Name: detection of 3-nitrotyrosine in atmospheric environments via a high-performance liquid chromatography-electrochemical detector system
Uploaded: 2019-01-30T12:30:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System at JoVE.com

Les auteurs remercient Masayuki Kubo de la US Environmental Protection Agency pour son aide avec l’échantillonnage de2,5 c. à thé/PM. Ce travail a été en partie soutenu par JSPS KAKENHI Grant nombre JP16K15373 et JP18H03039.

1. collection de Total suspendu particules PM2,5, ou PM7et la méthode d’hydrolyse de protéines de PM
<ol><li>Recueillir le PM d’un filtre pré-filtre ou de sauvegarde.<ol>
<li>Avant la collecte de particules totales en suspension (TSP) et PM2,5PM7, peser le filtre à quartz. Remarque : Étant donné que la contamination par les peptides et les protéines de PM ne devrait pas affecter la détection de la nitration de la tyrosine (car ils n’ont pas un tel groupe de nitro), on n’a pas traité le filtre quartz à haute température avant la mesure. En outre, 3-NT contenu dans le filtre à quartz a été sous la limite de détection, tel que déterminé par HPLC-DCE.</li>
		<li>Définissez le filtre quartz sur un échantillonneur d’air grand volume avec un sélecteur de taille de particule de recueillir PM7 à un débit de 1 000 L/min en continu pendant 7 jours (Figure 1 b). TSP peut être recueillie sur un filtre quartz sans un sélecteur de taille (Figure 1 a).</li>
		<li>Recueillir des PM2,5 en utilisant un échantillonneur d’air de faible volume avec une unité de classification de taille à un débit de 116 L/min en continu pour 7 d. à l’aide de cet appareil, les particules peuvent être classés comme PM4,5 à 2,5PM7.3-4.5, PM15-7,3et TSP-PM15 et collecté sur des filtres de quartz pour la classification. PM2.5 peuvent être collectées sur un filtre de sauvegarde (Figure 1).</li>
		<li>Noter le volume de débit total au moment de la collecte de filtre. Mesurer le poids de la FST, PM2,5et PM7 sur les filtres en soustrayant le poids précollecte du poids postcollection. Sceller le filtre dans un sac plastique et conserver à-30 ° C jusqu'à l’étape suivante (voir chapitre 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proteolyze les échantillons.<ol>
<li>Dissoudre le cocktail de la protéase non spécifique avec un tampon d’acétate 0,1 M (pH 7,4). Mettre la solution dans une membrane de dialyse (poids moléculaire coupure = 5 000 Da) et plongez-le dans 1 L de tampon acétate 0,1 M en agitant à 4 ° C. Remplacer le tampon 2 x toutes les 12 h et puis effectuez dialyse pendant la nuit afin d’éliminer 3-NT endogène et nitrite (NO2–). Après la dialyse, recueillir la solution et à mesurer la concentration de la protéine par bicinchoninic acide dosage des protéines (BCA).</li>
		<li>Perforer des cercles ronds de 6 mm sur le préfiltre ou le filtre sauvegarde et mettez-les dans des microtubes. Jusqu'à cinq morceaux des fractions de 6 mm peut être utilisé pour l’analyse (Figure 2).</li>
		<li>Ajouter 300 µL de tampon d’acétate 0,1 M contenant 50 µg de protéines de la protéase non spécifique cocktail (préparé à l’étape 1.2.1) au tube d’hydrolyser les protéines de PM à 50 ° C pendant 16 h avec rotation. Remarque : Pour soustraire endogène 3-NT de la solution cocktail de protéase non spécifique, il est nécessaire de préparer et de digérer un échantillon de cocktail uniquement de protéase non spécifique.</li>
		<li>Rincer la membrane d’ultrafiltration avec son tube fourni en ajoutant 0,1 M de tampon acétate et centrifugation (10 000 x g pendant 30 sec ; la vitesse exacte dépend de la membrane), due à la contamination des produits chimiques similaires à 3-NT dans la membrane. Répéter le rinçage 1 x.</li>
		<li>Après protéolyse, centrifuger les échantillons à 2 500 g pendant 10 min. charge le surnageant dans la membrane d’ultrafiltration et il centrifuger à 10 000 x g et 4 ° C pour ultrafiltration (MWCO = 10 000), jusqu'à ce qu’un volume suffisant d’élution est collecté. Entreposer les éluats à 4 ° C à l’obscurité. Attention : En raison de la détection d’une crête semblable à 3-NT dans la colonne, il est nécessaire de le laver avec de l’eau propre ou avec un tampon comme eau de CLHP et un tampon d’acétate 0,1 M avant d’utiliser.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. dosage du NT-3 TSP, PM2,5et PM7via une High-performance Liquid Chromatography et système de détection électrochimique (HPLC-DCE)
Remarque : Voir la Figure 3.
<ol><li>Préparer la phase mobile.<ol>
<li>Préparer 0,2 M phosphate tamponné (pH 2,5) contenant 50 mg/L d’EDTA. Mesurer 98 volumes du tampon et deux volumes de l’acétonitrile (qualité CLHP), verser dans une bouteille en verre propre et mélanger vigoureusement avec un bouchon.</li>
		<li>Régler la phase mobile à température ambiante pendant plusieurs heures jusqu'à ce que l’air dissous est à plat. Remarque : Si le système est démarré plus tôt, la phase mobile peut être sonication et dégazée sous vide. Cependant, le dégazage excessif changera le rapport entre l’eau et la phase organique par évaporation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Le système HPLC-DPE se compose d’une pompe, une colonne HPLC, un dégazeur, un DPE et un injecteur. Equilibrez la phase mobile et stabiliser le système afin de réduire le fond et le bruit.<ol>
<li>Installer la phase mobile et la colonne HPLC dans le système de CLHP. Mettre en marche la pompe HPLC et stabiliser la colonne avec la phase mobile à un débit de 500 µL/min à 25 ° C température de la colonne du jour avant la date de début.</li>
		<li>Le lendemain, allumer la DPE et réglez les paramètres (la tension de réduction à -900 mV et la tension d’excitation de 400 mV). Stabiliser pendant au moins 3 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mesurer la concentration de NT-3 dans le PM7.<ol>
<li>Préparer les différentes concentrations de NT-3 normes (5-500 nM) et un blanc (sans la 3-NT standard et non-spécifique protéase cocktail, pour s’assurer que le flacon ni la mémoire tampon est contaminée) dans un tampon d’acétate 0,1 M.</li>
		<li>Exécutez le processeur de données HPLC.</li>
		<li>Mettre les flacons d’échantillon dans l’auto-injecteur et ensemble le volume d’injection à 25 µL. exploiter les mêmes conditions de phase mobile et débit tel que mentionné à l’étape 2.2.1. Remarque : Si la préparation est terminée, il faut des échantillons, un standard (5-500 nM), un échantillon de cocktail uniquement de protéase non spécifique et un flacon vide.</li>
		<li>Assurez-vous que la ligne de base dans le chromatogramme est plate et commencer l’injection de l’échantillon. Remarque : En général, 3-NT est détecté dans les 20-21 min ; Cependant, environ 30 min est recommandée comme le temps d’exécution par injection de l’échantillon. Dans le cas contraire, des pics de contaminant figureront dans la prochaine exécution.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. analyse des chromatogrammes et Quantification de la teneur en 3-NT en PM7
<ol><li>Vérifiez le pic 3-NT dans les chromatogrammes et calculer la teneur.<ol>
<li>Après la collecte de données, ouvrez le fichier de données de chromatogramme avec logiciel d’analyse.</li>
		<li>Tracez une ligne à travers le pic 3-NT de la ligne de base plate et lire la hauteur du pic de la ligne tracée. Remarque : La limite quantitative est d’environ 5 nM (125 fmol en une injection de 25 µL). Attention : L’électrode dans la DPE s’épuise lentement, et la limite sera élevée en raison du rapport signal/bruit.</li>
		<li>Préparer une courbe de régression des sommets standards 3-NT, calculer la pente et intercepter.</li>
		<li>Attribuer ces constantes dans l’équation suivante et calculer la teneur en 3-NT dans les échantillons comme suit. Exemple 3 – NT (nM) = [goûter pic – intercepter] / pente EQ. (1) Remarque : La courbe standard devrait être bien représentée qu’une ligne droite entre 5 nM et 500 nM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calculer le 3-NT dans l’environnement de l’air et le PM7 dans le flacon d’échantillon.<ol>
<li>Multiplier la concentration de NT-3 par le volume réactionnel (et le facteur de dilution, le cas échéant) et d’évaluer la teneur absolue en 3-NT dans PM7 du cercle.</li>
		<li>Mesurer la zone de filtres recueillis et calculer la teneur en 3-NT dans les particules totales7 filtre par l’équation suivante. Total PM7 = [3-NT contenu dans le PM7 du cercle] x [taux de la zone de filtre de7 PM à l’arrondissement] x 226.19 (dans le cas de la conversion moles grammes) EQ. (2)</li>
		<li>Évaluer le contenu de 3-NT dans l’environnement de l’air ou PM7 en divisant le total de PM7 par le volume d’air total ou PM7 poids (enregistré à l’étape 1.1.3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Castillo, J. A., Staton, S. J. R., Taylor, T. J., Herckes, P., Hayes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+feasibility+of+bioaerosol+analysis+as+a+novel+fingerprinting+technique.">Exploring the feasibility of bioaerosol analysis as a novel fingerprinting technique.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (1), 15-26 (2012).</li><li>Franze, T., Weller, M. G., Niessner, R., P&#246;schl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nitration+by+polluted+air.">Protein nitration by polluted air.</a> Environmental Science &amp; Technology. 39 (6), 1673-1678 (2005).</li><li>Abe, R. Y., Akutsu, Y., Kagemoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+amino+acids+as+markers+for+biological+sources+in+urban+aerosols.">Protein amino acids as markers for biological sources in urban aerosols.</a> Environmental Chemistry Letters. 14 (1), 155-161 (2016).</li><li>D'Amato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergenic+pollen+and+pollen+allergy+in+Europe.">Allergenic pollen and pollen allergy in Europe.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 62 (9), 976-990 (2007).</li><li>Bolzacchini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-phase+reaction+of+phenol+with+NO3.">Gas-phase reaction of phenol with NO3.</a> Environmental Science &amp; Technology. 35 (9), 1791-1797 (2001).</li><li>Shiraiwa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphase+chemical+kinetics+of+the+nitration+of+aerosolized+protein+by+ozone+and+nitrogen+dioxide.">Multiphase chemical kinetics of the nitration of aerosolized protein by ozone and nitrogen dioxide.</a> Environmental Science &amp; Technology. 46 (12), 6672-6680 (2012).</li><li>Gruijthuijsen, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitration+enhances+the+allergenic+potential+of+proteins.">Nitration enhances the allergenic potential of proteins.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 141 (3), 265-275 (2006).</li><li>Kubo, M., Ogino, K., Tsukahara, H., Kaneko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Procedures+for+Nitrative/Nitrosative+Stress.">Analytical Procedures for Nitrative/Nitrosative Stress.</a> Studies on Pediatric Disorders. , 149-158 (2014).</li><li>Thomson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-nitrotyrosine+modified+proteins+in+atherosclerosis.">3-nitrotyrosine modified proteins in atherosclerosis.</a> Disease Markers. 2015, 708282 (2015).</li><li>Kuhn, D. M., Sakowski, S. A., Sadidi, M., Geddes, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrotyrosine+as+a+marker+for+peroxynitrite-induced+neurotoxicity:+the+beginning+or+the+end+of+the+end+of+dopamine+neurons?.">Nitrotyrosine as a marker for peroxynitrite-induced neurotoxicity: the beginning or the end of the end of dopamine neurons?.</a> Journal of Neurochemistry. 89 (3), 529-536 (2004).</li><li>Teixeira, D., Fernandes, R., Prud&#234;ncio, C., Vieira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Nitrotyrosine+quantification+methods:+Current+concepts+and+future+challenges.">3-Nitrotyrosine quantification methods: Current concepts and future challenges.</a> Biochimie. 125, 1-11 (2016).</li><li>Hitomi, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposition+of+protein-bound+3-nitrotyrosine+in+rat+plasma+analysed+by+a+novel+protocol+for+HPLC-ECD.">Disposition of protein-bound 3-nitrotyrosine in rat plasma analysed by a novel protocol for HPLC-ECD.</a> Journal of Biochemistry. 141 (4), 495-502 (2007).</li><li>Ogino, K., Wang, D. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+oxidative/nitrosative+stress:+an+approach+to+disease+prevention.">Biomarkers of oxidative/nitrosative stress: an approach to disease prevention.</a> Acta Medica Okayama. 61 (4), 181-189 (2007).</li><li>Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. -. T., Gutzki, F. -. M., Stichtenoth, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+3-nitrotyrosine+in+human+urine+at+the+basal+state+by+gas+chromatography-tandem+mass+spectrometry+and+evaluation+of+the+excretion+after+oral+intake.">Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 827 (1), 146-156 (2005).</li><li>Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+particulate+matter+and+ozone+with+3-nitrotyrosine+in+the+atmosphere.">Relationship of particulate matter and ozone with 3-nitrotyrosine in the atmosphere.</a> Environmental Pollution. 236, 948-952 (2018).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cet article décrit une méthode de quantification pour évaluer 3-NT dans aéroporté PM recueillie sur les filtres quartz en utilisant des techniques HPLC-DCE hautement sensibles.
En général, les méthodes de mesure 3-NT ont été développés comme biomarqueurs du stress oxydatif dans les maladies humaines. Méthodes axées sur les anticorps (par exemple, le dosage immuno-enzymatique) sont considérés comme semiquantitative parce qu’il n’y a aucune validation de dosage strict et il est difficile d’évaluer la fiabilité du test. HPLC avec détection électrochimique (DCE) et les essais basé sur la spectrométrie de masse ont suffisamment de sensibilité pour la quantification des 3-NT13. Bien qu’ils soient sensibles, méthodes basées sur la spectrométrie de masse comme GC-MS ou GC-MS/MS exigent la dérivation des acides aminés, et le processus de dérivation souvent conduit à la formation des artefacts14.
Par rapport aux techniques de la LC et GC, HPLC-DCE est relativement moins cher et a une sensibilité suffisante à la mesure 3-NT. en outre, l’étape de dérivation en GC-MS et LC-MS nécessite souvent un délai supplémentaire. Bien que la méthode présentée ici nécessite 16 heures pour l’étape de digestion des protéines, elle peut, néanmoins, effectué pendant la nuit (comme décrit ci-dessus, environ 30 minutes de temps de pratique est nécessaire par exemple). Mesure de répétition automatique à l’aide d’un échantillonneur automatique peut prévoir un système de mesure de haut débit. Des études antérieures ont signalé des méthodes immunologiques pour mesurer 3-NT PM2,7; Cependant, ces méthodes pas peuvent détecter 3-NT dans la saison d’hiver en raison de la faiblesse de la 3-NT dans la PM15.
La méthode HPLC-DCE a des avantages supplémentaires par rapport aux autres méthodes standard ; par exemple, (i) un processus d’extraction n’est pas nécessaire dans cette méthode, (ii) il est complètement sans détergent, (iii) il a besoin de l’échantillon minimal et, surtout, (iv) il a une sensibilité élevée. Les particules qui sont collectées sur des filtres sont fréquemment séparés par sonication à des investigations supplémentaires, y compris la quantification des différents composants. Détergents sont également utilisés pour isoler les protéines liées à PM de filtres. Toutefois, ces étapes supplémentaires augmentent le risque de contamination, la perte de l’échantillon et une sous-estimation en raison de l’efficacité de l’extraction, et en outre, la plupart des détergents sont incompatibles avec la LC/MS. Dans la présente méthode HPLC-DCE, échantillons HPLC peuvent être facilement séparés du filtre à l’aide d’un simple coup de poing creux et sans l’obligation d’un processus de préparation d’échantillon supplémentaire. La zone de l’échantillon de forme ronde est 28,3 mm2, qui est très faible par rapport à la taille du filtre quartz original (8 x 10 pouces = 203,2 x 254 mm = 51 600 mm2).
La condition de HPLC-DCE a été examinée soigneusement pour éviter l’interférence au signal 3-NT, comme décrit plus haut12. Un pH acide solide de la phase mobile et une concentration suffisante de l’acétonitrile sont importants pour la détection. En utilisant ces conditions, les autres composés, y compris la base, nitro peuvent être séparés de nitrotyrosine. L’état actuel est approprié pour la détection des 3-NT des échantillons avec une autre propriété physique (p. ex., les matières particulaires et plasma).
Pour évaluer 3-NT dans l’air, la mesure de la masse de filtre et l’élimination de l’arrière-plan sont des étapes critiques. En général, sur environ 100 mg de PM7 sont collectées sur une période de quatre à sept jours ; Toutefois, plusieurs facteurs affectent le poids du filtre avant et après le prélèvement de7 PM, y compris l’humidité et la charge électrique statique. Pour éviter ces effets, la stabilisation du poids filtre pendant de longues périodes est nécessaire sous l’humidité et de température subégaux. L’emplacement d’installation de la balance électronique devrait être maintenue dans un environnement stable. Pour la préparation de l’échantillon, il est important de corriger les effets de fond de la protéase non spécifique du cocktail et la membrane d’ultrafiltration, qui font souvent preuve d’une crête semblable à 3-NT.
Cette méthode peut être appliquée aux autres particules, y compris ceux dans les environnements intérieurs. La nitration des protéines peut augmenter leur potentiel allergène2. Par conséquent, cette méthode peut aider à évaluer la propreté environnementale et prévenir le stress nitrosative.
Dans cette étude, nous présentons une méthode de mesure très sensibles pour atmosphérique 3-NT des filtres à air échantillonneur avec appareil facile à manipuler et peu coûteux. La génération de 3-NT dans l’atmosphère est associée à des polluants environnementaux tels que O3, N°2, protéines de PM et les éléments météorologiques qui affectent les humaine allergénicité. En conclusion, la méthode développée dans cette étude peut aider à évaluer la réaction atmosphérique de O3, divers polluants et protéines de PM dans diverses conditions météorologiques. Avec ces efforts de développement de HPLC-DPE pour une estimation de 3-nitrotyrosine dans l’atmosphère, nous prévoyons mieux la propreté environnementale, améliorer la santé humaine.

Aérosol ou aéroportée PM contient des protéines de différentes origines biologiques, y compris les virus, les procaryotes, champignons, plantes (pollen) et animaux (insectes, homme)1. Le rapport entre la teneur en protéines de PM est estimée à près de 5 %, ce qui a joué un rôle à jouer un rôle majeur comme un allergène aéroporté2. Des rapports récents suggèrent qu’aérosol ambiant urbain de diverses tailles contiennent des acides aminés avec ratios variant entre 0,5 % et 2 %3. En outre, des modifications chimiques des protéines de PM ont été suggérées pour être générés par les réactions des protéines avec divers polluants, tels que O3, dioxyde d’azote (NO2) et le dioxyde de soufre (SO2)4.
3-NT — une modification des protéines — est généré par la nitration des résidus tyrosine. Une concentration plus élevée de O3 et NO2 a été démontrée pour promouvoir la nitration des molécules de protéine dans l’espace pseudo-atmosphérique5,6. La nitration des résidus de tyrosine dans la chaîne polypeptidique améliore le potentiel allergène de pollen protéines7. Ainsi, la quantification et l’évaluation d’aéroporté 3-NT est un aspect important en répondant aux préoccupations de santé environnementale.
3-NT sont également connu sous le nom des biomarqueurs de l’oxydant et nitrosative insiste sur8. Un corps émergent de la preuve a montré une association significative de la teneur en 3-NT avec plusieurs maladies humaines9,10. En raison de ses effets néfastes, la détection et l’estimation quantitative des 3-NT dans un échantillon biologique tenir grande utilité dans la détermination de l’état de santé d’un individu. Ces dernières années, diverses méthodes ont été introduites pour estimer la teneur en 3-NT, y compris les dosages immuno-enzymatiques, HPLC et LC/MS11. Dans des études précédentes, nous avons rapporté une méthode de détection en utilisant la technique HPLC-DCE conférée avec plusieurs avantages par rapport aux méthodes précédentes. Par exemple, l’HPLC-DPE ne nécessite pas une procédure d’extraction ou de dérivation qui en fait un système relativement simple test12. Nous avons confirmé que cette méthode est applicable pour détecter 3-NT à partir d’échantillons biologiques (plasma de l’homme et le rat).
Bien que de nombreuses enquêtes ont insisté sur la détection des 3-NT dans des échantillons biologiques, sa détection dans des échantillons non biologiques reste insaisissable, et c’est pourquoi la présente étude a été poursuivie. En fait, pour évaluer les effets néfastes des aéroportés 3-NT, une méthode quantitative qui permet de détecter 3-NT directement à partir de particules est nécessaire ; par conséquent, nous avons appliqué la méthode HPLC-DCE existante pour détecter 3-NT de PM2.5 recueillies sur un filtre en fibre de verre. À l’aide de la technique, 3-NT a pu être détectée directement à partir de petites pièces (trous ronds de 6 mm de diamètre) de l’échantillon d’un filtre de collecte des PM. Plus loin, nous avons évalué le contenu de 3-NT pour différentes tailles de PM et mesurée à la limite de détection de 3-NT. Le présent article propose une méthode haute sensibilité et le haut débit pour détecter 3-NT directement à partir des échantillons tant biologiques et non biologiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:940px;" width="940">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Quartz filter, backup quartz filter</td>
			<td style="width:240px;">PALL life sciences</td>
			<td style="width:168px;">7204</td>
			<td style="width:293px;">Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High-volume air sampler</td>
			<td style="width:240px;">SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td>
			<td style="width:168px;">HV-1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Particle size selector for SPM</td>
			<td style="width:240px;">SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td>
			<td style="width:168px;">080130-061</td>
			<td style="width:293px;">SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter.&#160; SPM is almost identical to PM7.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low-volume air sampler</td>
			<td style="width:240px;">SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td>
			<td style="width:168px;">AH-600F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Size classification unit for PM2.5</td>
			<td style="width:240px;">SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td>
			<td style="width:168px;">AH-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">Quartz filters for classification (PM4.5&#8211;2.5, PM7.3&#8211;4.5, PM15&#8211;7.3, and TSP-PM15)</td>
			<td style="width:240px;">Tokyo Dylec</td>
			<td style="width:168px;">AHQ-630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Non-specific protease cocktail</td>
			<td style="width:240px;">Roche</td>
			<td style="width:168px;">11459643001</td>
			<td style="width:293px;">Pronase from Streptomyces griseus&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">3-Nitrotyrosine</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td style="width:168px;">N7389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ultrafiltration membranes</td>
			<td style="width:240px;">Millipore</td>
			<td style="width:168px;">UFC5010BK</td>
			<td style="width:293px;">AMICON ULTRA 0.5 mL - 10kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">ECD</td>
			<td style="width:240px;">Eicom</td>
			<td style="width:168px;">HTEC-500, PEC-510</td>
			<td style="width:293px;">standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">HPLC column</td>
			<td style="width:240px;">Eicom</td>
			<td style="width:168px;">SC-5ODS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Data processor</td>
			<td style="width:240px;">Eicom</td>
			<td style="width:168px;">EPC-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Injector</td>
			<td style="width:240px;">Hitachi High-Tech Science&#160;</td>
			<td style="width:168px;">L-7200</td>
			<td style="width:293px;">Auto sampler</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Analyzing software</td>
			<td style="width:240px;">eDAQ Japan</td>
			<td style="width:168px;">ES280&#160;</td>
			<td style="width:293px;">PowerChrom software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of 3-nitrotyrosine in atmospheric environments via a high-performance liquid chromatography-electrochemical detector system

3-nitrotyrosine (3-NT) est généré à partir du résidu tyrosine en bio-aérosols atmosphériques protéines via une réaction avec l’ozone (O3) et de dioxyde d’azote (NO2). 3-NT stable est un marqueur spécifique des dommages oxydatifs et aurait un effet promoteur pour provoquer des allergies. Dans la présente étude, nous rapportons l’élaboration d’un dosage très sensible pour quantifier 3-NT dans les filtres à air échantillonneur de recueillir < 2,5 µm de particules fines (PM2.5) de l’air environnement urbain, y compris les bio-aérosols. Dans cette méthode, un diamètre de 6 mm trous ronds fut coupé des filtres des échantillonneurs d’air et mélangés avec une cocktail de protéase non spécifique afin d’hydrolyser les protéines. Les échantillons de protéines digérées au niveau des acides aminés ont été testés pour 3-NT à l’aide d’un détecteur électrochimique-chromatographie liquid haute performance (HPLC-DCE). La teneur maximale en 3-NT a été détectée dans un préfiltre pour les particules de tailles de 4,5 à 7,3 µm, avec une limite de détection de 1,13 pg/m3.

Le principe de l’HPLC-DCE est simple. Les échantillons contenant la cible sont séparés par la colonne HPLC et la phase mobile, et le composé cible séparées est réduit et/ou oxydé dans le détecteur électrochimique.
Dans le système HPLC-DCE, un pic de 3-NT est détecté en 22 minutes environ. Livrets (PEC-510 et HTEC-500) sont montées en série dans la ligne de CLHP. La premier DPE réduit les groupements hydroxyles dans les composés, et l’autre s’oxyde aux réduction des produits chimiques. Livrets ont une portée de détection très sensible de 10-15 M. La limite de détection du système HPLC-DCE était 1.13 pg/m3, qui a été calculé comme étant le signal moyens basal (mV) de 10 parties x 3.
Chromatogrammes représentatifs sont indiquées à la Figure 4. En analysant une norme 3-NT pure, un pic définitif avec une ligne de base stable peut être détectée (Figure 4 a). 3-NT en PM7 a également été mesuré à l’aide de 6 mm, forme ronde échantillons (Figure 4 b).
Quant à l’exactitude de la capacité de détection 3-NT, lorsqu’une norme 3-NT a été injectée en HPLC, le pic correspondant à 3-NT a été détecté à un temps de rétention de 20 minutes. Dans les échantillons de PM, 3-NT a été séparé des autres substances, et le sommet a été détecté dans le même temps de rétention que la norme. Une courbe d’étalonnage typique est illustrée à la Figure 5, où la linéarité est observée entre 5 et 40 nM. Linéarité peut être vu jusqu'à 500 nM (données non présentées).
Le tableau 1 montre le contenu de 3-NT dans l’atmosphère, calculée comme pg/m3 air. La plus forte concentration de NT-3 dans un préfiltre de2,5 PM a été observée dans #3 (PM7.3-4.5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig1.jpg"> Figure 1 : Système de collecte pour TSP, PM7et PM2,5. (A) les particules en suspension totales (TSP) sont recueillies directement sur un filtre de prélèvement (à un débit de 1 000 L/min). (B) lorsque PM7 sont recueillis, les grosses particules sont exclus par un sélecteur de taille (à un débit de 1 000 L/min). (C), PM2,5 sont collectées par le biais de quatre préfiltres (à un débit de 116 L/min). Un filtre quartz est couramment utilisé comme filtre sauvegarde pour PM7 et PM2,5 , ou comme un filtre de collection pour TSP, comme illustré dans cette figure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig2.jpg"> Figure 2 : Préparation d’un cercle de mm-ronde 6. Le filtre de prélèvement a été coupé à l’aide d’un outil de poinçon creux avec un diamètre de 6 mm. Ensuite, l’échantillon a été stocké dans un microtube 1,5 mL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig3.jpg"> Figure 3 : Schéma de principe du système HPLC-DCE. 3-NT dans un échantillon injecté a été séparé dans la colonne HPLC grâce qui coule de la phase mobile. Le 3-NT a été réduit à aminotyrosine, oxydée en iminotyrosine et détecté par voie électrochimique dans le détecteur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig4.jpg"> Figure 4 : Chromatogrammes typiques du système HPLC-DCE. (A) Pure 3-NT analysée par le système HPLC-DCE. Échantillon de cercle de 6 mm (B) d’un filtre de7 PM utilisés pour détecter 3-NT. Un pic de 3-NT est indiqué par une flèche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig5.jpg"> Figure 5 : Courbe d’étalonnage des échantillons purs de 3-NT. Les résultats à une concentration inférieure sont indiquées dans un autre graphique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Objet</td>
			<td>Jours de Collection</td>
			<td>Spot</td>
			<td>3-NT (pg/m3 air)</td>
		</tr>
<tr>
<td>PM2, 5</td>
			<td>Préfiltre #1</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>8,25 ± 0,37</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Préfiltre #2</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>29.66 ± 1,94</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Préfiltre #3</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>74.37 ± 4,09</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Préfiltre #4</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>32.70 ± 0,75</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Backfilter</td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
			<td>4.21 ± 0,91</td>
		</tr>
<tr>
<td>PM7</td>
			<td>Backfilter</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>89.16 ± 6.36</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. À THÉ</td>
			<td>Filtre</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>10,34 ± 2.09</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : 3-NT dans l’atmosphère mesurée par le système HPLC-DCE. Les taches circulaires de 6 mm de chaque filtre ont été mesurés en utilisant le système HPLC-DCE. Préfiltres #1 à #4 ont été recueillis dans la même période. Notez que les concentrations de NT-3 dans l’air sont influencées par divers facteurs, tels que la date collectée, année ou emplacement. Les données (n = 3-10) sont représentés comme la moyenne ± l’écart-type.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System at JoVE.com

Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System

Nous présentons une méthode pour détecter des modifications chimiques des protéines atmosphériques 3-nitrotyrosine avec 6 mm de diamètre tours coupés d’air échantillonneur préfiltres à l’aide d’un détecteur électrochimique-chromatographie liquid haute performance (HPLC-DCE).

Détection des 3-Nitrotyrosine dans des environnements atmosphérique via une haute performance système détecteur électrochimique-chromatographie en phase liquide

3-nitrotyrosine (3-NT) is generated from the tyrosine residue in atmospheric bio-aerosol proteins via a reaction with ozone (O3) and nitrogen dioxide ...

Cette méthode peut aider à répondre à la question clé dans la recherche environnementale sur nitrapyrine et 3-nitrotyrosine. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode unique et très sensible pour détecter la 3-nitrotyrosine sur les filtres à échantillon d’air. Pour recueillir le total des particules en suspension ou des particules de moins de sept microns, pesez d’abord un filtre liant de 3 litres et fixez-le sur un échantillonneur d’air à fort volume. Couvrez le filtre d’un sélecteur de taille de particule pour recueillir les PM7 ou laissez le filtre à découvert pour recueillir le total des particules en suspension. Faire fonctionner l’échantillonneur d’air à 1000 litres par minute en continu pendant sept jours. Chargez les pré-filtres dans une unité de classification de taille et installez l’unité de classification de taille et un filtre de secours sur l’échantillonneur d’air à faible volume. Exécutez l’échantillonneur d’air à 116 portées par minute en continu pendant sept jours pour recueillir pm2,5 sur le filtre de secours. Lorsque l’échantillonnage se termine, enregistrez le volume total du débit. Pesez le filtre et calculez le poids des particules collectées. Sceller le filtre dans un sac en plastique et le stocker à 30 degrés Celsius.Next préparer 500 microlitres de 6X cocktail protéase non spécifique et tampon d’acétate et le placer dans une membrane de dalasis avec une coupure de poids moléculaire de 5000 daltons. Immerger la membrane remplie dans 1 L du tampon d’acétate et remuer à 4 degrés Celsius pendant 24 à 36 heures, en remplaçant le tampon toutes les 12 heures pour enlever indogène 3-Nitrotyrosine et Nitrite.Then mesurer la concentration de protéines dans la solution de protéase dialysée avec un essai de protéines acides bicinchoniniques. Après cela, retirez un filtre du congélateur et laissez-le chauffer à température ambiante tout en étant scellé dans le sac. Puis poinçonner jusqu’à cinq cercles de 6 millimètres de large de la zone couverte de particules du filtre, et placer les cercles dans un tube de micro centrifugeuse de 1,5 millilitres. Préparer 300 microlitres de tampon d’acétate contenant 50

Research

JoVE Journal

Environment

Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Optimiser les réglages des gaz de combustion pour la promotion de la croissance des microalgues en photobioréacteurs via des simulations informatiques

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Recherche

Environnement

Tracking Microbial Contamination in Retail Environments Using Fluorescent Powder - A Retail Delicatessen Environment Example

Suivi de la contamination microbienne dans les environnements de vente au détail à l&#39;aide de poudre fluorescente - Un détail Charcuterie Environnement Exemple

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne ...

Exploring the Effects of Atmospheric Forcings on Evaporation: Experimental Integration of the Atmospheric Boundary Layer and Shallow Subsurface

Explorer les effets des forçages atmosphériques sur évaporation: l&#39;intégration expérimentale de la couche limite atmosphérique et de subsurface

Evaporation is directly influenced by the interactions between the atmosphere, land surface and soil subsurface. This work aims to experimentally study ...

Laboratory Simulation of an Iron(II)-rich Precambrian Marine Upwelling System to Explore the Growth of Photosynthetic Bacteria

Laboratory Simulation of an IronII-rich Precambrian Marine Upwelling System to Explore the Growth of Photosynthetic Bacteria

Laboratoire de simulation d&#39;un fer (II) riche système Upwelling précambrien Marine à explorer la croissance des bactéries photosynthétiques

A conventional concept for the deposition of some Precambrian Banded Iron Formations (BIF) proceeds on the assumption that ferrous iron [Fe(II)] upwelling ...

Extraction and Characterization of Surfactants from Atmospheric Aerosols

Extraction et caractérisation des tensio-actifs de l&#39;atmosphère Aérosols

Surface-active compounds, or surfactants, present in atmospheric aerosols are expected to play important roles in the formation of liquid water clouds in ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Mesure et cartographie des schémas d’érosion et de dépôt liées aux Concentrations de Carbonate du sol sous gestion agricole

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

Sur le site Molecular Detection of phytopathogènes transmises par le sol à l’aide d’un système PCR en temps réel Portable

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

In Situ Techniques d’hybridation pour échantillons de corail adultes paraffine

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

Sampling, Sorting, and Characterizing Microplastics in Aquatic Environments with High Suspended Sediment Loads and Large Floating Debris

Échantillonnage, tri et caractériser les microplastiques dans les milieux aquatiques avec les charges de sédiments en suspension haute et les gros débris flottant

The ubiquitous presence of plastic debris in the ocean is widely recognized by the public, scientific communities, and government agencies. However, only ...