Name: induction of endothelial differentiation in cardiac progenitor cells under low serum conditions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Los autores agradecen a Vera Lorenz por su apoyo a útil durante los experimentos y el personal de la instalación de citometría de flujo del Departamento de Biomedicina (DBM), Universidad y Universidad Hospital de Basilea. Este trabajo fue apoyado por el estancia en pista programa de la Universidad de Basilea (Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster es apoyado por una beca de la Swiss National Science Foundation (grant número 310030_156953).

El uso de ratones para propósito de aislamiento celular estaba de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y con la ley de protección Animal Suiza y fue aprobado por las autoridades cantonales suizas.
Nota: El aislamiento de Sca-1+/CD31– SP-CPC desde el corazón de ratón se hizo esencialmente descrita34 con algunas modificaciones. Para los materiales y reactivos utilizados, véase Tabla de materiales</stron...

<ol>
	<li>Beltrami, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+support+myocardial+regeneration.">Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration.</a> Cell. 114 (6), 763-776 (2003).</li><li>Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+(CADUCEUS):+a+prospective,+randomised+phase+1+trial.">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li><li>Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+fates+of+cardiovascular+progenitor+cells.">Origins and fates of cardiovascular progenitor cells.</a> Cell. 132 (4), 537-543 (2008).</li><li>Smits, A. 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What each is teaching us about the others.</a> American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).</li><li>Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+c-kit+expression+in+human+endothelial+cells+by+inflammatory+stimuli.">Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli.</a> Blood. 90 (1), 148-155 (1997).</li><li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+c-kit+in+hemopoietic+progenitor+cells.">Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).</li><li>Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+cardiosphere+method+to+culture+cardiac+progenitor+cells+from+myocardial+tissue.">Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue.</a> PLoS One. 4 (9), e7195 (2009).</li><li>Carr, C. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors,+matrices,+and+forces+combine+and+control+stem+cells.">Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells.</a> Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).</li><li>Plaisance, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+Lineage+Specification+in+Adult+Human+Cardiac+Precursor+Cells+Via+Modulation+of+Enhancer-Associated+Long+Noncoding+RNA+Expression.">Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression.</a> JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).</li></ol>

Ventajas de este protocolo:
Este protocolo proporciona una técnica de diferenciación endotelial del CPCs. Hemos encontrado que una concentración baja del suero y densidad celular baja podrían mejorar la eficiencia de diferenciación endotelial, por el que LN demostró para ser un sustrato más adecuado que el FN en estas condiciones. Utilizamos dos tipos distintos de CPC: rata CPCs, que fueron utilizadas en una línea como forma de la célula y el ratón SP-CPC, que fueron aislados y ampliado...

Estudios recientes apoyan la existencia de las células progenitoras cardíacas residentes (CPC) en el corazón mamífero adulto1,2,3, y CPC podría ser una fuente útil para la terapia de la célula después de lesión cardíaca4, 5. Además, CPCs ampliados pueden proporcionar un modelo fructuoso para la detección de drogas y la investigación de los mecanismos de la enfermedad cuando están aisladas de pacientes con cardiomiopatías raros, o de enfermedad respectiva modelos6,7.
CPCs aislados del corazón adulto poseen/progenitoras celulares características1,2,3,8 como son multipotentes, clonogenic, y tienen la capacidad de auto renovación. Sin embargo, hay muchas poblaciones diferentes (sub) de CPCs exhibir perfiles de diferentes marcadores de superficie, incluyendo, por ejemplo, c-kit, Sca-1 y otros, u obtenido por técnicas de aislamiento diferentes (tabla 1). Varios protocolos de diferenciación y cultura han sido establecidos1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Estos protocolos varían sobre todo con respecto al factor de crecimiento y contenido de suero, que se ajustan según el propósito del cultivo y que pueden conducir a diferencias en los resultados y los resultados, incluyendo la eficiencia de la diferenciación.
Técnicas de aislamiento basadas en marcadores:
CPC puede ser aislado basado en un marcador de superficie específico expresión1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Estudios previos sugieren que c-kit y Sca-1 son los mejores marcadores para aislar residente CPC1,11,14,19,20. Porque ninguno de estos marcadores es realmente específico para CPC, generalmente se aplican combinaciones de marcadores diferentes. Por ejemplo, mientras que los CPCs expresan bajos niveles de c-kit21, c-kit se expresa también por otros tipos celulares, incluyendo células de mástil22, células endoteliales23y de células progenitoras hematopoyéticas24. Un problema adicional es el hecho de que no todos los marcadores se expresan a través de todas las especies. Este es el caso de Sca-1, que expresa en ratón pero no en humanos25. Por lo tanto, utilizando protocolos que son independientes de los marcadores de aislamiento puede ser ventajoso a la vista de los ensayos clínicos y estudios con muestras humanas.
Técnicas de aislamiento independiente del marcador:
Existen varias técnicas importantes de aislamiento de la CPC, que son sobre todo independientes de la expresión superficial del marcador, pero que se puede refinar la selección consecutivos de subfracciones de marcador positivo específicos según sea necesario (ver también tabla 1). (1) la técnica de la población (SP) de lado originalmente se ha caracterizado en una población primitiva de las células madre hematopoyéticas, basado en la capacidad de emanación el tinte DNA Hoechst 3334226 de ATP-binding cassette (ABC) transportadores27. Células cardíacas de SP han sido aisladas por los distintos grupos y registrados para expresar una variedad de marcadores con algunas diferencias menores entre informes2,8,13,14. (2) células unidad formación de colonias de fibroblastos (CFU-Fs) originalmente se han definido en base a una células mesenquimales estromales (MSC)-como fenotipo. MSCs aislados se cultivan en los platos para inducir la formación de la Colonia. Formadoras de colonias MSC-como CFU-Fs puede ser aislado del corazón adulto y son capaces de diferenciarse en linajes cardíaca15. (3) Cardiosphere-las células derivadas de (enfermedades CDC) son las células derivadas de racimos de células de biopsias de tejido o explantes28,29,30,31. Recientemente fue demostrado que sobre todo la CD105+/CD90 /c-kit– –fracción de la célula exhibe cardiomiogenético y potencial regenerativo32.
Con SP-CPC aislado de ratones, presentamos un protocolo para la inducción eficiente de linaje endotelial basado en un estudio previo en el CPCs de rata y ratón CPCs SP33. El protocolo contiene adaptaciones específicas a la cultura y la técnica de expansión con respecto a la densidad celular, el contenido de suero del medio y el sustrato. Se puede aplicar no sólo a ratón SP-CPC pero distintos tipos de CPC para el propósito de inducir un cambio de destino de una amplificación a un CPC endoteliales comprometido, ya sea ante el trasplante de estas células o su uso para estudios mecanísticos en vitro .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Culture medium</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#12440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>#SH30071</td>
			<td>3.5% (0.1% for lineage induction)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td>#25030</td>
			<td>Final concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thrombin</td>
			<td>Diagontech AG, Switzerland</td>
			<td>#100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.05 % Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T75 Flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial differentiation&#160;&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ham&#39;s F-12K (Kaighn&#39;s) Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fibronectin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#F4759</td>
			<td>Dilute in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#F1635</td>
			<td>Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#93420</td>
			<td>0.1% in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#50062Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-von Willebrand Factor antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab6994</td>
			<td>1:100 in 10% goat serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#A11010</td>
			<td>1:500 in 10% goat serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#62247</td>
			<td>1:500 in ddH2O&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SlowFade Antifade Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#S2828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BX63 widefield microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube formation</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >#352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Matrigel Growth Factor Reduced</td>
			<td >Corning</td>
			<td >#354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX50 widefield microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet.</td>
			<td >in house hospital pharmacy</td>
			<td >#9077862</td>
			<td>Working solution: 200 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#14175</td>
			<td>Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS&#160; for quenching Collagenase B activity&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#331885</td>
			<td>Prepare DMEM + 10% FBS&#160; + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES 1 M</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#15630080</td>
			<td>Final concentration 25 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >#SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RBC LysisBuffer (10X)</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >#420301/100mL</td>
			<td>Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collagenase B</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#11088807001</td>
			<td>Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#B2261</td>
			<td>Prepare 1 mg/mL in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Verapamil-hydrochloride&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#V4629</td>
			<td>Final concentration 83.3 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#551262</td>
			<td>0.25 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#557405</td>
			<td>0.6 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-Aminoactinomycin D (7-ADD)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#A1310</td>
			<td>0.15 &#181;g/106cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC rat IgG2a k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#553932</td>
			<td>0.25 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC Rat IgG2a k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554688</td>
			<td>0.6 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Material</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles 27G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>#NN-2719R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles 18G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>#NN-1838S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Use Syringes 1 mL sterile</td>
			<td>CODAN</td>
			<td>#62.1640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transferpipette 3.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#86.1171.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Strainer 40 &#181;m blue</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>#352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Strainer 100 &#181;m yellow</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lumox Dish 50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#94.6077.305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture Dishes P100</td>
			<td>Corning</td>
			<td >#353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture Dishes P60</td>
			<td>Corning</td>
			<td >#353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Line</td>
			<td>Age</td>
			<td>Breeding</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6NRj / male</td>
			<td>12 weeks</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Product Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue No.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#12440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>#SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td>#25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thrombin</td>
			<td>Diagontech AG, Switzerland&#160;</td>
			<td>#100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Product Name</td>
			<td>Medium 18</td>
			<td>Medium 2</td>
			<td>Medium 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td>Culture</td>
			<td>Lineage induction</td>
			<td>Endothelial diff.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>35%</td>
			<td>35%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>65%</td>
			<td>65%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>1%</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>3.5%</td>
			<td>&#8804;0.1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>0.2 nM</td>
			<td>0.2 nM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>1.3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>6.5 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>13 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>0.65 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of endothelial differentiation in cardiac progenitor cells under low serum conditions

Las células progenitoras cardíacas (CPCs) pueden tener potencial terapéutico para la regeneración cardiaca después de la lesión. En el corazón mamífero adultos, CPCs intrínsecos son muy escasos, pero CPCs ampliadas podrían ser útiles para la terapia celular. Un requisito previo para su uso es su capacidad para distinguir de forma controlada en los diferentes linajes cardiacos utilizando protocolos definidos y eficientes. Además, en vitro expansión, CPCs aislaron de pacientes o modelos preclínicos de la enfermedad pueden ofrecer herramientas de investigación fructífero para la investigación de los mecanismos de la enfermedad.
Los estudios actuales utilizan diferentes marcadores para identificar CPCs. Sin embargo, no todos se expresan en los seres humanos, que limita el impacto traslacional de algunos estudios preclínicos. Protocolos de diferenciación que son aplicables independientemente de la expresión de la técnica y el marcador de aislamiento permitirá la expansión estandarizada y cebado de CPCs para propósito de la terapia celular. Aquí describimos que el cebado de CPC bajo condiciones de densidad celular baja y una concentración baja del suero bovino fetal (FBS) facilita la diferenciación endotelial de CPCs. utilizando dos subpoblaciones diferentes de ratón y rata CPCs, demostramos que eso laminin es más sustrato adecuado de fibronectina para este propósito bajo el siguiente protocolo: después de cultivo de 2-3 días en medio incluyendo suplementos que mantienen multipotencia y con 3.5% FBS, CPCs son sembradas en laminina en < 60% confluencia y cultivadas en medio sin suplemento con bajas concentraciones de FBS (0.1%) durante 20-24 horas antes de la diferenciación en medio de la diferenciación endotelial. Porque CPCs son una población heterogénea, las concentraciones séricas y tiempos de incubación deba ajustarse dependiendo de las propiedades de la subpoblación de CPC respectiva. Teniendo en cuenta esto, la técnica puede aplicarse a otros tipos de CPC así y proporciona un método útil para investigar el potencial y los mecanismos de diferenciación y cómo se ven afectados por la enfermedad al utilizar CPCs de modelos de la enfermedad respectiva.

Aislamiento de SP-CPC del ratón:
En este estudio, utilizamos el CPC de ratón aislado según el fenotipo de SP, mientras que resultados de rata CPCs son modificados y añadidos de un anterior informe con permiso (figura 8)33.
Proliferación celular en celulares alta y baja densidad y con concentraciones distintas de suer...

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Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Este protocolo describe una técnica de diferenciación endotelial de las células progenitoras cardíacas. Se centra especialmente en cómo la concentración del suero y la densidad de siembra de células afectan el potencial de diferenciación endotelial.

Inducción de la diferenciación endotelial en las células cardiacas progenitoras en suero bajo condiciones

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

La diferenciación de las células progenitoras cardíacas, o CPC, tras la amplificación requiere un cambio de fase de una etapa de proliferación a una etapa comprometida, y este protocolo utiliza un linaje endotelial eficiente en las CPC. Una de las principales ventajas de la técnica es que es aplicable a las CPC aisladas en base a varias técnicas y de diferentes especies. Este protocolo se puede utilizar para mejorar los potenciales terapéuticos de las CPC para la terapia celular.También se puede utilizar para investigar los potenciales y mecanismos de diferenciación y cómo estos se ven afectados por la enfermedad cardíaca. Las CPC son una población inhomogénea de células que pueden diferir en forma, tamaño y potencia. Por lo tanto, el protocolo debe ajustarse de acuerdo con la subpoblación específica de los CPC utilizados.Después de anestesiar al ratón, limpie su pecho con 70% de etanol. Usando tijeras, corte la piel y la pared torácica para exponer la cavidad torácica. Use fórceps para levantar el corazón, y luego use tijeras para cortarlo en la base.Transfiera el corazón a un plato de cultivo P60 que contenga cinco mililitros de PBS frío, y luego use fórceps para bombear el corazón y expulsar la sangre de las cavidades. Coloque el corazón en un plato P60 que contenga cinco mililitros de PBS frío y lávelo. Usa tijeras pequeñas para quitar las aurículas, corta el corazón en dos trozos longitudinales y lávalos en cinco mililitros de PBS helado.Usando tijeras pequeñas, corta las piezas del corazón en secciones más pequeñas. Añade una gota de la solución de sal equilibrada de Hank que contenga colagenasa B a una concentración de un miligramo por mililitro, y usa una cuchilla de afeitar estéril para picar bien las pequeñas piezas del corazón. A continuación, añadir 2,5 mililitros de la solución de colagenasa B al plato.Coloque el plato en un ángulo de 30 grados en una incubadora a 37 grados centígrados. Dejar incubar las piezas del corazón picadas durante un máximo de 30 minutos mientras se pasan repetidamente a través de una pipeta Pasteur cada 10 minutos durante la incubación. En primer lugar, añadir cinco mililitros de HBSS frío complementado con 2%FBS a las piezas del corazón picadas y homogeneizadas.Con un filtro de 100 micrómetros, filtre las piezas del corazón para eliminar cualquier tejido no digerido. Centrifugar a 470 veces G y a temperatura ambiente durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de tóniculo de glóbulos rojos.Incubar sobre hielo durante cinco minutos con temblores ocasionales. Después de esto, agregue 10 mililitros de PBS y filtre la muestra a través de un filtro de 40 micrómetros para excluir las células más grandes, incluidos los cardiomiocitos residuales. Centrifugar a 470 veces G y a temperatura ambiente durante cinco minutos sin rotura.Luego, re-suspende las células en DMEM complementadas con 10%FBS, con el objetivo de una concentración celular final de un millón de células por mililitro. Distribuya las células en dos tubos para la tinción y clasificación, añadiendo 1,5 mililitros de la solución celular a un tubo y 3,5 mililitros al segundo tubo. Añadir la solución de Hoechst e incubar a 37 grados Centígrados durante 90 minutos con volteo ocasional para asegurar la distribución equitativa del tinte y evitar la coagulación de las células.La población lateral aparece en la esquina inferior izquierda de Hoechst, aparte de la población principal. En la gráfica FACS se puede identificar en función del control negativo en el que el verapamilo provoca la desaparición de la población lateral. Calienta el medio a 37 grados centígrados y enfría la centrífuga a cuatro grados centígrados.Centrifugar los tubos de clasificación a 470 veces G y a cuatro grados centígrados durante seis minutos. Luego, vuelva a suspender las celdas en el medio uno. Transfiera las células a un plato P60 permeable al gas que contenga cuatro mililitros de uno mediano.Cambie el medio cada tres días hasta que las células hayan alcanzado una confluencia entre 70 y 80%S-CPC de cultivo durante dos o tres días en matraces T75 utilizando ocho mililitros de uno medio en cada matraz. A continuación, aspirar cuidadosamente el medio y enjuagar suavemente el matraz con cinco mililitros de HBSS caliente. Tratar las células con cinco mililitros de trippsina EDTA durante cinco minutos a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.Luego, agregue cinco mililitros de uno mediano para detener la actividad de la trippsina, y transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros. Centrifugar a 470 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, vuelva a suspender las celdas en uno o dos medios medios.Plato de las células en platos P60, chapando 250, 000 SP-CPC por plato con tres mililitros de medio que contienen diferentes concentraciones séricas. Después de dos días de cultivo, recoger el medio de cada plato en un tubo de 15 mililitros para recoger las células muertas. Pruebe las células adherentes como se describió anteriormente y recoja la suspensión celular en el tubo de 15 mililitros que contiene el medio recogido.Centrifugar a 840 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente, luego aspirar el sobrenadante y añadir un mililitro de uno o medio dos para el conteo celular. Manchar los SP-CPC con tríptica azul y contar las células viables y muertas. Primero, aspirar el medio de las células preparadas y enjuáguelas suavemente con cinco mililitros de HBSS caliente.Tratar las células con cinco mililitros de trippsina EDTA durante cinco minutos en la incubadora celular. A continuación, agregue cinco mililitros de uno mediano para detener la actividad de la trippsina. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros y centrifugar a 470 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente.Aspirar el sobrenadante y añadir dos medios para el conteo celular. A continuación, sembrar 80.000 células en cada pozo de una placa de cultivo pre-recubierta de seis pozos con tres mililitros de dos medianos. Mantenga la placa a 37 grados centígrados durante 20 a 24 horas, y luego cambie el medio en cada pozo a tres mililitros de tres medianos.Cultivo de la placa durante 21 días, cambiando el medio cada tres días. Después de esto, manchar las células con un marcador endotelial y realizar microscopía de fluorescencia para verificar la naturaleza endotelial de las células diferenciadas. Primero, aspirar el medio de las células preparadas y enjuáguelas suavemente con cinco mililitros de HBSS caliente.Tratar las células con dos mililitros de trippsina EDTA durante cinco minutos en la incubadora celular, luego añadir tres mililitros de tres medianos para detener la actividad de la trippsina. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros y centrifugar a 470 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y añadir un mililitro de tres medianos, pipeteando suavemente para mezclar.Cuente las células y las semillas entre 2.000 y 4.000 células en 100 microlitros de tres medianos a cada matriz recubierta bien de una placa de 96 pozos. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante 16 horas. Después de esto, utilice un microscopio de campo brillante a dos veces más ampliación para tomar una foto de las células.En este estudio, se exploran condiciones adecuadas para facilitar el compromiso de linaje endotelial de las células progenitoras cardíacas. Cuando la confluencia celular es igual o inferior al 60%, no se observa ninguna diferencia significativa en las muestras tratadas con 3,5%FBS. Cuando las células de esta confluencia se tratan con 0,1%FBS, muestran una disminución en la proliferación celular en la laminin en comparación con la fibronectina, pero no muestran aumento en la muerte celular.Por el contrario, las células con una alta confluencia no muestran ninguna diferencia significativa en la proliferación celular o la muerte celular entre las dos condiciones. Los cambios en la forma celular parecen ser un indicador de las condiciones adecuadas de cultivo en las que la diferenciación endotelial va a tener éxito. Dentro de siete a 14 días en el medio de diferenciación endotelial, se considera que los cultivos exitosos contienen células más grandes con diferente morfología.Curiosamente, estas células desaparecieron hacia el final de la fase de diferenciación y tendieron a aparecer en números más bajos y en momentos posteriores en cultivos de alta densidad. La formación de tubos es consistentemente exitosa en células chapadas a baja densidad y diferenciadas en laminin, mientras que se considera que falla principalmente en células chapadas a alta densidad. Mientras que la formación de tubos es mayormente infructuosa en células cultivadas en fibronectina independientemente de la densidad celular, las diferenciadas a baja densidad a veces forman tubos rudimentarios.La concentración sérica y la densidad celular para inducir el linaje endotelial son cruciales, y deben ajustarse para garantizar la ralentización de la proliferación manteniendo la viabilidad. Tras la inducción del linaje, las CPC de los seres humanos o los modelos de enfermedades preclínicos se pueden utilizar para estudios de trasplante celular para evaluar su potencial de diferenciación in vivo. Este protocolo podría ayudar a estudiar o establecer nuevas herramientas de regeneración cardíaca, y anteriormente se utilizó para estudiar el mecanismo molecular del compromiso de linaje temprano.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Derivación de células cardiacas progenitoras a partir de células madre embrionarias

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Diferenciación neural de células madre embrionarias de ratón en el suero libre de monocapa Cultura

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Iniciando Diferenciación en inmortalizadas células pluripotentes Otic Progenitoras

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

La regulación epigenética de Cardíaca diferenciación de células madre embrionarias y Tejidos

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

La diferenciación condrogénica de inducción de las células madre derivadas de tejido adiposo por la gravedad centrífuga

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Aislamiento de células endoteliales progenitoras de la sangre de cordón Umbilical humano

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

In Vitro Generación de Células Progenitoras Cardíacas específicas de Mouse Field

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Diferenciación panmieloide de la sangre de cordón humano derivada CD34+ Células hematopoyéticas del tallo y progenitor

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine ...

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

Diferenciación eficiente de las neuronas simpáticas postgangliónicas utilizando células madre pluripotentes humanas bajo condiciones de cultivo sin alimentador y definidas químicamente

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...