Name: induction of endothelial differentiation in cardiac progenitor cells under low serum conditions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions at JoVE.com

Yazarlar Vera Lorenz deneyler ve personel Biyomedikal bölümü (DBM), üniversite ve Üniversite Hastanesi Basel akış sitometresi tesisinden sırasında ona yardımcı destek için teşekkür ederiz. Bu eser Stay-on parça programından Basel Üniversitesi (için Michika Mochizuki) tarafından desteklenmiştir. Gabriela M. Kuster İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (grant sayı 310030_156953) hibe tarafından desteklenmektedir.

Fare kullanımı için hücre izolasyon amaçlı ve bakım ve kullanmak, Laboratuvar hayvanları ve İsviçre hayvan koruma kanunu ile Kılavuzu olduğunu ve Swiss Kanton yetkilileri tarafından kabul edildi.
Not: Ani kalp durması-1+/CD31 yalıtım- SP-TBM'leri fare kalp aslında yapıldı olarak yukarıda açıklanan34 bazı değişikliklerle. Malzemeler ve kullanılan reaktifler için Malzemeler tablobakın. Tüm deneyler için ...

<ol>
	<li>Beltrami, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+support+myocardial+regeneration.">Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration.</a> Cell. 114 (6), 763-776 (2003).</li><li>Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+post-natal+heart+contains+a+myocardial+stem+cell+population.">The post-natal heart contains a myocardial stem cell population.</a> FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).</li><li>Sandstedt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+atrium+of+the+human+adult+heart+contains+a+population+of+side+population+cells.">Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells.</a> Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255 (2012).</li><li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+(SCIPIO):+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial.">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li><li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+(CADUCEUS):+a+prospective,+randomised+phase+1+trial.">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li><li>Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+fates+of+cardiovascular+progenitor+cells.">Origins and fates of cardiovascular progenitor cells.</a> Cell. 132 (4), 537-543 (2008).</li><li>Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocyte+progenitor+cells+differentiate+into+functional+mature+cardiomyocytes:+an+in+vitro+model+for+studying+human+cardiac+physiology+and+pathophysiology.">Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology.</a> Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).</li><li>Noseda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGFRalpha+demarcates+the+cardiogenic+clonogenic+Sca1++stem/progenitor+cell+in+adult+murine+myocardium.">PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium.</a> Nature Communications. 6, 6930 (2015).</li><li>Linke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+dog+heart+are+self-renewing,+clonogenic,+and+multipotent+and+regenerate+infarcted+myocardium,+improving+cardiac+function.">Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function.</a> Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).</li><li>El-Mounayri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+differentiation+of+functional+human+coronary-like+vascular+smooth+muscle+cells+from+embryonic+stem+cells.">Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).</li><li>Ellison, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+c-kit(pos)+cardiac+stem+cells+are+necessary+and+sufficient+for+functional+cardiac+regeneration+and+repair.">Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair.</a> Cell. 154 (4), 827-842 (2013).</li><li>Oh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cells+from+adult+myocardium:+homing,+differentiation,+and+fusion+after+infarction.">Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction.</a> Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).</li><li>Martin, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+expression+of+the+ATP-binding+cassette+transporter,+Abcg2,+identifies+cardiac+SP+cells+in+the+developing+and+adult+heart.">Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart.</a> Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).</li><li>Pfister, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD31-+but+Not+CD31++cardiac+side+population+cells+exhibit+functional+cardiomyogenic+differentiation.">CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation.</a> Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).</li><li>Pelekanos, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transcriptome+and+immunophenotype+analysis+of+renal+and+cardiac+MSC-like+populations+supports+strong+congruence+with+bone+marrow+MSC+despite+maintenance+of+distinct+identities.">Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities.</a> Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).</li><li>Laugwitz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+isl1++cardioblasts+enter+fully+differentiated+cardiomyocyte+lineages.">Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages.</a> Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).</li><li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ISL1+heart+progenitors+generate+diverse+multipotent+cardiovascular+cell+lineages.">Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages.</a> Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).</li><li>Smith, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+resident+endogenous+c-Kit++cardiac+stem+cells+from+the+adult+mouse+and+rat+heart.">Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).</li><li>Matsuura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+cardiac+Sca-1-positive+cells+differentiate+into+beating+cardiomyocytes.">Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).</li><li>Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+migration+of+Sca1+/CD31-+cardiac+side+population+cells+in+a+murine+myocardial+ischemic+model.">Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model.</a> International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).</li><li>Vicinanza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+robustly+myogenic:+c-kit+expression+is+necessary+but+not+sufficient+for+their+identification.">Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).</li><li>Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+c-kit+receptor,+stem+cell+factor,+and+mast+cells.+What+each+is+teaching+us+about+the+others.">The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others.</a> American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).</li><li>Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+c-kit+expression+in+human+endothelial+cells+by+inflammatory+stimuli.">Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli.</a> Blood. 90 (1), 148-155 (1997).</li><li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+c-kit+in+hemopoietic+progenitor+cells.">Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).</li><li>Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Sca-1+in+hematopoietic+stem/progenitor+cell+function.">Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function.</a> Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Pfister, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+ATP-binding+cassette+transporter+Abcg2+in+the+phenotype+and+function+of+cardiac+side+population+cells.">Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells.</a> Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).</li><li>Messina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem+cells+from+human+and+murine+heart.">Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart.</a> Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).</li><li>Davis, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+cardiosphere+method+to+culture+cardiac+progenitor+cells+from+myocardial+tissue.">Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue.</a> PLoS One. 4 (9), e7195 (2009).</li><li>Carr, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiosphere-derived+cells+improve+function+in+the+infarcted+rat+heart+for+at+least+16+weeks--an+MRI+study.">Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study.</a> PLoS One. 6 (10), e25669 (2011).</li><li>Martens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhesus+monkey+cardiosphere-derived+cells+for+myocardial+restoration.">Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration.</a> Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+roles+of+CD90+and+c-kit+to+the+regenerative+efficacy+of+cardiosphere-derived+cells+in+humans+and+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction.">Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260 (2014).</li><li>Mochizuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo-Like+Kinase+2+is+Dynamically+Regulated+to+Coordinate+Proliferation+and+Early+Lineage+Specification+Downstream+of+Yes-Associated+Protein+1+in+Cardiac+Progenitor+Cells.">Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).</li><li>Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+resident+cardiac+progenitor+cells+by+Hoechst+33342+staining.">Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining.</a> Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).</li><li>Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors,+matrices,+and+forces+combine+and+control+stem+cells.">Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells.</a> Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).</li><li>Plaisance, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+Lineage+Specification+in+Adult+Human+Cardiac+Precursor+Cells+Via+Modulation+of+Enhancer-Associated+Long+Noncoding+RNA+Expression.">Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression.</a> JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).</li></ol>

Bu iletişim kuralı avantajları:
Bu iletişim kuralı bir TBM endotel farklılaşma tekniği sağlar. Bulduğumuz bir düşük serum konsantrasyonu ve düşük hücre yoğunluğu endotel farklılaşma, mademki LN FN bu koşullar altında daha bir daha uygun substrat kanıtladı verimliliğini artırabilirsiniz. Biz TBM'leri iki ayrı türü kullanılır: fare hangi izole ve genişletilmiş bir hücre satırı benzeri şekilde ve fare SP-TBM'leri kullanılan, TBM,. Özellikle, protokol her iki t...

Son yıllarda yapılan çalışmalarda yetişkin memeli kalp1,2,3' te ikamet kardiyak progenitör hücre (TBM) varlığını desteklemek ve TBM'leri Kalp zedelenmesini4sonra, hücre tedavisi için yararlı bir kaynak olabilir 5. Buna ek olarak, genişletilmiş TBM'leri uyuşturucu tarama için verimli bir model sağlayabilir ve modellerinin nadir kardiyomiyopatiler hastalarda veya ilgili hastalık izole zaman hastalık mekanizmaları araştırma6,7.
Yetişkin yürekten izole TBM'leri sahip kök/progenitor hücre özellikleri1,2,3,8 multipotent, oldukları gibi klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar, ve kendini yenilemesinin kapasitesine sahiptir. Ancak, birçok farklı (alt) nüfus dahil olmak üzere, farklı yüzey marker profillerini, örneğin, c-kit, ani kalp durması-1 ve diğerleri, sergilenmesi veya farklı yalıtım teknikleri (Tablo 1) tarafından alınan TBM'leri vardır. Bazı kültür ve farklılaşma protokollerine kurulan1,2,8,9,10,11,12oldunuz. 13,14,15,16,17,18. Bu protokoller çoğunlukla büyüme faktörü ve hangi kültürü çalışmalarının amacı göre ayarlanır ve bunun sonuçları ve sonuçları da farklılaşma verimliliği dahil olmak farklılıkları için açabilir serum içerik ile ilgili olarak değişir.
İmleç tabanlı yalıtım teknikleri:
TBM bir belirli yüzey marker ifade1,2,8,9,10,11,12,13 tarihinde bağlı izole olabilir ,14,15,16,17,18. Önceki çalışmalar, c-kit ve ani kalp durması-1 ikamet TBM'leri1,11,14,19,20yalıtmak için en iyi işaretleri olabilir öneririz. Bu işaretleri hiçbiri TBM için gerçekten özel olduğundan, kombinasyonları farklı işaretleri genellikle uygulanır. Örneğin, c-kit21seviyesinin düşük TBM'ler hızlı ise, c-kit Ayrıca mast hücreleri22, endotel hücreleri23ve hematopoetik kök/progenitor hücreler24de dahil olmak üzere diğer hücre tiplerine göre ifade edilir. Ek bir sorun tüm işaretleri tüm türler arasında ifade edilir olmasıdır. Ani kalp durması-1, fare ama insan25içinde ifade için durum böyle. Bu nedenle, yalıtım işaretleri bağımsız iletişim kuralları kullanılarak klinik çalışmalarda ve insan numuneleri kullanılarak çalışmalar içinde görüş-in avantajlı olabilir.
Marker bağımsız yalıtım teknikleri:
TBM tecrit, öncelikle yüzey marker ifade bağımsız olan ama (Ayrıca bkz: Tablo 1) gerektiği gibi belirli işaret-pozitif subfractions ardışık seçime göre rafine birkaç önemli teknikler vardır. (1 yan nüfus (SP) tekniği aslında hematopoetik kök hücre ATP-bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcılar27tarafından sızma DNA boya Höchst 3334226 yeteneği dayanan ilkel bir popülasyondaki karakterize. Kardiyak SP hücreler farklı gruplar tarafından izole ve işaretleri raporları2,8,13,14arasında bazı küçük farklılıklar ile çeşitli ifade etmek için bildirdi. (2) koloni oluşturan birim fibroblast hücreleri (CFU-Fs) başlangıçta belirlediğiniz dayalı mezenkimal stromal hücre (MSC) üzerinde-fenotip gibi. İzole MSCs koloni oluşumu ikna etmek için bulaşık sırası kültürlü. Bu koloni oluşturan-MSC benzeri CFU-Fs yetişkin yürekten ayrılmış olabilir ve kardiyak soy15ayırt etmek yeteneğine sahiptirler. (3) Cardiosphere kaynaklı hücreler (CDC) doku biyopsisi yetiştirilen hücre kümeleri elde tek hücrelerdir veya28,29,30,31explants. Son zamanlarda bu çoğunlukla CD105 gösterildi+/CD90-/c-kit- hücre kesir sergileyen cardiomyogenic ve rejeneratif potansiyel32.
Burada, SP-TBM'leri fareler izole kullanarak, biz bir protokol endotel lineage önceki çalışmada sıçan TBM'leri ve fare SP-TBM'leri33verimli indüksiyon için sağlar. Protokol kültürüne özgü uyarlamalar ve genişleme tekniği ile ilgili hücre yoğunluğu, orta sınıf ve substrat serum içeriğini içerir. Sadece fare SP-TBM'leri uygulanabilir ancak farklı TBM'leri amaç için bir endotel kaydedilmiş bir TBM yükseltecek üzerinden bir kader anahtarı ikna etmek için o içinde görüş-in bu hücreler veya kullanımları için mekanik vitro çalışmalar nakli olmak.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Culture medium</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#12440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>#SH30071</td>
			<td>3.5% (0.1% for lineage induction)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td>#25030</td>
			<td>Final concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thrombin</td>
			<td>Diagontech AG, Switzerland</td>
			<td>#100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.05 % Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T75 Flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#83.3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial differentiation&#160;&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ham&#39;s F-12K (Kaighn&#39;s) Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#21127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fibronectin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#F4759</td>
			<td>Dilute in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#F1635</td>
			<td>Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#93420</td>
			<td>0.1% in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#50062Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-von Willebrand Factor antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab6994</td>
			<td>1:100 in 10% goat serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#A11010</td>
			<td>1:500 in 10% goat serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#62247</td>
			<td>1:500 in ddH2O&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SlowFade Antifade Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#S2828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BX63 widefield microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube formation</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >#352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Matrigel Growth Factor Reduced</td>
			<td >Corning</td>
			<td >#354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX50 widefield microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet.</td>
			<td >in house hospital pharmacy</td>
			<td >#9077862</td>
			<td>Working solution: 200 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#14175</td>
			<td>Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS&#160; for quenching Collagenase B activity&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#331885</td>
			<td>Prepare DMEM + 10% FBS&#160; + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES 1 M</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#15630080</td>
			<td>Final concentration 25 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >#SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RBC LysisBuffer (10X)</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >#420301/100mL</td>
			<td>Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collagenase B</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#11088807001</td>
			<td>Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#B2261</td>
			<td>Prepare 1 mg/mL in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Verapamil-hydrochloride&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td >#V4629</td>
			<td>Final concentration 83.3 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#551262</td>
			<td>0.25 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#557405</td>
			<td>0.6 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-Aminoactinomycin D (7-ADD)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#A1310</td>
			<td>0.15 &#181;g/106cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC rat IgG2a k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#553932</td>
			<td>0.25 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC Rat IgG2a k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554688</td>
			<td>0.6 &#181;g/107cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Material</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles 27G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>#NN-2719R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles 18G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>#NN-1838S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Use Syringes 1 mL sterile</td>
			<td>CODAN</td>
			<td>#62.1640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transferpipette 3.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#86.1171.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Strainer 40 &#181;m blue</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>#352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Strainer 100 &#181;m yellow</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lumox Dish 50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#94.6077.305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture Dishes P100</td>
			<td>Corning</td>
			<td >#353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture Dishes P60</td>
			<td>Corning</td>
			<td >#353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Line</td>
			<td>Age</td>
			<td>Breeding</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6NRj / male</td>
			<td>12 weeks</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Product Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue No.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#12440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>#SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td>#25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thrombin</td>
			<td>Diagontech AG, Switzerland&#160;</td>
			<td>#100-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Product Name</td>
			<td>Medium 18</td>
			<td>Medium 2</td>
			<td>Medium 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td>Culture</td>
			<td>Lineage induction</td>
			<td>Endothelial diff.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>35%</td>
			<td>35%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td>
			<td>65%</td>
			<td>65%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin&#160; (P/S)</td>
			<td>1%</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>3.5%</td>
			<td>&#8804;0.1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine&#160;</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutathione</td>
			<td>0.2 nM</td>
			<td>0.2 nM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td>1.3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>6.5 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>13 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiotrophin 1&#160;</td>
			<td>0.65 ng/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of endothelial differentiation in cardiac progenitor cells under low serum conditions

Kardiyak progenitör hücre (TBM) kalp yeniden oluşturma tamamlandıktan sonra yaralanma için tedavi potansiyeli olabilir. Yetişkin memeli kalbinde, içsel TBM'leri son derece kıt, ama genişletilmiş TBM'leri hücre tedavisi için yararlı olabilir. Yeteneklerini denetimli bir biçimde tanımlanmış ve etkin iletişim kuralları kullanılarak çeşitli kardiyak soy ayırt etmek için onların kullanmak için bir önkoşuldur. Ayrıca, vitro genişleme, üzerine TBM'leri hastalardan izole veya preklinik hastalık modelleri hastalığı mekanizmaları incelenmesi için verimli araştırma araçları sunabilir.
Mevcut çalışmalar farklı işaretleri TBM'leri tanımlamak için kullanın. Ancak, tüm bunların hangi preklinik bazı çalışmalar translasyonel etkisini sınırlar insanlarda, ifade edilir. Ne olursa olsun yalıtım tekniği ve marker ifade tabidir farklılaşma protokolleri için standart genişleme ve TBM astar hücre terapisi amaç için izin verir. Burada biz tarif endotel farklılaşma TBM'leri. fare ve sıçan TBM'leri iki farklı altgrupları kullanarak TBM'leri astar düşük fetal Sığır serum (FBS) konsantrasyon ve düşük hücre yoğunluğu koşullar altında kolaylaştırır, bir daha o laminin olduğunu göstereceğiz fibronektin aşağıdaki protokol altında bu amaçla daha uygun substrat: 2-3 gün içinde takviyeleri de dahil olmak üzere orta multipotency korumak için sonra kültür ve % 3,5 ile FBS, TBM laminin üzerinde numaralı seribaşı < % 60 izdiham ve kültürlü içinde Ek içermeyen orta FBS (% 0,1) düşük konsantrasyonlarda farklılaşma endotel farklılaşma orta önce 20-24 saat ile. TBM türdeş olmayan bir nüfus olduğundan, serum konsantrasyonları ve kuluçka süreleri ilgili TBM subpopulation özelliklerine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Göz önüne alındığında bu, teknik diğer türleri TBM için de uygulanabilir ve potansiyel ve farklılaşma ve nasıl onlar hastalığı ile ilgili hastalık modellerden izole TBM'leri kullanırken etkilenen mekanizmaları araştırmak için yararlı bir yöntem sağlar.

Fare SP-TBM yalıtım:
Bu çalışmada, biz ise fare TBM'leri sonuçlarından değiştiren ve izni (Şekil 8)33ile önceki bir rapordan eklendi SP fenotip göre izole fare TBM kullanılır.
Hücre çoğalması yüksek ve en düşük hücre yoğunluğu altında ve farklı Serum konsantrasyonları ile:
<p class="jove_co...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions at JoVE.com

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Bu iletişim kuralı bir endotel farklılaşma tekniği kalp progenitör hücreler için açıklar. Bu özellikle serum konsantrasyonu ve hücre tohum yoğunluğu endotel farklılaşma potansiyeli etkilemesi üzerinde duruluyor.

İndüksiyon düşük Serum koşullar altında kalp Progenitor hücreler endotel farklılaşma

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

Kardiyak progenitor hücrelerinin veya TBM'lerin amplifikasyon üzerine farklılaşması, çoğalan bir aşamadan kararlı bir aşamaya doğru bir faz geçişi gerektirir ve bu protokol CpC'lerde verimli endotel soyu kullanır. Tekniğin en büyük avantajı, çeşitli tekniklere ve farklı türlerden izole edilmiş KBM'ler için geçerli olmasıdır. Bu protokol hücre tedavisi için CpCs terapötik potansiyelini artırmak için kullanılabilir.Ayrıca, farklılaşmanın potansiyellerini ve mekanizmalarını ve bunların kalp hastalığından nasıl etkilendiğini araştırmak için de kullanılabilir. CpC'ler şekil, boyut ve potens açısından farklılık gösteren homojen bir hücre popülasyonudur. Bu nedenle, protokol kullanılan CpCs belirli alt nüfusa göre ayarlanmalıdır.Fareyi anestezi ettikten sonra göğsünü %70 etanol ile silin. Makas kullanarak, torasik boşluğu ortaya çıkarmak için deri ve göğüs duvarı kesti. Kalbi kaldırmak için forseps kullanın ve sonra tabanında kesmek için makas kullanın.Kalbi beş mililitre soğuk PBS içeren bir P60 kültür yemeğine aktarın ve sonra kalbi pompalamak ve kanı boşluklardan çıkarmak için çerofma kullanın. Kalbi beş mililitre soğuk PBS içeren bir P60 kabına yerleştirin ve yıkayın. Atria kaldırmak için küçük makas kullanın, iki uzunlamasına parçalar halinde kalp kesmek, ve buz soğuk PBS beş mililitre onları yıkayın.Küçük makas kullanarak, daha küçük bölümlerhalinde kalp parçaları kesti. Mililitre başına bir miligram konsantrasyonda kollajenaz B içeren hank dengeli tuz çözeltisi bir damla ekleyin ve iyice küçük kalp parçaları kıyma için steril bir jilet kullanın. Sonra, çanak kollajenaz B çözeltisi 2,5 mililitre ekleyin.37 derece santigrat bir kuvöz de 30 derecelik bir açıyla çanak yerleştirin. Kuluçka sırasında her 10 dakikada bir Pasteur pipetinden geçerken, kıyılmış kalp parçalarının en fazla 30 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin. İlk olarak, kıyılmış ve homojenize kalp parçaları% 2 FBS ile desteklenen soğuk HBSS beş mililitre ekleyin.100 mikrometrefiltre kullanarak, sindirilmemiş doku kaldırmak için kalp parçaları filtre. Santrifüj 470 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika. Supernatant atın ve kırmızı kan hücresi lisis tampon beş mililitre pelet yeniden askıya.Ara sıra sallayarak beş dakika boyunca buz üzerinde kuluçka. Bundan sonra, 10 mililitre PBS ekleyin ve artık kardiyomiyositler de dahil olmak üzere daha büyük hücreleri dışlamak için numuneyi 40 mikrometrelik bir filtreden filtreleyin. 470 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika ara vermeden santrifüj.Daha sonra, dmem hücreleri yeniden askıya 10% FBS ile desteklenmektedir, mililitre başına bir milyon hücrenin son hücre konsantrasyonu amaçlayan. Hücreleri boyama ve sıralama için iki tüpe dağıtın, bir tüpe hücre çözeltisinin 1,5 mililitresini ve ikinci tüpe 3,5 mililitre ekleyerek. Hoechst çözeltisi ekleyin ve boya eşit dağıtmak sağlamak ve hücrelerin pıhtılaşmasını önlemek için ara sıra çevirme ile 90 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka.Yan popülasyon ana nüfusun dışında Hoechst düşük alt sol köşesinde görünür. FACS arsa içinde verapamil ortadan kaybolmak için yan nüfus ister negatif kontrol dayalı tespit edilebilir. Orta 1 ila 37 santigrat derece ısıtın ve santrifüjü 4 santigrat dereceye kadar soğutun.Sıralama tüplerini 470 kez G'de ve dört santigrat derecede altı dakika santrifüj edin. Daha sonra, orta bir hücreleri yeniden askıya alın. Hücreleri, dört mililitre orta litre içeren gaz geçirilebilir bir P60 kabına aktarın.Hücreler her şişede orta bir sekiz mililitre kullanarak T75 şişelerinde iki ila üç gün boyunca hücreler 70 ve %80 Kültür SP-CpC'leri arasında bir araya gelene kadar her üç günde bir ortamı değiştirin. Daha sonra, dikkatle orta aspire ve yavaşça sıcak HBSS beş mililitre ile şişe durulayın. Hücreleri 5 mililitre tripsin EDTA ile %5 karbondioksit le 37 santigrat derecede beş dakika tedavi edin.Daha sonra, tripsin aktivitesini durdurmak için orta bir beş mililitre ekleyin ve 15 mililitrelik bir tüp hücre süspansiyon aktarın. Oda sıcaklığında beş dakika 470 kez G santrifüj. Ardından, orta bir veya orta iki deki hücreleri yeniden askıya alın.P60 tabaklarda hücreleri kaplayın, tabak başına 250, 000 SP-CPC'yi farklı serum konsantrasyonları içeren üç mililitre lik orta ile kaplayın. Culturing iki gün sonra, ölü hücreleri toplamak için 15 mililitrelik tüp içine her çanak orta toplamak. Daha önce açıklandığı gibi yapışık hücreleri trypsinize ve toplanan orta içeren 15 mililitrelik tüp içine hücre süspansiyon toplamak.Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 840 kez G'de santrifüj, sonra supernatant aspire ve hücre sayma için orta bir veya orta iki ya bir mililitre ekleyin. SP-CPC'leri trypan mavisi ile lekelendirin ve canlı ve ölü hücreleri sayın. İlk olarak, hazırlanan hücrelerden orta aspire ve sıcak HBSS beş mililitre ile yavaşça durulayın.Hücre kuluçka makinesinde beş dakika boyunca beş mililitre tripsin EDTA ile hücreleri tedavi edin. Sonra, trippsin aktivitesini durdurmak için orta bir beş mililitre ekleyin. Hücre süspansiyonuna oda sıcaklığında beş dakika boyunca 470 kez G'de 15 mililitrelik bir tüp ve santrifüj aktarın.Supernatant aspirate ve hücre sayımı için orta iki ekleyin. Sonra, tohum 80, 000 hücreleri orta iki üç mililitre ile önceden kaplanmış altı iyi kültür plakası her kuyuiçine. Plakayı 20 ila 24 saat boyunca 37 derecede tutun ve her kuyudaki orta yı üç mililitreye değiştirin.Kültür 21 gün boyunca plaka, her üç günde bir orta değişiyor. Bundan sonra, bir endotel belirteci ile hücreleri leke ve diferansiye hücrelerin endotel doğasını doğrulamak için floresan mikroskopi gerçekleştirmek. İlk olarak, hazırlanan hücrelerden orta aspire ve sıcak HBSS beş mililitre ile yavaşça durulayın.Hücre inkübatörbeş dakika için tripsin EDTA iki mililitre ile hücreleri tedavi, sonra trippsin aktivitesini durdurmak için orta üç üç mililitre ekleyin. Hücre süspansiyonuna oda sıcaklığında beş dakika boyunca 470 kez G'de 15 mililitrelik bir tüp ve santrifüj aktarın. Supernatant aspirate ve orta üç bir mililitre ekleyin, karıştırmak için yavaşça pipetting.Hücreleri ve tohumları 2, 000 ile 4 arasında say, orta üç mikrolitredeki 100 mikrolitredeki hücreleri 96 kuyulu bir plakanın iyi kaplanmış her matrisine kadar sayın. Plakayı 16 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, hücrelerin resmini çekmek için iki kat büyütme parlak alan mikroskobu kullanın.Bu çalışmada kardiyak progenitor hücrelerin endotel soy bağlılığının kolaylaştırılması için uygun koşullar araştırılmıştır. Hücre birleşimi %60 veya altında olduğunda %3.5 FBS ile tedavi edilen örneklerde anlamlı bir fark görülmez. Bu birleşmedeki hücreler %0.1 FBS ile tedavi edildiğinde, fibronektin ile karşılaştırıldığında laminada hücre çoğalmalarında azalma gösterirler, ancak hücre ölümünde artış göstermezler.Buna karşılık, yüksek bir kesişme hücrelerinin iki durum arasında hücre çoğalması veya hücre ölümü arasında anlamlı bir fark göstermez. Hücre şeklindeki değişiklikler, endotel farklılaşmasının başarılı olacağı uygun kültür koşullarının bir göstergesi gibi görüner. Endotel diferansiyasyon ortamında 7-14 gün içinde, başarılı kültürlerin farklı morfolojisi olan daha büyük hücreler içerdiği görülmektedir.İlginçtir, bu hücreler farklılaşma aşamasının sonuna doğru kayboldu ve yüksek yoğunluklu kültürlerde daha düşük sayılarda ve daha sonraki zaman noktalarında görünme eğilimindeydi. Tüp oluşumu düşük yoğunlukta kaplanmış hücrelerde sürekli olarak başarılı olur ve laminin üzerinde ayırt edilir, yüksek yoğunluklu kaplanmış hücrelerde çoğunlukla başarısız olduğu görülür. Hücre yoğunluğuna bakılmaksızın fibronektin üzerinde kültürlenmiş hücrelerde tüp oluşumu çoğunlukla başarısız olmakla birlikte, düşük yoğunlukta farklılaşanlar bazen ilkel tüpler oluştururlar.Endotel soyu neden serum konsantrasyonu ve hücre yoğunluğu çok önemlidir, ve canlılık korurken proliferasyon yavaşlamasını garanti etmek için ayarlanması gerekir. Soy indüksiyonu üzerine, in vivo farklılaşma potansiyellerini değerlendirmek için hücre nakli çalışmalarında insanlardan veya klinik öncesi hastalık modellerinden alınan KSK'lar kullanılabilir. Bu protokol yeni kardiyak rejenerasyon araçlarının incelenmesine veya kurulmasına yardımcı olabilir ve daha önce erken soy bağlılığının moleküler mekanizmasını incelemek için kullanılmıştır.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Embriyonik Kök Hücreleri Kardiyak Progenitör Hücrelerinin türetilmesi

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Periferik kan Hematopoetik Progenitör Hücreleri İnsan Sinir Kök Hücre Doğrudan İndüksiyon

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Serum serbest Tek tabakalı Kültüründe Fare Embriyonik Kök Hücre Sinir Farklılaşma

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Ölümsüzleştirdi Multipotent Otic Progenitor Hücrelerde Farklılaşma başlatılıyor

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Embriyonik Kök Hücre ve Doku Kardiyak Farklılaşma epigenetik Yönetmelik

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Santrifüj Yerçekimi ile adipoz kaynaklı Kök Hücrelerin kondrojenik Farklılaşma İndüksiyon

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Yalıtım endotelyal Progenitor Hücre insan göbek kordon kanı

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

In vitro Generation fare kalp alanı-spesifik kardiyak progenitor hücreler

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

İnsan Kordon Kanı Kaynaklı CD34 Pan-miyeloid Farklılaşması+ Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücreleri

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine ...

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

Besleyicisiz ve Kimyasal Olarak Tanımlanmış Kültür Koşulları Altında İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Kullanan Postgangliyonik Sempatik Nöronların Verimli Farklılaşması

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...