Name: detection of 3-nitrotyrosine in atmospheric environments via a high-performance liquid chromatography-electrochemical detector system
Uploaded: 2019-01-30T12:30:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System at JoVE.com

De auteurs bedanken Masayuki Kubo van de ons Environmental Protection Agency voor zijn hulp met de Theelepel/PM2.5 bemonstering. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door JSPS KAKENHI Grant nummer JP16K15373 en JP18H03039.

1. verzameling van totaal geschorst deeltjes, PM2.5, of PM-7en de hydrolyse-methode voor PM eiwitten
<ol><li>Verzamel de PM van een PREFILTRE of back-filter.<ol>
<li>Vóór het verzamelen van totaal zwevende deeltjes (TSP), PM2.5en PM7, wegen de quartz-filter. Opmerking: Aangezien besmetting door PM eiwitten en peptiden doet geen afbreuk aan de opsporing van tyrosine nitratie (zijn ze niet van een dergelijke een nitro-groep), we hebben niet behandelen de quartz-filter op een hoge temperatuur voor de meting. Bovendien was 3-NT inhoud in de quartz-filter onder de detectiegrens, zoals bepaald door HPLC-ECD.</li>
		<li>Stel de quartz-filter op een hoog-volume lucht-sampler met een deeltje grootte selector om te verzamelen van PM-7 bij een debiet van 1.000 L/min. voortdurend voor 7 d (figuur 1B). TSP kan worden verzameld op een quartz-filter zonder een grootte selector (figuur 1A).</li>
		<li>Verzamelen van PM2.5 met een laag-volume lucht sampler een grootte classificatie eenheid op een debiet van 116 L/min voortdurend voor 7 d. met behulp van deze eenheid, deeltjes kunnen worden geclassificeerd als PM4.5-2.5, PM7.3-4.5, PM15-7,3en TSP-PM15 en verzameld op de quartz-filters voor indeling. PM2.5 kan worden verzameld op een back-up filter (Figuur 1 c).</li>
		<li>Het volume van de totale stroom opnemen op het moment van de filter-collectie. Meten van het gewicht van de TSP, PM2.5en PM7 op de filters door de routinetests gewicht van het postcollection gewicht af te trekken. Zegel van het filter in een plastic zak en sla het op-30 ° C tot en met de volgende stap (zie punt 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proteolyze de monsters.<ol>
<li>Los niet-specifieke protease cocktail met een 0,1 M acetaat buffer (pH 7.4). Zet de oplossing in een dialyse membraan (moleculair gewicht cutoff = 5.000 Da) en het onderdompelen in 1 L van 0,1 M acetaat buffer met roeren bij 4 ° C. Vervang de buffer 2 x elke 12 h en voer dialyse 's nachts om endogene 3-NT en nitriet (2-). Na de dialyse, verzamelen van de oplossing en de eiwitconcentratie meten door bicinchoninic zuur (BCA) eiwit bepaling.</li>
		<li>Punch ronde cirkels van 6 mm uit de voorfilter of de back-up filter en zet hen in slangen. Maximaal vijf stukken van 6 mm breuken kan worden gebruikt voor de analyse (Figuur 2).</li>
		<li>Voeg 300 µL van 0,1 M acetaat buffer met 50 µg proteïne van de niet-specifieke protease cocktail (bereid in stap 1.2.1) aan de buis te hydrolyseren de PM-eiwitten bij 50 ° C voor 16 h met rotatie. Nota: Als u wilt aftrekken endogene 3-NT, op de niet-specifieke protease cocktail oplossing, is het noodzakelijk voor te bereiden en een niet-specifieke protease-dit is een alleen-cocktail-monster verteren.</li>
		<li>Spoel de ultrafiltratie membraan samen met de meegeleverde buis door toevoeging van 0,1 M acetaat buffer en centrifugeren (10.000 x g voor 30 sec; de exacte snelheid hangt af van het membraan), gevolg van verontreiniging van chemische stoffen vergelijkbaar met 3-NT in het membraan. Herhaal de spoeling 1 x.</li>
		<li>Na proteolyse, centrifugeren van de monsters bij 2.500 x g gedurende 10 min. belasting het supernatant in het membraan van de ultrafiltratie en Centrifugeer het bij 10.000 x g- en 4 ° C voor ultrafiltratie (MWCO = 10.000), totdat voldoende hoeveelheid elutie worden verzameld. Bewaar de eluaten bij 4 ° C in het donker. Let op: Als gevolg van de opsporing van een soortgelijke piek bij 3-NT in de kolom van de spin, het is noodzakelijk om te wassen het goed met schoon water of met een buffer zoals HPLC water en een 0,1 M acetaat buffer voorafgaande te gebruiken.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. bepaling van 3-NT gehalte in PM2.5, en7PMvia een High-performance Liquid Chromatography, Theelepel en elektrochemische detectiesysteem (HPLC-ECD)
Opmerking: Zie Figuur 3.
<ol><li>De mobiele fase voor te bereiden.<ol>
<li>Bereiden van 0,2 M fosfaat buffer (pH 2.5) met 50 mg/L EDTA. Meten van 98 volumes van de buffer en twee volumes van acetonitril (HPLC-kwaliteit), giet ze in een schone fles en krachtig mengen met een cap.</li>
		<li>Genoegen nemen met de mobiele fase bij kamertemperatuur gedurende enkele uren tot de opgeloste lucht plat gaat. Opmerking: Als het systeem eerder gestart wordt, de mobiele fase kan worden sonicated en ontgast onder een vacuüm. Echter overdreven ontgassing, verandert de verhouding tussen het water en de organische fase via verdamping.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De HPLC-ECD-systeem bestaat uit een pomp, een HPLC-kolom, een degasser, een ECD en een injector. De mobiele fase equilibreer en stabiliseren van het systeem om de achtergrond en de ruis te verminderen.<ol>
<li>De mobiele fase en de HPLC-kolom in het HPLC-systeem installeren. Zet de HPLC-pomp en stabiliseren van de kolom met de mobiele fase op een debiet van 500 µL/min bij 25 ° C kolomtemperatuur vanaf de dag vóór de dag van start.</li>
		<li>Op de volgende dag, het ECD ontsteken en de parameters instellen (de vermindering van de spanning aan de-900 mV en de spanning van de excitatie bij 400 mV). Stabiliseren het voor ten minste 3 uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het meten van de concentratie van de 3-NT in de PM-7.<ol>
<li>Het bereiden van verschillende concentraties van 3-NT normen (5-500 nM) en een lege (zonder de 3-NT standaard en niet-specifieke protease cocktail, om te controleren of de flacon noch de buffer is verontreinigd) in een buffer van 0,1 M acetaat.</li>
		<li>Voer de HPLC data processor.</li>
		<li>Zetten monster flesjes in de auto-injector en reeks het geïnjecteerde volume 25 µL. werken dezelfde voorwaarden van de mobiele fase en stroomsnelheid zoals vermeld in stap 2.2.1. Opmerking: Als de bereiding van de monsters voltooid is, moet er monsters, een standaard (5-500 nM), een niet-specifieke protease-dit is een alleen-cocktail-monster en een lege vial.</li>
		<li>Ervoor te zorgen dat de basislijn in het chromatogram plat is en beginnen de monster-injectie. Opmerking: In het algemeen 3-NT is gedetecteerd in 20-21 min; echter, ongeveer 30 min wordt aanbevolen als de speelduur per monster injectie. Anders zal hun gehalte aan verontreinigingen pieken worden opgenomen in de volgende run.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. analyse van chromatogrammen en kwantificering van 3-NT inhoud in PM-7
<ol><li>Controleer de 3-NT-piek in de chromatogrammen en berekenen van de inhoud.<ol>
<li>Na het verzamelen van gegevens, door het chromatogram-gegevensbestand te openen met analysesoftware.</li>
		<li>Trek een lijn over de piek 3-NT vanaf de platte basislijn en lees de piekhoogte van de getekende lijn. Opmerking: Het kwantitatieve maximum is ongeveer 5 nM (125 fmol in een injectie van 25 µL). Let op: De elektrode in de ECD wordt langzaam uitgeput, en de limiet zullen hoog als gevolg van de S/N-verhouding.</li>
		<li>Bereiden een regressielijn van de standaard 3-NT-pieken en berekenen van de helling onderscheppen.</li>
		<li>Deze constanten in de volgende vergelijking toewijzen en de 3-NT-inhoud in de monsters als volgt berekenen. Monster 3-NT (nM) = [monster piek-onderscheppen] / helling Eq. (1) Opmerking: De standaard curve moet worden goed weergegeven als een rechte lijn tussen 5 nM en 500 nM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De 3-NT in de omgeving van de lucht en de PM-7 van de monster-flacon te berekenen.<ol>
<li>Vermenigvuldig de 3-NT concentratie door het volume van de reactie (en de verdunningsfactor, indien van toepassing), en evalueren van de absolute 3-NT inhoud in PM7 uit de kring.</li>
		<li>De verzamelde filtergebied meten en berekenen van de 3-NT-inhoud in de totale PM7 filteren door de volgende vergelijking. Totaal PM7 = [3-NT content in de PM-7 van de cirkel] x [verhouding van het filtergebied van de7 PM naar de cirkel gebied] x 226.19 (in het geval van mollen omzetten in gram) Eq. (2)</li>
		<li>Evalueren van de 3-NT-inhoud in de omgeving van lucht of PM7 door de totale PM-7 te delen door het totale luchtvolume van de stroom of PM7 gewicht (opgenomen in stap 1.1.3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Castillo, J. A., Staton, S. J. R., Taylor, T. J., Herckes, P., Hayes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+feasibility+of+bioaerosol+analysis+as+a+novel+fingerprinting+technique.">Exploring the feasibility of bioaerosol analysis as a novel fingerprinting technique.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (1), 15-26 (2012).</li><li>Franze, T., Weller, M. G., Niessner, R., P&#246;schl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nitration+by+polluted+air.">Protein nitration by polluted air.</a> Environmental Science &amp; Technology. 39 (6), 1673-1678 (2005).</li><li>Abe, R. Y., Akutsu, Y., Kagemoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+amino+acids+as+markers+for+biological+sources+in+urban+aerosols.">Protein amino acids as markers for biological sources in urban aerosols.</a> Environmental Chemistry Letters. 14 (1), 155-161 (2016).</li><li>D'Amato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergenic+pollen+and+pollen+allergy+in+Europe.">Allergenic pollen and pollen allergy in Europe.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 62 (9), 976-990 (2007).</li><li>Bolzacchini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-phase+reaction+of+phenol+with+NO3.">Gas-phase reaction of phenol with NO3.</a> Environmental Science &amp; Technology. 35 (9), 1791-1797 (2001).</li><li>Shiraiwa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphase+chemical+kinetics+of+the+nitration+of+aerosolized+protein+by+ozone+and+nitrogen+dioxide.">Multiphase chemical kinetics of the nitration of aerosolized protein by ozone and nitrogen dioxide.</a> Environmental Science &amp; Technology. 46 (12), 6672-6680 (2012).</li><li>Gruijthuijsen, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitration+enhances+the+allergenic+potential+of+proteins.">Nitration enhances the allergenic potential of proteins.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 141 (3), 265-275 (2006).</li><li>Kubo, M., Ogino, K., Tsukahara, H., Kaneko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Procedures+for+Nitrative/Nitrosative+Stress.">Analytical Procedures for Nitrative/Nitrosative Stress.</a> Studies on Pediatric Disorders. , 149-158 (2014).</li><li>Thomson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-nitrotyrosine+modified+proteins+in+atherosclerosis.">3-nitrotyrosine modified proteins in atherosclerosis.</a> Disease Markers. 2015, 708282 (2015).</li><li>Kuhn, D. M., Sakowski, S. A., Sadidi, M., Geddes, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrotyrosine+as+a+marker+for+peroxynitrite-induced+neurotoxicity:+the+beginning+or+the+end+of+the+end+of+dopamine+neurons?.">Nitrotyrosine as a marker for peroxynitrite-induced neurotoxicity: the beginning or the end of the end of dopamine neurons?.</a> Journal of Neurochemistry. 89 (3), 529-536 (2004).</li><li>Teixeira, D., Fernandes, R., Prud&#234;ncio, C., Vieira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Nitrotyrosine+quantification+methods:+Current+concepts+and+future+challenges.">3-Nitrotyrosine quantification methods: Current concepts and future challenges.</a> Biochimie. 125, 1-11 (2016).</li><li>Hitomi, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposition+of+protein-bound+3-nitrotyrosine+in+rat+plasma+analysed+by+a+novel+protocol+for+HPLC-ECD.">Disposition of protein-bound 3-nitrotyrosine in rat plasma analysed by a novel protocol for HPLC-ECD.</a> Journal of Biochemistry. 141 (4), 495-502 (2007).</li><li>Ogino, K., Wang, D. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+oxidative/nitrosative+stress:+an+approach+to+disease+prevention.">Biomarkers of oxidative/nitrosative stress: an approach to disease prevention.</a> Acta Medica Okayama. 61 (4), 181-189 (2007).</li><li>Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. -. T., Gutzki, F. -. M., Stichtenoth, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+3-nitrotyrosine+in+human+urine+at+the+basal+state+by+gas+chromatography-tandem+mass+spectrometry+and+evaluation+of+the+excretion+after+oral+intake.">Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 827 (1), 146-156 (2005).</li><li>Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+particulate+matter+and+ozone+with+3-nitrotyrosine+in+the+atmosphere.">Relationship of particulate matter and ozone with 3-nitrotyrosine in the atmosphere.</a> Environmental Pollution. 236, 948-952 (2018).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit artikel beschrijft een kwantificering methode om te evalueren van 3-NT airborne pm verzameld op de quartz-filters met behulp van zeer gevoelige HPLC-ECD technieken.
In het algemeen zijn 3-NT meetmethoden ontwikkeld als biomarkers voor oxidatieve stress in ziekten bij de mens. Antilichamen gebaseerde methoden (bijvoorbeeld, de enzym-verbonden immunosorbent analyse) worden beschouwd als semi-kwantitatieve omdat er geen strikte assay validatie en het is moeilijk te beoordelen van de betrouwbaarheid van de test. HPLC met elektrochemische detectie (ECD) en massa spectrometrie gebaseerde testen hebben voldoende gevoeligheid voor de kwantificering van 3-NT13. Hoewel ze gevoelig zijn, massa spectrometrie gebaseerde methoden als GC-MS of GC-MS/MS vereisen de bewerking van aminozuren, en het proces van bewerking vaak resulteert in de vorming van artefacten14.
In vergelijking met zowel de GC en LC technieken, HPLC-ECD is relatief goedkoper en heeft een voldoende gevoeligheid voor maatregel 3-NT. Daarnaast de bewerking stap in GC-MS en LC-MS vereist vaak extra tijd. Hoewel de hier gepresenteerde methode 16 uur voor de eiwit spijsvertering stap vereist, het kan echter worden uitgevoerd overnachting (zoals hierboven beschreven, ongeveer 30 minuten van hands-on tijd is vereist per monster). Automatische herhaalde meting met behulp van een autosampler voorschrijven een meetsysteem met hoge gegevensdoorvoer. Eerdere studies hebben gemeld immunologische methoden voor het meten van 3-NT in PM2,7; dergelijke methoden kon echter niet 3-NT detecteren in het winterseizoen als gevolg van de lage niveaus van 3-NT in de PM-15.
De methode HPLC-ECD heeft extra voordelen ten opzichte van andere standaardmethoden; bijvoorbeeld, (i) een extractieproces is niet vereist in deze methode, (ii) het is volledig vrij van wasmiddel, (iii) het heeft minimal steekproef eis en, belangrijker, (iv) het heeft hoge gevoeligheid. Deeltjes die zijn verzameld op filters zijn vaak gescheiden met het ultrasoonapparaat voor verdere onderzoeken, met inbegrip van de kwantificering van verschillende componenten. Wasmiddelen worden ook gebruikt voor het isoleren van PM-gebonden eiwitten van filters. Echter deze extra stappen het risico van verontreiniging, verlies van de steekproef en onderschatting als gevolg van de extractie-efficiëntie verhogen, en anderzijds de meeste wasmiddelen zijn onverenigbaar met LC/MS. In de huidige methode van de HPLC-ECD, kunnen HPLC monsters gemakkelijk worden gescheiden van het filter met behulp van een eenvoudige holle punch en zonder het vereiste van een extra sample voorbereidingsproces. Het gebied van het rond-gevormde monster is 28.3 mm2, die zeer klein vergeleken met de grootte van de oorspronkelijke quartz-filter is (8 x 10 inch = 203,2 x 254 mm = 51,600 mm2).
De HPLC-ECD voorwaarde is zorgvuldig onderzocht om te voorkomen storingen bij het 3-NT-signaal, zoals eerder beschreven12. Een sterke zure pH van de mobiele fase en een adequate concentratie van acetonitril is belangrijk voor de detectie. Met behulp van deze voorwaarden, kunnen andere verbindingen, met inbegrip van nitro basis, worden losgekoppeld van nitrotyrosine. De tegenwoordige toestand is geschikt voor de opsporing van 3-NT, op monsters met een verschillende fysieke eigenschappen (b.v., zwevende deeltjes en plasma).
Om te kunnen evalueren 3-NT in de lucht, de meting van het gewicht van de filter en de afschaffing van de achtergrond zijn kritische stappen. In het algemeen, over ongeveer 100 mg PM7 worden verzameld over een periode van vier tot zeven dagen; echter verschillende factoren van invloed op het gewicht van de filter voor en na de PM-7 collectie, met inbegrip van vochtigheid en statische elektrische lading. Ter vermijding van deze effecten, moet de stabilisatie van het gewicht van de filter voor lange periodes onder subequal temperatuur en vochtigheid. De locatie waar het elektronische evenwicht is geïnstalleerd moet worden gehandhaafd in een stabiele omgeving. Voor de bereiding van de monsters is het belangrijk om de effecten van de achtergrond van de niet-specifieke protease cocktail of het membraan van ultrafiltratie, waaruit vaak een soortgelijk piek bij 3-NT te corrigeren.
Deze methode kan worden toegepast op andere deeltjes, met inbegrip van die in overdekte omgevingen. De nitratie van eiwitten kan verhogen hun allergene potentiële2. Deze methode kan daarom helpen te evalueren van milieu reinheid en preventie van nitrosative stress.
In deze studie rapporteren we een hooggevoelige meetmethode voor sfeervolle 3-NT van sampler luchtfilters gemakkelijk te bedienen en goedkoop apparaat. De generatie van de 3-NT in de atmosfeer wordt geassocieerd met milieuverontreinigende stoffen zoals O3, geen2PM eiwitten en meteorologische elementen die invloed op menselijke allergeniteit. Kortom, kan de methode ontwikkeld in het kader van onderhavig onderzoek bijdragen aan het beoordelen van de atmosferische reactie van O3, verschillende verontreinigende stoffen en PM eiwitten onder verschillende weersomstandigheden. Met deze inspanningen om de HPLC-ECD voor een schatting van 3-nitrotyrosine in de atmosfeer te ontwikkelen, verwachten we een beter milieu netheid, verbetering van de gezondheid van de mens.

Aërosol of airborne PM bevat eiwitten uit verschillende biologische oorsprong, met inbegrip van virussen, prokaryoten, schimmels, planten (stuifmeel) en dieren (insecten, mens)1. De verhouding van het eiwitgehalte in PM wordt geschat op bijna 5%, die betrokken is geweest om te spelen een belangrijke rol als een airborne allergeen2. Uit recente rapporten blijkt dat stedelijke ambient aërosol van verschillende maten met ratio's variërend tussen 0,5% en 2%3aminozuren bevatten. Bovendien, hebben chemische wijzigingen van PM eiwitten gesuggereerd worden gegenereerd door de reacties van eiwitten met verschillende verontreinigende stoffen, zoals O3stikstofdioxide (NO2) en zwaveldioxide (SO2)4.
3-NT — een eiwit wijziging — wordt gegenereerd door de nitratie van tyrosine residuen. Een hogere concentratie van O3 en2 is aangetoond dat het bevorderen van de nitratie van eiwitmolecules in pseudo-sfeervolle ruimte5,6. De nitratie van tyrosine residuen in de polypeptide keten verbetert het allergeen potentieel van stuifmeel eiwitten7. Dus, het kwantificeren en beoordelen van airborne 3-NT is een belangrijk aspect bij het aanpakken van de zorgen van de milieu-gerelateerde gezondheid.
3-NT is ook bekend als een biomarker van oxidatieve en nitrosative8te benadrukken. Een opkomende lichaam van bewijsmateriaal blijkt een significante associatie van 3-NT inhoud met verschillende ziekten bij de mens9,10. Als gevolg van de schadelijke gevolgen ervan houdt de opsporing en de kwantitatieve schatting van 3-NT in een biologische steekproef groot belang bij het bepalen van de toestand van iemands gezondheid. In de afgelopen jaren diverse methoden voor het inschatten van de 3-NT-inhoud, met inbegrip van enzyme-linked immunosorbent assays, HPLC, bijgekomen en LC/MS11. In eerdere studies, hebben we een opsporingsmethode met behulp van de techniek van de HPLC-ECD geschonken met verschillende voordelen ten opzichte van eerdere methoden gemeld. De HPLC-ECD hoeft bijvoorbeeld niet een extractie of bewerking uit te voeren waardoor het een relatief eenvoudige assay systeem12. Wij hebben bevestigd dat deze methode toepasselijk is voor het detecteren van 3-NT, op biologische monsters (plasma van menselijke en rat).
Hoewel vele onderzoeken hebben gewezen op de opsporing van 3-NT in biologische monsters, de detectie in nonbiological monsters blijft ongrijpbaar, en vandaar de huidige studie heeft uitgeoefend. In feite, om te beoordelen van het schadelijke effect van lucht 3-NT, een kwantitatieve methode die nuttig is om te ontdekken 3-NT rechtstreeks van deeltjes in de lucht is vereist; Daarom, pasten we de bestaande HPLC-ECD methode om te ontdekken 3-NT van PM2.5 op een glasvezel filter verzamelde. Met behulp van de techniek, 3-NT kon worden opgespoord rechtstreeks van kleine stukken (6 mm diameter ronde gaten) van het monster van een PM collectie filter. We verder geëvalueerd van de inhoud van 3-NT voor verschillende PM maten en gemeten van de detectiegrens van 3-NT. Dit artikel stelt een hoog-gevoelige en high-throughput methode voor het detecteren van 3-NT rechtstreeks vanuit zowel nonbiological en biologische monsters.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:940px;" width="940">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Quartz filter, backup quartz filter</td>
			<td style="width:240px;">PALL life sciences</td>
			<td style="width:168px;">7204</td>
			<td style="width:293px;">Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High-volume air sampler</td>
			<td style="width:240px;">SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td>
			<td style="width:168px;">HV-1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Particle size selector for SPM</td>
			<td style="width:240px;">SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td>
			<td style="width:168px;">080130-061</td>
			<td style="width:293px;">SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter.&#160; SPM is almost identical to PM7.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low-volume air sampler</td>
			<td style="width:240px;">SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td>
			<td style="width:168px;">AH-600F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Size classification unit for PM2.5</td>
			<td style="width:240px;">SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td>
			<td style="width:168px;">AH-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">Quartz filters for classification (PM4.5&#8211;2.5, PM7.3&#8211;4.5, PM15&#8211;7.3, and TSP-PM15)</td>
			<td style="width:240px;">Tokyo Dylec</td>
			<td style="width:168px;">AHQ-630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Non-specific protease cocktail</td>
			<td style="width:240px;">Roche</td>
			<td style="width:168px;">11459643001</td>
			<td style="width:293px;">Pronase from Streptomyces griseus&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">3-Nitrotyrosine</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td style="width:168px;">N7389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ultrafiltration membranes</td>
			<td style="width:240px;">Millipore</td>
			<td style="width:168px;">UFC5010BK</td>
			<td style="width:293px;">AMICON ULTRA 0.5 mL - 10kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">ECD</td>
			<td style="width:240px;">Eicom</td>
			<td style="width:168px;">HTEC-500, PEC-510</td>
			<td style="width:293px;">standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">HPLC column</td>
			<td style="width:240px;">Eicom</td>
			<td style="width:168px;">SC-5ODS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Data processor</td>
			<td style="width:240px;">Eicom</td>
			<td style="width:168px;">EPC-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Injector</td>
			<td style="width:240px;">Hitachi High-Tech Science&#160;</td>
			<td style="width:168px;">L-7200</td>
			<td style="width:293px;">Auto sampler</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Analyzing software</td>
			<td style="width:240px;">eDAQ Japan</td>
			<td style="width:168px;">ES280&#160;</td>
			<td style="width:293px;">PowerChrom software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of 3-nitrotyrosine in atmospheric environments via a high-performance liquid chromatography-electrochemical detector system

3-nitrotyrosine (3-NT) wordt gegenereerd uit de tyrosine residuen in atmosferische bio-aerosol eiwitten via een reactie met ozon (O3) en stikstofdioxide (NO2). Stabiele 3-NT is een specifieke marker voor oxidatieve schade en wordt gemeld dat een promotive effect te verduidelijken met allergieën. In de huidige studie rapporteren we de ontwikkeling van een hooggevoelige test te kwantificeren 3-NT in sampler luchtfilters voor het verzamelen van < 2,5 µm van zwevende deeltjes (PM2.5) uit stedelijk milieu lucht, met inbegrip van bio-aerosol. Bij deze methode wordt een 6 mm-diameter ronde gat was gesneden uit de filters van de lucht samplers en gemengd met een niet-specifieke protease cocktail om te hydrolyseren van eiwitten. Verteerd naar het niveau van het aminozuur EiwitSteekproeven werden getest voor 3-NT met behulp van een krachtige vloeibare chromatografie-elektrochemische detector (HPLC-ECD). Het maximumgehalte voor 3-NT werd ontdekt in een voorfilter voor PM van maten van 4.5 tot 7.3 μm, met een detectiegrens van 1.13 pg/m3.

De HPLC-ECD-principe is eenvoudig. Monsters met het doel worden gescheiden door de HPLC-kolom en de mobiele fase en de gescheiden doel compound is gereduceerd en/of geoxideerd in de elektrochemische detector.
In de HPLC-ECD-systeem, wordt een piek 3-NT ontdekt in ongeveer 22 minuten. ECDs (PEC-510 en HTEC-500) zijn aangesloten parallel in de HPLC-lijn. De eerste ECD vermindert de hydroxylgroepen in de verbindingen en de volgende oxideert de verminderde chemische stoffen. ECDs hebben een zeer gevoelige detectiebereik van 10-15 M. De detectiegrens van de HPLC-ECD-systeem was 1.13 pg/m3, waarin werd berekend als het gemiddelde basale signaal (mV) van 10 delen x 3.
Representatieve chromatogrammen worden weergegeven in Figuur 4. Door het analyseren van een pure 3-NT-standaard, een definitieve piek met een stabiele basislijn kan worden waargenomen (figuur 4A). 3-NT in PM7 werd ook gemeten met behulp van 6 mm, rond-gevormde monsters (figuur 4B).
Met betrekking tot de nauwkeurigheid van de 3-NT detectievermogen, toen een 3-NT-standaard werd geïnjecteerd in de HPLC, was de piek overeenkomt met 3-NT gedetecteerd op een retentietijd van 20 minuten. In PM monsters, 3-NT was gescheiden van andere stoffen, en de onafhankelijke piek werd ontdekt tegelijkertijd behoud als de standaard. Een typische standaard curve is afgebeeld in Figuur 5, waar de lineariteit is waargenomen tussen 5 en 40 nM. Lineariteit kan worden gezien tot 500 nM (gegevens niet worden weergegeven).
Tabel 1 toont de inhoud van de 3-NT in de atmosfeer, berekend als pg/m3 lucht. De hoogste concentratie van 3-NT in een PM2.5 voorfilter werd waargenomen in #3 (PM7.3-4.5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig1.jpg"> Figuur 1 : Collectie regeling voor TSP, PM7en PM2.5. (A) de totale zwevende deeltjes (TSP) worden verzameld rechtstreeks op een collectie filter (op een debiet van 1.000 L/min). (B) wanneer PM7 is verzameld, grote deeltjes zijn uitgesloten door een grootte selector (op een debiet van 1.000 L/min). (C) PM2.5 wordt verzameld door vier voorfilters (op een debiet van 116 L/min). Een quartz-filter wordt gewoonlijk gebruikt als een back-up filter voor PM7 en PM2.5 of als een collectie filter voor TSP, zoals in deze afbeelding. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig2.jpg"> Figuur 2 : Voorbereiding van een 6 mm-ronde cirkel. De collectie filter werd gesneden een holle punch tool gebruiken met een 6 mm diameter. Vervolgens was het monster opgeslagen in een 1,5 mL microtube. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig3.jpg"> Figuur 3 : Schematisch diagram van het HPLC-ECD systeem. 3-NT in een ingespoten steekproef werd gescheiden in de HPLC-kolom via welke mobiele fase stroomt. De 3-NT was teruggebracht tot aminotyrosine, geoxideerd tot iminotyrosine en elektrochemisch gedetecteerd in de detector. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig4.jpg"> Figuur 4 : Typisch chromatogrammen in het systeem van HPLC-ECD. (A) Pure 3-NT geanalyseerd door de HPLC-ECD-systeem. (B) 6 mm cirkel monster uit een PM7 filter gebruikt om te ontdekken 3-NT. Een piek 3-NT wordt aangegeven door een pijl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig5.jpg"> Figuur 5 : Standaard curve van pure 3-NT monsters. De resultaten bij een lagere concentratie worden aangegeven in een ander diagram. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Onderwerp</td>
			<td>Dagen van Collectie</td>
			<td>Plek</td>
			<td>3-NT (pg/m3 lucht)</td>
		</tr>
<tr>
<td>PM2, 5</td>
			<td>Voorfilter #1</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>8.25 ± 0.37</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Voorfilter #2</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>29.66 ± 1.94</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Voorfilter #3</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>74.37 ± 4.09</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Voorfilter #4</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>32.70 ± 0.75</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Backfilter</td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
			<td>4.21 ± 0.91</td>
		</tr>
<tr>
<td>PM7</td>
			<td>Backfilter</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>89.16 ± 6.36</td>
		</tr>
<tr>
<td>THEELEPEL</td>
			<td>Filter</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>10.34 ± 2.09</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: 3-NT in de atmosfeer gemeten door het systeem van HPLC-ECD. De 6 mm ronde vlekken van elk filter werden gemeten met behulp van het HPLC-ECD-systeem. Voorfilters #1 - #4 werden verzameld in dezelfde periode. Merk op dat de concentraties van 3-NT in de lucht worden beïnvloed door verschillende factoren, zoals de verzamelde datum, jaar, of locatie. De gegevens (n = 3-10) zijn vertegenwoordigd als de gemiddelde ± de standaardfout.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System at JoVE.com

Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System

Presenteren we een methode voor het detecteren van 3-nitrotyrosine chemische wijzigingen van atmosferische eiwitten met 6 mm diameter rondes gesneden uit lucht sampler voorfilters met behulp van een krachtige vloeibare chromatografie-elektrochemische detector (HPLC-ECD).

Detectie van 3-Nitrotyrosine in de atmosferische omgeving via een High-performance Liquid Chromatography-elektrochemische Detector systeem

3-nitrotyrosine (3-NT) is generated from the tyrosine residue in atmospheric bio-aerosol proteins via a reaction with ozone (O3) and nitrogen dioxide ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in milieu-onderzoek over Nitrapyrin en 3-nitrotyrosine. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een unieke en zeer gevoelige methode is voor het detecteren van 3-nitrotyrosine op luchtmonsterfilters. Om totale zwevende deeltjes of deeltjes van minder dan zeven micron groot te verzamelen, weegt u eerst een binder 3 kwartsfilter en bevestigt u het op een luchtmonsternemer met een hoog volume. Bedek het filter met een deeltjesgroottekiezer om PM7 te verzamelen of laat het filter onbedekt om de totale zwevende deeltjes te verzamelen. Voer de luchtmonsternemer zeven dagen lang continu uit op 1000 liter per minuut. Laad de voorfilters in een classificatie-eenheid voor grootte en installeer de grootteclassificatie-eenheid en een back-upfilter op de luchtmonsternemer met een laag volume. Voer de luchtmonsterer zeven dagen lang continu op 116 nesten per minuut om PM2.5 op het back-upfilter te verzamelen. Wanneer de bemonstering is voltooid, wordt het totale stroomvolume geregistreerd. Weeg het filter af en bereken het gewicht van de verzamelde deeltjes. Verzegel het filter in een plastic zak en bewaar het op 30 graden Celsius.Vervolgens bereiden 500 microliters van 6X niet-specifieke protease cocktail en acetaat buffer en plaats het in een dalasis membraan met een moleculair gewicht cutoff van 5000 daltons. Dompel het gevulde membraan onder in 1 L van de acetaatbuffer en roer het 24 tot 36 uur op 4 graden Celsius en vervang de buffer elke 12 uur om ondogend 3-Nitrotyrosine en Nitrite te verwijderen.Meet vervolgens de eiwitconcentratie in de gedialyseerde proteaseoplossing met een bicinononinic zuur-eiwittest. Verwijder daarna een filter uit de vriezer en laat het opwarmen tot kamertemperatuur terwijl het nog steeds in de zak wordt verzegeld. Sla vervolgens tot vijf 6 millimeter brede cirkels uit het overdekte deel van het filter en plaats de cirkels in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Bereid 300 microliter acetaatbuffer voor met 50

Research

JoVE Journal

Environment

Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Optimaliseer Rookgas instellingen ter bevordering van microalgen groei in fotobioreactoren via Computersimulaties

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Tracking Microbial Contamination in Retail Environments Using Fluorescent Powder - A Retail Delicatessen Environment Example

Tracking microbiële verontreiniging in Retail Environments met fluorescerende poeder - Een Retail Delicatessen Milieu Voorbeeld

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne ...

Exploring the Effects of Atmospheric Forcings on Evaporation: Experimental Integration of the Atmospheric Boundary Layer and Shallow Subsurface

Het verkennen van de gevolgen van atmosferische forcering bij verdamping: Experimentele Integratie van de atmosferische grenslaag en ondiepe ondergrond

Evaporation is directly influenced by the interactions between the atmosphere, land surface and soil subsurface. This work aims to experimentally study ...

Laboratory Simulation of an Iron(II)-rich Precambrian Marine Upwelling System to Explore the Growth of Photosynthetic Bacteria

Laboratory Simulation of an IronII-rich Precambrian Marine Upwelling System to Explore the Growth of Photosynthetic Bacteria

Laboratorium Simulatie van een ijzer (II) -rijke Precambrium Marine Upwelling Systeem om Ontdek de groei van de fotosynthetische bacteriën

A conventional concept for the deposition of some Precambrian Banded Iron Formations (BIF) proceeds on the assumption that ferrous iron [Fe(II)] upwelling ...

Extraction and Characterization of Surfactants from Atmospheric Aerosols

Extractie en karakterisering van Surfactants van atmosferische aërosolen

Surface-active compounds, or surfactants, present in atmospheric aerosols are expected to play important roles in the formation of liquid water clouds in ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Meten en in kaart brengen van patronen van bodemerosie en afzetting aan de bodem carbonaat concentraties onder beheer van de landbouw gerelateerde

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

On-Site moleculaire detectie van bodem-gedragen planteziekteverwekkers met behulp van een draagbare Real-Time PCR-systeem

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

In Situ Hybridisatie technieken voor paraffine-ingebedde volwassen koraal monsters

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

Sampling, Sorting, and Characterizing Microplastics in Aquatic Environments with High Suspended Sediment Loads and Large Floating Debris

Bemonstering, sorteren en karakteriseren van Microplastics in aquatische milieus met hoge zwevende sedimenten ladingen en grote zwevend puin

The ubiquitous presence of plastic debris in the ocean is widely recognized by the public, scientific communities, and government agencies. However, only ...