Name: induction of endothelial differentiation in cardiac progenitor cells under low serum conditions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions at JoVE.com

Författarna tackar Vera Lorenz för hennes bra stöd under experimenten och personalen från Flow flödescytometri anläggningen från Institutionen för biomedicin (DBM), universitet och Universitetssjukhuset Basel. Detta arbete stöds av vistelse-on track programmet från universitetet i Basel (till Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster stöds av ett bidrag från schweiziska National Science Foundation (grant nummer 310030_156953).

Användning av möss för cell isolering syfte var enligt guiden för vård och använda av försöksdjur och med schweiziska djur skydd lagen och godkändes av de schweiziska kantonala myndigheterna.
Obs: Isolering av Sca-1+/CD31– SP-systemet från mus hjärtat skedde i huvudsak som tidigare beskrivits34 med några ändringar. Material och reagens som används, se Tabell för material. För alla experiment, var hjärt SP-CPC iso...

<ol>
	<li>Beltrami, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+support+myocardial+regeneration.">Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration.</a> Cell. 114 (6), 763-776 (2003).</li><li>Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+post-natal+heart+contains+a+myocardial+stem+cell+population.">The post-natal heart contains a myocardial stem cell population.</a> FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).</li><li>Sandstedt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+atrium+of+the+human+adult+heart+contains+a+population+of+side+population+cells.">Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells.</a> Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255 (2012).</li><li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+(SCIPIO):+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial.">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li><li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+(CADUCEUS):+a+prospective,+randomised+phase+1+trial.">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li><li>Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+fates+of+cardiovascular+progenitor+cells.">Origins and fates of cardiovascular progenitor cells.</a> Cell. 132 (4), 537-543 (2008).</li><li>Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocyte+progenitor+cells+differentiate+into+functional+mature+cardiomyocytes:+an+in+vitro+model+for+studying+human+cardiac+physiology+and+pathophysiology.">Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology.</a> Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).</li><li>Noseda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGFRalpha+demarcates+the+cardiogenic+clonogenic+Sca1++stem/progenitor+cell+in+adult+murine+myocardium.">PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium.</a> Nature Communications. 6, 6930 (2015).</li><li>Linke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+dog+heart+are+self-renewing,+clonogenic,+and+multipotent+and+regenerate+infarcted+myocardium,+improving+cardiac+function.">Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function.</a> Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).</li><li>El-Mounayri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+differentiation+of+functional+human+coronary-like+vascular+smooth+muscle+cells+from+embryonic+stem+cells.">Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).</li><li>Ellison, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+c-kit(pos)+cardiac+stem+cells+are+necessary+and+sufficient+for+functional+cardiac+regeneration+and+repair.">Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair.</a> Cell. 154 (4), 827-842 (2013).</li><li>Oh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cells+from+adult+myocardium:+homing,+differentiation,+and+fusion+after+infarction.">Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction.</a> Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).</li><li>Martin, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+expression+of+the+ATP-binding+cassette+transporter,+Abcg2,+identifies+cardiac+SP+cells+in+the+developing+and+adult+heart.">Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart.</a> Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).</li><li>Pfister, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD31-+but+Not+CD31++cardiac+side+population+cells+exhibit+functional+cardiomyogenic+differentiation.">CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation.</a> Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).</li><li>Pelekanos, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transcriptome+and+immunophenotype+analysis+of+renal+and+cardiac+MSC-like+populations+supports+strong+congruence+with+bone+marrow+MSC+despite+maintenance+of+distinct+identities.">Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities.</a> Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).</li><li>Laugwitz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+isl1++cardioblasts+enter+fully+differentiated+cardiomyocyte+lineages.">Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages.</a> Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).</li><li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ISL1+heart+progenitors+generate+diverse+multipotent+cardiovascular+cell+lineages.">Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages.</a> Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).</li><li>Smith, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+resident+endogenous+c-Kit++cardiac+stem+cells+from+the+adult+mouse+and+rat+heart.">Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).</li><li>Matsuura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+cardiac+Sca-1-positive+cells+differentiate+into+beating+cardiomyocytes.">Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).</li><li>Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+migration+of+Sca1+/CD31-+cardiac+side+population+cells+in+a+murine+myocardial+ischemic+model.">Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model.</a> International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).</li><li>Vicinanza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+robustly+myogenic:+c-kit+expression+is+necessary+but+not+sufficient+for+their+identification.">Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).</li><li>Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+c-kit+receptor,+stem+cell+factor,+and+mast+cells.+What+each+is+teaching+us+about+the+others.">The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others.</a> American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).</li><li>Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+c-kit+expression+in+human+endothelial+cells+by+inflammatory+stimuli.">Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli.</a> Blood. 90 (1), 148-155 (1997).</li><li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+c-kit+in+hemopoietic+progenitor+cells.">Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).</li><li>Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Sca-1+in+hematopoietic+stem/progenitor+cell+function.">Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function.</a> Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Pfister, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+ATP-binding+cassette+transporter+Abcg2+in+the+phenotype+and+function+of+cardiac+side+population+cells.">Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells.</a> Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).</li><li>Messina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem+cells+from+human+and+murine+heart.">Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart.</a> Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).</li><li>Davis, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+cardiosphere+method+to+culture+cardiac+progenitor+cells+from+myocardial+tissue.">Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue.</a> PLoS One. 4 (9), e7195 (2009).</li><li>Carr, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiosphere-derived+cells+improve+function+in+the+infarcted+rat+heart+for+at+least+16+weeks--an+MRI+study.">Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study.</a> PLoS One. 6 (10), e25669 (2011).</li><li>Martens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhesus+monkey+cardiosphere-derived+cells+for+myocardial+restoration.">Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration.</a> Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+roles+of+CD90+and+c-kit+to+the+regenerative+efficacy+of+cardiosphere-derived+cells+in+humans+and+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction.">Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260 (2014).</li><li>Mochizuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo-Like+Kinase+2+is+Dynamically+Regulated+to+Coordinate+Proliferation+and+Early+Lineage+Specification+Downstream+of+Yes-Associated+Protein+1+in+Cardiac+Progenitor+Cells.">Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).</li><li>Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+resident+cardiac+progenitor+cells+by+Hoechst+33342+staining.">Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining.</a> Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).</li><li>Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors,+matrices,+and+forces+combine+and+control+stem+cells.">Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells.</a> Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).</li><li>Plaisance, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+Lineage+Specification+in+Adult+Human+Cardiac+Precursor+Cells+Via+Modulation+of+Enhancer-Associated+Long+Noncoding+RNA+Expression.">Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression.</a> JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).</li></ol>

Fördelar med detta protokoll:
Detta protokoll ger en endothelial differentiering teknik för CPC. Vi fann att en låga serumkoncentration och låg cell densiteten kan förbättra effektiviteten av endothelial differentiering, whereby LN visade sig vara en mer lämplig substrat än FN under dessa förhållanden. Vi använde två distinkta typer av CPC: råtta CPC, som användes i en cell linje-liknande sätt, och mus SP-systemet, som var isolerad och expanderat. Särskilt, protokollet var tilläm...

Nyligen genomförda studier stödja förekomsten av bosatta hjärt stamceller (CPC) i den vuxna däggdjur hjärta1,2,3, och CPC kan vara en användbar källa för cellterapi efter hjärt skada4, 5. Dessutom utökade CPC kan tillhandahålla en givande modell för drogkontroll och utredningen av sjukdomsmekanismer när isolerade från patienter med sällsynt kardiomyopati eller från respektive sjukdom modeller6,7.
CPC isolerade från vuxna hjärtat besitter stam/progenitor cell egenskaper1,2,3,8 som de är multipotenta, clonogenic, och har kapacitet för självförnyelse. Det finns dock många olika (under) populationer av CPC uppvisar olika surface markör profiler, inklusive, till exempel c-kit, Sca-1 och andra, eller hämtas av olika isolering tekniker (tabell 1). Flera kultur- och differentiering-protokoll har varit etablerade1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Dessa protokoll variera mestadels med avseende på tillväxtfaktor och serum innehåll, som anpassas efter syftet med odling och som kan leda till skillnader i resultat och utfall, inklusive differentiering effektivitet.
Markör-baserade isolering tekniker:
CPC kan isoleras baserat på en specifik yta markör uttryck1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Tidigare studier tyder på att c-kit och Sca-1 kan vara de bästa markörerna att isolera bosatt CPC1,11,14,19,20. Eftersom ingen av dessa markörer är verkligen specifika för CPC, är kombinationer av olika markörer vanligtvis tillämpas. Till exempel är CPC express låga nivåer av c-kit21, c-kit också uttryckt av andra celltyper, inklusive mastceller22, endotelceller23och hematopoetiska stamceller/stamceller celler24. Ett ytterligare problem är det faktum att inte alla markörer uttrycks över alla arter. Detta är fallet för Sca-1, som uttrycker i musen men inte i mänsklig25. Med hjälp av protokoll som är oberoende av isolering markörer kan därför fördelaktiga med hänsyn till kliniska prövningar och studier med humana prover.
Markör-oberoende isolering tekniker:
I området i närheten finns det flera viktiga tekniker av CPC isolering, som primärt oberoende av ytan markör uttryck, men som kan förfinas genom på varandra följande val av specifik markör-positiv och som behövs (se även tabell 1). (1) sida befolkningen (SP) teknik har ursprungligen präglats i en primitiv population av hematopoetiska stamceller som bygger på förmågan att efflux DNA färgämnet Hoechst 3334226 av ATP-bindande kassett (ABC) transportörer27. Hjärt SP celler har isolerats av olika grupper och rapporterade att uttrycka en mängd markörer med vissa smärre skillnader mellan rapporter2,8,13,14. (2) kolonibildande enhet fibroblast celler (CFU-Fs) har ursprungligen definierats baserat på en mesenkymala stromaceller cell (MSC)-som fenotyp. Isolerade MSCs är odlade på rätter att framkalla kolonin bildas. Sådan kolonibildande MSC-liknande CFU-Fs kan isoleras från vuxna hjärtat och kan differentieras till hjärt härstamningar15. (3) Cardiosphere-derived celler (CDC) är enstaka celler härstammar från kluster av celler som vuxit från vävnadsbiopsier eller explants28,29,30,31. Det visades nyligen som mestadels CD105+/CD90–/c-kit– cell bråkdel uppvisar cardiomyogenic och regenerativ potentiella32.
Här ger vi använder SP-CPC isolerade från möss, ett protokoll för effektiv induktion av endothelial härstamning baserat på en tidigare studie på råtta CPC och mus SP-CPC33. Protokollet innehåller specifika anpassningar till kulturen och expansion teknik med avseende på cell densiteten, serum innehållet i mediet och substratet. Det kan tillämpas inte bara på mus SP-systemet men att olika typer av systemet i syfte att framkalla ett öde byte från en förstärkande till en endothelial-begått CPC, vara det med tanke på transplantation av dessa celler eller deras användning för mekanistiska in vitro- studier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Culture medium</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#12440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>#SH30071</td>
			<td>3.5% (0.1% for lineage induction)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td>#25030</td>
			<td>Final concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thrombin</td>
			<td>Diagontech AG, Switzerland</td>
			<td>#100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.05 % Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T75 Flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial differentiation&#160;&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ham&#39;s F-12K (Kaighn&#39;s) Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fibronectin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#F4759</td>
			<td>Dilute in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#F1635</td>
			<td>Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#93420</td>
			<td>0.1% in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#50062Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-von Willebrand Factor antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab6994</td>
			<td>1:100 in 10% goat serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#A11010</td>
			<td>1:500 in 10% goat serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#62247</td>
			<td>1:500 in ddH2O&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SlowFade Antifade Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#S2828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BX63 widefield microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube formation</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >#352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Matrigel Growth Factor Reduced</td>
			<td >Corning</td>
			<td >#354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX50 widefield microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet.</td>
			<td >in house hospital pharmacy</td>
			<td >#9077862</td>
			<td>Working solution: 200 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#14175</td>
			<td>Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS&#160; for quenching Collagenase B activity&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#331885</td>
			<td>Prepare DMEM + 10% FBS&#160; + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES 1 M</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#15630080</td>
			<td>Final concentration 25 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >#SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RBC LysisBuffer (10X)</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >#420301/100mL</td>
			<td>Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collagenase B</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#11088807001</td>
			<td>Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#B2261</td>
			<td>Prepare 1 mg/mL in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Verapamil-hydrochloride&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#V4629</td>
			<td>Final concentration 83.3 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#551262</td>
			<td>0.25 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#557405</td>
			<td>0.6 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-Aminoactinomycin D (7-ADD)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#A1310</td>
			<td>0.15 &#181;g/106cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC rat IgG2a k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#553932</td>
			<td>0.25 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC Rat IgG2a k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554688</td>
			<td>0.6 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Material</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles 27G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>#NN-2719R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles 18G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>#NN-1838S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Use Syringes 1 mL sterile</td>
			<td>CODAN</td>
			<td>#62.1640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transferpipette 3.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#86.1171.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Strainer 40 &#181;m blue</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>#352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Strainer 100 &#181;m yellow</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lumox Dish 50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#94.6077.305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture Dishes P100</td>
			<td>Corning</td>
			<td >#353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture Dishes P60</td>
			<td>Corning</td>
			<td >#353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Line</td>
			<td>Age</td>
			<td>Breeding</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6NRj / male</td>
			<td>12 weeks</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Product Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue No.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#12440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>#SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td>#25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thrombin</td>
			<td>Diagontech AG, Switzerland&#160;</td>
			<td>#100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Product Name</td>
			<td>Medium 18</td>
			<td>Medium 2</td>
			<td>Medium 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td>Culture</td>
			<td>Lineage induction</td>
			<td>Endothelial diff.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>35%</td>
			<td>35%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>65%</td>
			<td>65%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>1%</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>3.5%</td>
			<td>&#8804;0.1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>0.2 nM</td>
			<td>0.2 nM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>1.3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>6.5 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>13 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>0.65 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of endothelial differentiation in cardiac progenitor cells under low serum conditions

Hjärt stamceller (CPC) kan ha terapeutiska potential för hjärtats förnyelse efter skada. I vuxna däggdjur hjärtat, inneboende CPC är mycket knappa, men utökade CPC kan vara användbar för cellterapi. En förutsättning för deras användning är deras förmåga att skilja på ett kontrollerat sätt i de olika hjärt härstamningar via definierade och effektiv protokoll. Dessutom, vid in vitro- expansion, CPC isolerade från patienter eller prekliniska sjukdomsmodeller kan erbjuda givande forskningsverktyg för utredning av sjukdomsmekanismer.
Aktuella studier använda olika markörer för att identifiera CPC. Dock uttrycks inte alla av dem i människor, som begränsar translationell effekten av vissa prekliniska studier. Differentiering-protokoll som är tillämpliga oavsett isolering teknik och markör uttrycket möjliggör standardiserad expansion och priming av CPC för cell terapi ändamål. Här beskriver vi att grundningen av systemet under en låg fetalt bovint serum (FBS) koncentration och låg cell densiteten villkor underlättar endothelial differentiering av CPC. använder två olika subpopulations av mus och råtta CPC, visar vi att laminin är en mer lämpliga substrat än Fibronektin för detta ändamål enligt följande protokoll: efter odling för 2-3 dagar i medium inklusive kosttillskott som upprätthåller multipotency och med 3,5% FBS, CPC är seedade på laminin på < 60% sammanflödet och odlade i tillägg-fri medium med låga koncentrationer av FBS (0,1%) i 20-24 timmar innan differentiering i endotel differentiering medium. Eftersom systemet är en heterogen befolkning, kan serumkoncentrationer och inkubationstider behöva justeras beroende på egenskaperna för respektive CPC subpopulationen. Med tanke på detta, tekniken kan tillämpas på andra typer av systemet samt och ger en användbar metod för att undersöka möjligheter och mekanismer för differentiering och hur de påverkas av sjukdomen när du använder CPC isolerade från respektive sjukdomsmodeller.

Mus SP-CPC isolering:
I denna studie använde vi mus CPC isolerade enligt SP fenotypen, medan resultaten från råtta systemet ändras och lagt till från en tidigare rapport med behörighet (figur 8)33.
Cellproliferation Under hög och låg Cell tätheter och med olika serumkoncentrationer:
<p class="jove_content" fo...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions at JoVE.com

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Det här protokollet beskriver en endothelial differentiering teknik för hjärt stamceller. Det fokuserar särskilt på hur serumkoncentration och cell-sådd densitet påverkar endothelial differentiering potential.

Induktion av Endothelial differentiering i hjärt stamceller låga Serum villkor

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

Differentiering av hjärt progenitor celler, eller CPCs, vid förstärkning kräver en fas byta från en prolifererande till ett engagerat stadium, och detta protokoll använder effektiv endotel härstamning i CPCs. En stor fördel med tekniken är att den är tillämplig på CPCs isolerade baserat på flera tekniker och från olika arter. Detta protokoll kan användas för att förbättra de terapeutiska potentialerna hos CPCs för cellterapi.Det kan också användas för att undersöka potentialer och mekanismer för differentiering och hur dessa påverkas av hjärtsjukdom. CPCs är en inhomogen population av celler som kan skilja sig åt i form, storlek och potens. Därför måste protokollet justeras efter den specifika delpopulationen av CPC som används.Efter att ha sövt musen, torka ner bröstet med 70%etanol. Med hjälp av en sax, skär huden och bröstväggen för att exponera brösthålan. Använd forceps för att lyfta hjärtat, och sedan använda sax för att skära den vid basen.Överför hjärtat till en P60 kultur skålen innehåller fem milliliter av kall PBS, och sedan använda tuppar för att pumpa hjärtat och mata ut blodet ur håligheterna. Placera hjärtat i en P60 maträtt som innehåller fem milliliter kall PBS och tvätta den. Använd små saxar för att ta bort atria, skär hjärtat i två längsgående bitar, och tvätta dem i fem milliliter iskall PBS.Med hjälp av små saxar, skär hjärtat bitar i mindre sektioner. Tillsätt en droppe av en Hanks balanserade saltlösning innehållande collagenas B i en koncentration av ett milligram per milliliter, och använd ett sterilt rakblad för att finhacka de små hjärtbitarna noggrant. Därefter lägger du till 2,5 milliliter av kollagenas B-lösningen till skålen.Placera skålen i 30 graders vinkel i en inkubator på 37 grader Celsius. Låt de malda hjärtbitarna ruva i högst 30 minuter medan du upprepade gånger passerar dem genom en Pasteurpipett var 10:e minut under inkubationen. Lägg först till fem milliliter kall HBSS kompletterad med 2%FBS till de malda och homogeniserade hjärtbitarna.Med hjälp av ett 100 mikrometerfilter filtrerar du hjärtbitarna för att ta bort osmält vävnad. Centrifugera vid 470 gånger G och vid rumstemperatur i fem minuter. Kassera supernatanten och dra upp pelleten på fem milliliter av röd blodcells-lysbuffert.Inkubera på is i fem minuter med enstaka skakningar. Efter detta, tillsätt 10 milliliter PBS och filtrera provet genom ett 40 mikrometerfilter för att utesluta större celler inklusive kvarvarande kardiomyocyter. Centrifugera vid 470 gånger G och i rumstemperatur i fem minuter utan paus.Sedan, åter avbryta cellerna i DMEM kompletteras med 10%FBS, som syftar till en slutlig cellkoncentration på en miljon celler per milliliter. Fördela cellerna i två rör för färgning och sortering, lägga 1,5 milliliter av celllösningen till ett rör och 3,5 milliliter till det andra röret. Tillsätt Hoechst-lösning och inkubera i 37 grader Celsius i 90 minuter med enstaka vändning för att säkerställa lika fördela färgämnet och förhindra koagulering av cellerna.Sidebefolkningen visas på Hoechsten som är låg lägre, lämnade tränga någon förutom av den huvudsakliga befolkningen. I FACS tomten kan det identifieras baserat på den negativa kontroll där verapamil uppmanar sidan befolkningen att försvinna. Värm upp medium ett till 37 grader Celsius och kyl ner centrifugen till fyra grader Celsius.Centrifugera sorteringsrören vid 470 gånger G och vid fyra grader Celsius i sex minuter. Sedan, åter upphäva cellerna i medium ett. Överför cellerna till en gaspermeabel P60-maträtt som innehåller fyra milliliter medium ett.Byt medium var tredje dag tills cellerna har nått en sammanflödet mellan 70 och 80%Kultur SP-CPC i två till tre dagar i T75-kolvar med hjälp av åtta milliliter medelstor ett i varje kolv. Därefter försiktigt aspirera mediet och skölj försiktigt kolven med fem milliliter varmt HBSS. Behandla cellerna med fem milliliter trypsin EDTA i fem minuter vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid.Tillsätt sedan fem milliliter medium ett för att stoppa trypsinaktiviteten och överför cellupphängningen till ett 15 milliliterrör. Centrifugera vid 470 gånger G i fem minuter vid rumstemperatur. Därefter åter upphäva cellerna i antingen medium ett eller medium två.Platta cellerna på P60-rätter, plätering 250, 000 SP-CPCs per fat med tre milliliter medium som innehåller olika serumkoncentrationer. Efter två dagars odling, samla mediet från varje maträtt i en 15 milliliter röret för att samla de döda cellerna. Trypsinize de vidhäftande cellerna som tidigare beskrivits och samla in cellupphängningen i 15 milliliter röret som innehåller det insamlade mediet.Centrifugera vid 840 gånger G i fem minuter vid rumstemperatur, sedan aspirera supernatanten och tillsätt en milliliter av antingen medium ett eller medium två för cellräkning. Fläck sp-CPCs med trypan blå och räkna livskraftiga och döda celler. Först aspirera mediet från de beredda cellerna, och skölj dem försiktigt med fem milliliter varmt HBSS.Behandla cellerna med fem milliliter trypsin EDTA i fem minuter i cellinkubatorn. Lägg sedan till fem milliliter medium ett för att stoppa trypsinaktiviteten. Överför cellupphängningen till ett 15 milliliterrör och centrifug vid 470 gånger G i fem minuter vid rumstemperatur.Aspirera supernatanten och tillsätt medium två för cellräkning. Därefter frö 80, 000 celler i varje brunn av en pre-coated sex-väl kultur tallrik med tre milliliter av medium två. Håll plattan på 37 grader Celsius i 20 till 24 timmar, och sedan ändra mediet i varje brunn till tre milliliter medel tre.Odla plattan i 21 dagar, ändra mediet var tredje dag. Efter detta, fläck cellerna med en endotel markör och utföra fluorescens mikroskopi för att verifiera endotel karaktär differentierade celler. Först aspirera mediet från de beredda cellerna och skölj dem försiktigt med fem milliliter varmt HBSS.Behandla cellerna med två milliliter trypsin EDTA i fem minuter i cellinkubatorn och tillsätt sedan tre milliliter medelstor tre för att stoppa trypsinaktiviteten. Överför cellupphängningen till ett 15 milliliterrör och centrifug vid 470 gånger G i fem minuter vid rumstemperatur. Aspirera supernatanten och tillsätt en milliliter av medium tre, pipettering försiktigt att blanda.Räkna cellerna och utsädet mellan 2, 000 och 4, 000 celler i 100 mikroliter av medium tre till varje matris belagda väl av en 96-brunnsplatta. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius i 16 timmar. Efter detta, använd en ljus-fält mikroskop vid två gånger förstoring för att ta en bild av cellerna.I denna studie, lämpliga villkor utforskas för underlättande av endotel härstamning engagemang av hjärt stamceller stamceller. När cellkonfluensan är på eller under 60% syns ingen signifikant skillnad i de prover som behandlats med 3,5%FBS. När celler vid denna confluency behandlas med 0,1%FBS, de visar en minskning av cellproliferation på laminin jämfört med fibronectin, men visar ingen ökning av celldöd.Celler vid en högkonfluensi uppvisar däremot ingen signifikant skillnad i vare sig cellproliferation eller celldöd mellan de två villkoren. Förändringar i cellform verkar vara en indikator på lämpliga odlingsförhållanden där endoteldifferentiering kommer att bli framgångsrik. Inom sju till 14 dagar i endoteliala differentieringsmedium, är framgångsrika kulturer ses innehålla större celler med olika morfologi.Intressant nog försvann dessa celler mot slutet av differentieringsfasen och tenderade att dyka upp i lägre antal och vid senare tidpunkter i högdensitetskulturer. Rörbildningen är genomgående framgångsrik i celler pläterade vid låg densitet och differentierade på laminin, medan det ses för att mestadels misslyckas i celler pläterade vid hög densitet. Stundrörbildande är mestadels mislyckad i celler som odlas på fibronectin oberoende av celltäthet, de som göras åtskillnad mellan på en low täthet, bildar ibland rudimentary rör.Serumkoncentrationen och celltätheten för att framkalla endotels härstamning är avgörande, och de måste justeras för att garantera avmattning av spridning samtidigt som lönsamheten bibehålls. Vid härstamningsinduktion kan CPC från människor eller prekliniska sjukdomsmodeller användas för celltransplantationsstudier för att bedöma deras in vivo-differentieringspotential. Detta protokoll kan bidra till att studera eller fastställa nya verktyg för hjärtförnyelse, och det användes tidigare för att studera molekylär mekanism för tidigt härstamningsåtagande.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Härledning av Cardiac progenitorceller från embryonala stamceller

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Direkt Induktion av humana neurala stamceller från perifert blod hematopoetiska progenitorceller

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Neural differentiering av Mouse embryonala stamceller i Serumfri enskiktskultur

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Initiera Differentiering i Immortaliserade multi Otic stamceller

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetisk reglering av hjärt Differentiering av embryonala stamceller och vävnader

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Kondrogena Differentiering Induktion av Fett härrörande stamceller genom Radial Gravity

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Isolering av Endothelial stamceller från mänskliga navelsträngsblod

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

In vitro generation av mus hjärta fält-specifika hjärt progenitor celler

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Pan-myeloida differentiering av humant navelsträngsblod härrör CD34+ hematopoietiska Stem och progenitorceller

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine ...

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

Effektiv differentiering av postganglitoniska sympatiska nervceller med hjälp av mänskliga pluripotenta stamceller under Feeder-fria och kemiskt definierade kulturförhållanden

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...