+human+cardiac+physiology+and+pathophysiology.">Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology.</a> Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).</li><li>Noseda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGFRalpha+demarcates+the+cardiogenic+clonogenic+Sca1++stem/progenitor+cell+in+adult+murine+myocardium.">PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium.</a> Nature Communications. 6, 6930 (2015).</li><li>Linke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+dog+heart+are+self-renewing,+clonogenic,+and+multipotent+and+regenerate+infarcted+myocardium,+improving+cardiac+function.">Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function.</a> Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).</li><li>El-Mounayri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+differentiation+of+functional+human+coronary-like+vascular+smooth+muscle+cells+from+embryonic+stem+cells.">Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).</li><li>Ellison, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+c-kit(pos)+cardiac+stem+cells+are+necessary+and+sufficient+for+functional+cardiac+regeneration+and+repair.">Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair.</a> Cell. 154 (4), 827-842 (2013).</li><li>Oh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cells+from+adult+myocardium:+homing,+differentiation,+and+fusion+after+infarction.">Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction.</a> Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).</li><li>Martin, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+expression+of+the+ATP-binding+cassette+transporter,+Abcg2,+identifies+cardiac+SP+cells+in+the+developing+and+adult+heart.">Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart.</a> Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).</li><li>Pfister, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD31-+but+Not+CD31++cardiac+side+population+cells+exhibit+functional+cardiomyogenic+differentiation.">CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation.</a> Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).</li><li>Pelekanos, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transcriptome+and+immunophenotype+analysis+of+renal+and+cardiac+MSC-like+populations+supports+strong+congruence+with+bone+marrow+MSC+despite+maintenance+of+distinct+identities.">Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities.</a> Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).</li><li>Laugwitz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+isl1++cardioblasts+enter+fully+differentiated+cardiomyocyte+lineages.">Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages.</a> Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).</li><li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ISL1+heart+progenitors+generate+diverse+multipotent+cardiovascular+cell+lineages.">Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages.</a> Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).</li><li>Smith, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+resident+endogenous+c-Kit++cardiac+stem+cells+from+the+adult+mouse+and+rat+heart.">Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).</li><li>Matsuura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+cardiac+Sca-1-positive+cells+differentiate+into+beating+cardiomyocytes.">Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).</li><li>Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+migration+of+Sca1+/CD31-+cardiac+side+population+cells+in+a+murine+myocardial+ischemic+model.">Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model.</a> International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).</li><li>Vicinanza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+robustly+myogenic:+c-kit+expression+is+necessary+but+not+sufficient+for+their+identification.">Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).</li><li>Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+c-kit+receptor,+stem+cell+factor,+and+mast+cells.+What+each+is+teaching+us+about+the+others.">The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others.</a> American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).</li><li>Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+c-kit+expression+in+human+endothelial+cells+by+inflammatory+stimuli.">Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli.</a> Blood. 90 (1), 148-155 (1997).</li><li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+c-kit+in+hemopoietic+progenitor+cells.">Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).</li><li>Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Sca-1+in+hematopoietic+stem/progenitor+cell+function.">Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function.</a> Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Pfister, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+ATP-binding+cassette+transporter+Abcg2+in+the+phenotype+and+function+of+cardiac+side+population+cells.">Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells.</a> Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).</li><li>Messina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem+cells+from+human+and+murine+heart.">Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart.</a> Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).</li><li>Davis, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+cardiosphere+method+to+culture+cardiac+progenitor+cells+from+myocardial+tissue.">Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue.</a> PLoS One. 4 (9), e7195 (2009).</li><li>Carr, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiosphere-derived+cells+improve+function+in+the+infarcted+rat+heart+for+at+least+16+weeks--an+MRI+study.">Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study.</a> PLoS One. 6 (10), e25669 (2011).</li><li>Martens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhesus+monkey+cardiosphere-derived+cells+for+myocardial+restoration.">Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration.</a> Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+roles+of+CD90+and+c-kit+to+the+regenerative+efficacy+of+cardiosphere-derived+cells+in+humans+and+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction.">Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260 (2014).</li><li>Mochizuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo-Like+Kinase+2+is+Dynamically+Regulated+to+Coordinate+Proliferation+and+Early+Lineage+Specification+Downstream+of+Yes-Associated+Protein+1+in+Cardiac+Progenitor+Cells.">Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).</li><li>Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+resident+cardiac+progenitor+cells+by+Hoechst+33342+staining.">Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining.</a> Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).</li><li>Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors,+matrices,+and+forces+combine+and+control+stem+cells.">Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells.</a> Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).</li><li>Plaisance, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+Lineage+Specification+in+Adult+Human+Cardiac+Precursor+Cells+Via+Modulation+of+Enhancer-Associated+Long+Noncoding+RNA+Expression.">Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression.</a> JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).</li></ol>

Fordeler med denne protokollen:
Denne protokollen gir en endothelial differensiering teknikk av CPC. Vi fant at en lav serum konsentrasjonen og lav celle tetthet kan forbedre effektiviteten av endothelial differensiering, der LN viste seg for å være en mer passende substrat enn FN under disse forholdene. Vi brukte to forskjellige typer CPC: rotte CPC, som ble brukt på en celle linje-lignende måte, og musen SP-CPC, som var isolert og utvidet. Spesielt protokollen var gjelder for begge typene a...

Nyere studier støtter eksistensen av bosatt cardiac progenitor celler (CPC) i den voksne pattedyr hjerte1,2,3og CPC kan være en nyttig kilde for cellen terapi etter hjertestans skade4, 5. I tillegg utvidet CPC kan gi en fruktbar modell for narkotikarelaterte screening og etterforskning av sykdom mekanismer når isolert fra pasienter med sjeldne cardiomyopathies eller fra respektive sykdom modeller6,7.
CPC isolert fra voksen hjertet har stammen/stamfar celle egenskaper1,2,3,8 som de er multipotent, clonogenic, og har kapasitet for selvtillit fornyelse. Men er det mange forskjellige (sub) bestander av CPC viser forskjellige overflaten markør profiler, inkludert, for eksempel c-kit, Sca-1, og andre, eller hentet av ulike isolasjon teknikker (tabell 1). Flere kultur og differensiering protokoller har vært etablert1,2,8,9,10,11,12, 13,,14,,15,,16,,17,,18. Disse protokollene varierer hovedsakelig med hensyn til vekst faktor og serum innhold, som justeres etter dyrking og som kan føre til forskjellene i resultater og resultater, inkludert differensiering effektivitet.
Indikator-baserte isolasjon teknikker:
CPC kan isoleres basert på en bestemt overflaten markør uttrykk1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Tidligere studier tyder på at c-kit og Sca-1 kan være den beste markører isolere bosatt CPC1,11,14,19,20. Fordi ingen av disse markørene er virkelig gjelder CPC, brukes vanligvis kombinasjoner av ulike markører. For eksempel, mens CPC uttrykke lave nivåer av c-kit21, er c-kit også uttrykt ved andre celletyper, inkludert mastceller22og endotelceller23blodkreft stem/stamfar celler24. Et ytterligere problem er det faktum at ikke alle markører uttrykkes på tvers av alle arter. Dette er tilfelle for Sca-1, som uttrykker i mus, men ikke i menneskelig25. Derfor kan bruker protokoller som er uavhengige av isolasjon indikatorer være fordelaktig i lys av kliniske forsøk og studier med prøver fra mennesker.
Markør-uavhengig isolasjon teknikker:
Det er flere store teknikker CPC isolasjon, som primært uavhengig av overflaten markør uttrykk, men som kan være raffinert av påfølgende valg av bestemte markør-positive subfractions etter behov (se tabell 1). (1) side befolkningen (SP) teknikk har opprinnelig vært preget i primitive innbyggere blodkreft stamceller basert på evnen til å middelklasseinnbyggere DNA fargestoff Hoechst 3334226 av ATP-bindende kassett (ABC) transportører27. CARDIAC SP celler er isolert av ulike grupper og rapportert å uttrykke en rekke indikatorer med noen mindre forskjeller mellom rapporter2,8,13,14. (2) colony-forming enhet fibroblast celler (CFU-Fs) er opprinnelig definert basert på en mesenchymal stromal celle (MSC)-som fenotypen. Isolert MSCs er kultivert retter å skape koloni. Slike colony-forming MSC-lignende CFU-Fs kan isoleres fra voksen hjertet og er i stand til å skille ut cardiac overleveringslinjer15. (3) Cardiosphere-avledet celler (CDC) er avledet fra klynger av celler vokst fra vev biopsier enkeltceller eller explants28,29,30,31. Det ble nylig vist at det meste av CD105+/CD90-/c-kit- celle brøkdel utstillinger cardiomyogenic og regenererende potensielle32.
Her gir vi bruker SP-CPC isolert fra mus, en protokoll for effektiv induksjon av endothelial avstamning basert på en tidligere studie i rotte CPC og mus SP-CPC33. Protokollen inneholder spesifikke tilpasninger til kultur og utvidelse teknikk med hensyn til celle tetthet, serum innholdet i mediet, og underlaget. Det kan brukes ikke bare mus SP-CPC, men til ulike typer CPC for formålet å indusere en skjebne bytte fra en forsterke til en endothelial forpliktet CPC, det være seg i lys av transplantasjon av disse cellene eller bruk for mekanistisk i vitro studier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Culture medium</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#12440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>#SH30071</td>
			<td>3.5% (0.1% for lineage induction)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td>#25030</td>
			<td>Final concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thrombin</td>
			<td>Diagontech AG, Switzerland</td>
			<td>#100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.05 % Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T75 Flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial differentiation&#160;&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ham&#39;s F-12K (Kaighn&#39;s) Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fibronectin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#F4759</td>
			<td>Dilute in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#F1635</td>
			<td>Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#93420</td>
			<td>0.1% in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#50062Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-von Willebrand Factor antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab6994</td>
			<td>1:100 in 10% goat serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#A11010</td>
			<td>1:500 in 10% goat serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#62247</td>
			<td>1:500 in ddH2O&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SlowFade Antifade Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#S2828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BX63 widefield microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube formation</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >#352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Matrigel Growth Factor Reduced</td>
			<td >Corning</td>
			<td >#354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX50 widefield microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet.</td>
			<td >in house hospital pharmacy</td>
			<td >#9077862</td>
			<td>Working solution: 200 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#14175</td>
			<td>Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS&#160; for quenching Collagenase B activity&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#331885</td>
			<td>Prepare DMEM + 10% FBS&#160; + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES 1 M</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#15630080</td>
			<td>Final concentration 25 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >#SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RBC LysisBuffer (10X)</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >#420301/100mL</td>
			<td>Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collagenase B</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#11088807001</td>
			<td>Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#B2261</td>
			<td>Prepare 1 mg/mL in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Verapamil-hydrochloride&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#V4629</td>
			<td>Final concentration 83.3 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#551262</td>
			<td>0.25 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#557405</td>
			<td>0.6 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-Aminoactinomycin D (7-ADD)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#A1310</td>
			<td>0.15 &#181;g/106cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC rat IgG2a k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#553932</td>
			<td>0.25 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC Rat IgG2a k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554688</td>
			<td>0.6 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Material</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles 27G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>#NN-2719R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles 18G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>#NN-1838S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Use Syringes 1 mL sterile</td>
			<td>CODAN</td>
			<td>#62.1640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transferpipette 3.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#86.1171.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Strainer 40 &#181;m blue</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>#352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Strainer 100 &#181;m yellow</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lumox Dish 50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#94.6077.305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture Dishes P100</td>
			<td>Corning</td>
			<td >#353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture Dishes P60</td>
			<td>Corning</td>
			<td >#353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Line</td>
			<td>Age</td>
			<td>Breeding</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6NRj / male</td>
			<td>12 weeks</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Product Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue No.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#12440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>#SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td>#25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thrombin</td>
			<td>Diagontech AG, Switzerland&#160;</td>
			<td>#100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Product Name</td>
			<td>Medium 18</td>
			<td>Medium 2</td>
			<td>Medium 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td>Culture</td>
			<td>Lineage induction</td>
			<td>Endothelial diff.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>35%</td>
			<td>35%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>65%</td>
			<td>65%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>1%</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>3.5%</td>
			<td>&#8804;0.1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>0.2 nM</td>
			<td>0.2 nM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>1.3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>6.5 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>13 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>0.65 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of endothelial differentiation in cardiac progenitor cells under low serum conditions

CARDIAC progenitor celler (CPC) kan ha terapeutisk potensial for cardiac regenerasjon etter skade. I voksen pattedyr hjertet, iboende CPC er svært knappe, men utvidet CPC kan være nyttig for cellen terapi. En forutsetning for deres bruk er deres evne til å skille på en kontrollert måte i de forskjellige cardiac linjene bruker definerte og effektiv protokoller. I tillegg i vitro ekspansjon, CPC isolert fra pasienter eller prekliniske sykdom modeller kan tilby fruktbart forskningsverktøy for etterforskningen av sykdom mekanismer.
Aktuelle studier bruker forskjellige markører for å identifisere CPC. Men er ikke alle av dem uttrykt i mennesker, som begrenser translasjonsforskning virkningen av noen prekliniske studier. Differensiering protokoller som gjelder uansett isolasjon teknikk og markør uttrykket vil tillate standardisert ekspansjon og fylling av CPC for cellen terapi formål. Her beskriver vi at fylling av CPC under en lav fosterets bovin serum (FBS) konsentrasjon og lav celle tetthet forhold forenkler endothelial differensiering av CPC. bruke to forskjellige subpopulasjoner av mus og rotten CPC, viser vi at laminin er en mer egnet substrat enn fibronectin for dette formålet under følgende protokollen: etter dyrking for 2-3 dager i medium inkludert kosttilskudd som opprettholde multipotency og med 3,5% FBS, CPC er seeded på laminin på < 60% samløpet og kultivert i supplement-fri medium med lave konsentrasjoner av FBS (0,1%) for 20-24 timer før differensiering i endothelial differensiering medium. Fordi CPC er en heterogen befolkning, må serum konsentrasjonen og inkubasjon ganger justeres avhengig av egenskapene til de respektive CPC-subpopulasjon. Vurderer dette, teknikken kan brukes på andre typer CPC samt og gir en nyttig metode for å undersøke muligheter og mekanismer for differensiering og hvordan de påvirkes av sykdom ved CPC isolert fra respektive sykdom modeller.

Musen SP-CPC isolasjon:
I denne studien brukte vi musen CPC isolert ifølge SP fenotypen, mens resultater fra rotte CPC er endret og lagt til fra en tidligere rapport med tillatelse (Figur 8)33.
Celle spredning Under høye og lave celle tettheter og med forskjellige Serum konsentrasjonen:
<p class="jove_content" fo:ke...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions at JoVE.com

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Denne protokollen beskriver en endothelial differensiering teknikk for cardiac progenitor celler. Det fokuserer spesielt på hvordan serum konsentrasjonen og celle-såing tetthet påvirker potensial endothelial differensiering.

Induksjon av Endothelial differensiering i Cardiac Progenitor celler Under lav Serum forhold

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

Differensiering av hjertestamceller, eller CPC-er, ved forsterkning krever en fasebryter fra en spredning til et forpliktende stadium, og denne protokollen bruker effektiv endotellinje i CPC-er. En stor fordel med teknikken er at den gjelder for CPC isolert basert på flere teknikker og fra forskjellige arter. Denne protokollen kan brukes til å forbedre de terapeutiske potensialet til CPC for celleterapi.Det kan også brukes til å undersøke potensialer og mekanismer for differensiering og hvordan disse påvirkes av hjertesykdom. CPC er en inhomogen populasjon av celler som kan variere i form, størrelse og styrke. Derfor må protokollen justeres i henhold til den spesifikke underpopulasjonen av CPC-er som brukes.Etter å ha bedøvet musen, tørk ned brystet med 70% etanol. Bruk saks, kutt huden og thoraxveggen for å eksponere thoraxhulen. Bruk tang til å løfte hjertet, og bruk deretter saks til å kutte den ved basen.Overfør hjertet til en P60 kulturrett som inneholder fem milliliter kald PBS, og bruk deretter tang til å pumpe hjertet og kaste ut blodet ut av hulrommene. Legg hjertet i en P60-tallerken som inneholder fem milliliter kald PBS og vask det. Bruk liten saks for å fjerne atria, kutte hjertet i to langsgående stykker, og vaske dem i fem milliliter iskald PBS.Bruk små sakser, kutt hjertebitene i mindre seksjoner. Tilsett en dråpe av en Hanks balanserte saltoppløsning som inneholder kollagenase B med en konsentrasjon på ett mg per milliliter, og bruk et sterilt barberblad for å hakke de små hjertebitene grundig. Deretter legger du til 2,5 milliliter av kollagenase B-løsningen til parabolen.Plasser parabolen i en 30 graders vinkel i en inkubator ved 37 grader Celsius. La de hakkede hjertebitene inkubere i maksimalt 30 minutter mens du gjentatte ganger passerer dem gjennom en Pasteur pipette hvert 10. Først legger du til fem milliliter kald HBSS supplert med 2% FBS til de hakkede og homogeniserte hjertebitene.Bruk et 100 mikrometerfilter til å filtrere hjertebitene for å fjerne ufordøyd vev. Sentrifuge ved 470 ganger G og ved romtemperatur i fem minutter. Kast supernatant og re-suspendere pellet i fem milliliter av røde blodlegemer lysis buffer.Inkuber på is i fem minutter med sporadisk risting. Etter dette legger du til 10 milliliter PBS og filtrerer prøven gjennom et 40 mikrometerfilter for å utelukke større celler, inkludert gjenværende kardiomyocytter. Sentrifuge ved 470 ganger G og ved romtemperatur i fem minutter uten pause.Deretter, re-suspendere cellene i DMEM supplert med 10% FBS, med sikte på en endelig cellekonsentrasjon av en million celler per milliliter. Fordel cellene i to rør for farging og sortering, og tilsett 1,5 milliliter celleløsning til ett rør og 3,5 milliliter til det andre røret. Tilsett Hoechst-løsning og inkuber ved 37 grader Celsius i 90 minutter med sporadisk flipping for å sikre lik for fordel av fargestoffet og forhindre koagulering av cellene.Sidebefolkningen vises ved Hoechst lav nedre venstre hjørne til side av hovedbefolkningen. I FACS-plottet kan det identifiseres basert på den negative kontrollen der verapamil ber sidepopulasjonen om å forsvinne. Varm opp medium en til 37 grader Celsius og kjøle ned sentrifuge til fire grader Celsius.Sentrifuger sorteringsrørene ved 470 ganger G og ved fire grader Celsius i seks minutter. Deretter, re-suspendere cellene i medium en. Overfør cellene til en gassgjennomtrengelig P60-tallerken som inneholder fire milliliter medium en.Endre mediet hver tredje dag til cellene har nådd en samløpet mellom 70 og 80% Kultur SP-CPC i to til tre dager i T75 flasker ved hjelp av åtte milliliter medium en i hver kolbe. Deretter aspirerer du forsiktig mediet og skyll forsiktig flasken med fem milliliter varm HBSS. Behandle cellene med fem milliliter trypsin EDTA i fem minutter ved 37 grader Celsius med 5%karbondioksid.Deretter legger du til fem milliliter medium en for å stoppe trypsinaktiviteten, og overføre cellesuspensjonen til et 15 milliliter rør. Sentrifuge ved 470 ganger G i fem minutter ved romtemperatur. Deretter suspenderer cellene på nytt i enten middels en eller middels to.Plate cellene på P60 retter, plating 250, 000 SP-CPCs per tallerken med tre milliliter medium som inneholder forskjellige serumkonsentrasjoner. Etter to dager med kultering, samle mediet fra hver tallerken i et 15 milliliter rør for å samle de døde cellene. Prøv åpsinisere de vederslende cellene som tidligere beskrevet og samle cellesuspensjonen i det 15 milliliter røret som inneholder det innsamlede mediet.Sentrifuge ved 840 ganger G i fem minutter ved romtemperatur, deretter aspirerer supernatanten og tilsett en milliliter med enten middels en eller middels to for celletelling. Beis SP-CPCene med trypan blå og telle levedyktige og døde celler. Først aspirerer mediet fra de tilberedte cellene, og skyll dem forsiktig med fem milliliter varm HBSS.Behandle cellene med fem milliliter trypsin EDTA i fem minutter i celleinkubatoren. Deretter legger du til fem milliliter medium en for å stoppe trypsinaktiviteten. Overfør cellefjæringen til et 15 milliliter rør og sentrifuge ved 470 ganger G i fem minutter ved romtemperatur.Aspirer det overnaturante og legg til medium to for celletelling. Deretter frø 80, 000 celler i hver brønn av en pre-belagt seks-brønns kultur plate med tre milliliter av middels to. Hold platen på 37 grader Celsius i 20 til 24 timer, og endre deretter mediet i hver brønn til tre milliliter med middels tre.Kultur platen i 21 dager, endre mediet hver tredje dag. Etter dette, beise cellene med en endotelmarkør og utføre fluorescens mikroskopi for å verifisere endotelnaturen til de differensierte cellene. Først aspirerer mediet fra de tilberedte cellene og skyll dem forsiktig med fem milliliter varm HBSS.Behandle cellene med to milliliter trypsin EDTA i fem minutter i celleinkubatoren, og legg deretter til tre milliliter med middels tre for å stoppe trypsinaktiviteten. Overfør cellefjæringen til et 15 milliliter rør og sentrifuge ved 470 ganger G i fem minutter ved romtemperatur. Aspirer det overnaturlige og tilsett en milliliter medium tre, pipettering forsiktig for å blande.Telle celler og frø mellom 2, 000 og 4000 celler i 100 mikroliter av middels tre til hver matrise belagt godt av en 96-brønn plate. Inkuber platen ved 37 grader Celsius i 16 timer. Etter dette bruker du et lysfeltmikroskop ved to ganger forstørrelse for å ta et bilde av cellene.I denne studien undersøkes egnede forhold for tilrettelegging av endotellinjeforpliktelse av hjertestamceller. Når cellekonfluensen er på eller under 60%, er det ikke sett noen signifikant forskjell i prøvene behandlet med 3,5%FBS. Når celler ved denne samløpet behandles med 0,1% FBS, viser de en reduksjon i cellespredning på laminin sammenlignet med fibronectin, men viser ingen økning i celledød.I motsetning viser celler ved høy samløpet ingen signifikant forskjell i enten cellespredning eller celledød mellom de to forholdene. Endringer i celleform ser ut til å være en indikator på egnede kulturforhold der endoteldilatering kommer til å lykkes. Innen syv til 14 dager i endoteldilateringsmediet, er vellykkede kulturer sett på som inneholder større celler med forskjellig morfologi.Interessant, disse cellene forsvant mot slutten av differensieringsfasen og hadde en tendens til å vises i lavere tall og senere tidspunkter i høy tetthet kulturer. Rørdannelse er konsekvent vellykket i celler belagt med lav tetthet og differensiert på laminin, mens det er sett å for det meste mislykkes i celler belagt med høy tetthet. Mens rørdannelse er for det meste mislykket i celler dyrket på fibronectin uavhengig av celletetthet, de differensiert på en lav tetthet noen ganger danner rudimentære rør.Serumkonsentrasjonen og celletettheten for å indusere endotellinje er avgjørende, og de må justeres for å garantere at spredningen bremses samtidig som levedyktigheten opprettholdes. Ved induksjon av avstamning kan CPC-er fra mennesker eller prekliniske sykdomsmodeller brukes til celletransplantasjonsstudier for å vurdere deres in vivo differensieringspotensial. Denne protokollen kan bidra til å studere eller etablere nye hjerteregenereringsverktøy, og den ble tidligere brukt til å studere molekylær mekanisme for tidlig avstamningsforpliktelse.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Avledning av Cardiac stamceller fra embryonale stamceller

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Direkte Induction of Human Neural stamceller fra perifert blod Hematopoietiske stamceller

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Neural Differensiering av mus embryonale stamceller i Serum-free enlagskultur

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Initiere Differensiering i udødeligmultipotente Otic stamceller

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetisk regulering av Cardiac Differensiering av embryonale stamceller og vev

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Chondrogenic Differensiering Induksjon av adipose-avledet stamceller ved Sentrifugal Gravity

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Isolering av endoteliale Progenitor celler fra menneskelige navlestrengsblod

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

In vitro generasjon av mus hjerte Field-spesifikke CARDIAC stamceller

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Pan-myelogen differensiering av Human Cord blod avledet CD34+ blodkreft stem og stamceller

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine ...

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

Effektiv differensiering av postganglioniske sympatiske nevroner ved hjelp av humane pluripotente stamceller under materfrie og kjemisk definerte kulturforhold

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...