Name: detection of 3-nitrotyrosine in atmospheric environments via a high-performance liquid chromatography-electrochemical detector system
Uploaded: 2019-01-30T12:30:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System at JoVE.com

Die Autoren danken Masayuki Kubo von der US Environmental Protection Agency für seine Hilfe bei der Probenahme TSP/PM2,5 . Diese Arbeit wurde teilweise von JSPS KAKENHI Grant Nummer JP16K15373 und JP18H03039 unterstützt.

1. Erfassung aller Partikel, PM2,5, oder PM7und die Hydrolyse-Methode für PM Proteine ausgesetzt
<ol><li>Sammeln Sie die PM aus einem Vorfilter "oder" backup-Filter.<ol>
<li>Wiegen Sie vor der Sammlung von Schwebstaub (TSP), PM2,5und PM7die Quartz-Filter. Hinweis: Da die Kontamination durch PM Proteine und Peptide sollte keinen Einfluss auf die Erkennung von Tyrosin Nitrierung (da sie so eine Nitro-Gruppe fehlt), wir die Quartz-Filter bei hoher Temperatur vor der Messung nicht behandeln. Darüber hinaus war 3-NT Inhalt in die Quartz-Filter unter die Nachweisgrenze durch HPLC-ECD bestimmt.</li>
		<li>Setzen Sie die Quartz-Filter auf einem hohem Volumen Luft Sampler mit einem Partikel Größe Selektor, PM7 mit einer Durchflussrate von 1.000 L/min kontinuierlich für 7D (Abbildung 1 b) zu sammeln. TSP kann auf eine Quartz-Filter ohne ein Größe-Selektor (Abbildung 1A) abgeholt werden.</li>
		<li>Sammeln von PM2,5 mit einem geringem Volumen Luft Sampler eine Größeneinheit Einstufung bei einer Durchflussrate von 116 L/min kontinuierlich für 7 d. auf diesem Gerät Partikel können als PM4,5-2,5, PM7.3-4.5, PM15-7.3und TL-PM15 eingestuft werden und sammelte auf Quarz-Filter für die Klassifizierung. PM2,5 kann auf ein backup Filter (Abbildung 1) abgeholt werden.</li>
		<li>Notieren Sie den gesamten Volumenstrom zum Zeitpunkt der Filter-Sammlung. Messen Sie das Gewicht des TSP, PM2,5und PM7 auf die Filter durch Subtraktion der precollection Gewicht vom postcollection Gewicht. Den Filter in einem Plastikbeutel verschließen und Lagern bei-30 ° C erst im nächsten Schritt (siehe Abschnitt 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proteolyze Proben.<ol>
<li>Unspezifische Protease-Cocktail mit einem 0,1 M-Acetat-Puffer (pH 7,4) auflösen. Setzen Sie die Lösung in eine Dialysemembran (Molekulargewicht cutoff = 5.000 Da) und Tauchen Sie es in 1 L 0,1 M Acetat-Puffer mit Rühren bei 4 ° C. Ersetzen Sie den Puffer 2 x alle 12 Std., und führen Sie dann Dialyse über Nacht um endogene 3-NT und Nitrit (NO2–) zu entfernen. Nach der Dialyse die Lösung zu sammeln und die Proteinkonzentration Bicinchoninic Säure (BCA) Protein Assay messen.</li>
		<li>Punch Runde Kreise von 6 mm aus der Vorfilter oder den backup-Filter und in Mikroröhrchen umzusetzen. Bis zu fünf Stücke von 6 mm Brüche kann für die Analyse (Abbildung 2) verwendet werden.</li>
		<li>Fügen Sie 300 µL 0.1 M Acetat-Puffer mit 50 µg Protein der unspezifischen Protease cocktail (vorbereitet in Schritt 1.2.1) auf das Rohr auf die PM-Proteine bei 50 ° C 16 h mit Rotation Hydrolyseneigung. Hinweis: Um endogene subtrahieren muss 3-NT von der unspezifischen Protease-cocktail-Lösung zur Vorbereitung und eine unspezifische Protease Cocktail nur Probe zu verdauen.</li>
		<li>Spülen Sie die Ultrafiltration Membran zusammen mit den mitgelieferten Schlauch durch Hinzufügen von 0,1 M Acetat-Puffer und Zentrifugieren (10.000 x g für 30 sec; die genaue Geschwindigkeit hängt von der Membran), wegen Verunreinigung Chemikalien ähnlich wie 3-NT in der Membran. Wiederholen Sie die Spülung 1 X.</li>
		<li>Post-Proteolyse, Zentrifugieren Sie die Proben bei 2.500 x g für 10 min. Belastung der Überstand in die Membran Ultrafiltration und 10.000 x g und 4 ° C für Ultrafiltration Zentrifugieren (MWCO = 10.000), bis genügendes Volumen der Elution abgeholt wird. Speichern Sie die Eluate bei 4 ° C im Dunkeln. Achtung: Aufgrund der Erkennung eines ähnlichen Peaks auf 3-NT in der Spin-Spalte ist es notwendig, es zu waschen mit klarem Wasser oder mit einen Puffer wie HPLC-Wasser und ein 0,1 M-Acetat-Puffer vorherige verwenden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bestimmung der 3-NT-Gehalt im TSP, PM2,5, und PM7über einen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und elektrochemische (HPLC-ECD) Detektionssystem
Hinweis: Siehe Abbildung 3.
<ol><li>Bereiten Sie die mobile Phase.<ol>
<li>0,2 M Phosphat-Puffer (pH 2,5) mit 50 mg/L EDTA vorzubereiten. Messen ab 98 des Puffers und zwei Volumina von Acetonitril (HPLC-Klasse), in eine saubere Flasche gießen und mischen kräftig mit einer Kappe.</li>
		<li>Die mobile Phase bei Raumtemperatur für mehrere Stunden, bis die gelöste Luft flach geht zu Regeln. Hinweis: Wenn das System früher gestartet wird, die mobile Phase beschallt und werden unter Vakuum entgast. Über Entgasung ändert jedoch das Verhältnis zwischen Wasser und organische Phase über Verdunstung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die HPLC-ECD-System besteht aus einer Pumpe, einer HPLC-Säule eine Degasser, ein ECD und ein Injektor. Equilibrate der mobilen Phase und stabilisieren das System um den Hintergrund und Rauschen zu reduzieren.<ol>
<li>Die mobile Phase und der HPLC-Säule in der HPLC-Anlage zu installieren. Die HPLC-Pumpe schalten Sie ein und stabilisieren Sie die Spalte mit der mobilen Phase bei einer Durchflussrate von 500 µL/min bei 25 ° C Säulentemperatur ab dem Tag vor dem Starttag.</li>
		<li>Am nächsten Tag, entzünden die ECD und legen Sie die Parameter (die Reduzierung der Spannung am-900 mV und die Erregerspannung bei 400 mV). Stabilisieren Sie es für mindestens 3 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Messen Sie die 3-NT-Konzentration in der PM-7.<ol>
<li>Bereiten Sie verschiedene Konzentrationen von 3-NT Standards (5-500 nM) und eine leere (ohne die 3-NT standard und unspezifische Protease cocktail, um sicherzustellen, das Fläschchen weder den Puffer kontaminiert ist) in einem 0,1 M-Acetat-Puffer.</li>
		<li>Lassen Sie die HPLC-Daten-Maschine laufen.</li>
		<li>Probenfläschchen in der Auto-Injektor und setzen das Injektionsvolumen bis 25 µL betreiben die gleichen Bedingungen der mobilen Phase und Durchflussmenge wie in Schritt 2.2.1 beschrieben. Hinweis: Wenn die Probenvorbereitung abgeschlossen ist, es sollte Proben, einen Standard (5-500 nM), eine unspezifische Protease Cocktail nur Probe und eine leere Flasche.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass die Grundlinie in das Chromatogramm flach ist und starten Sie die Probeninjektion. Hinweis: In der Regel 3-NT in 20-21 min. nachgewiesen wird; ca. 30 min wird jedoch als die Laufzeit pro Probeninjektion empfohlen. Andernfalls werden Verunreinigung Gipfeln in den nächsten Lauf aufgenommen werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Analyse der Chromatogramme und Quantifizierung der 3-NT Inhalt in PM7
<ol><li>Überprüfen Sie den 3-NT-Gipfel in die Chromatogramme und berechnen Sie den Inhalt.<ol>
<li>Öffnen Sie nach der Datenerfassung die Chromatogramm Datendatei mit Analyse-Software.</li>
		<li>Zeichnen Sie eine Linie über den 3-NT-Gipfel von der Grundlinie flach und lesen Sie die Peakhöhe die gezeichnete Linie. Hinweis: Die Höchstmenge beträgt ca. 5 nM (125 Fmol in einer 25 µL-Injektion). Achtung: Die Elektrode in die ECD wird langsam erschöpft und die Grenze wird durch die S/N-Verhältnis hoch sein.</li>
		<li>Bereiten Sie einer Regressionsgeraden von den standard 3-NT-Gipfeln vor, berechnen Sie die Steigung zu und abzufangen.</li>
		<li>Weisen Sie diese Konstanten in die folgende Gleichung und berechnen Sie den 3-NT-Inhalt in den Proben wie folgt zu. Beispiel 3 – NT (nM) = [Peak zu probieren – abfangen] / Neigung GL. (1) Hinweis: Die Standardkurve sollte gut dargestellt werden als eine gerade Linie zwischen 5 nM und 500 nM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Das 3-NT in die Air-Umgebung und die PM7 aus dem Probengefäß zu berechnen.<ol>
<li>Multiplizieren Sie die 3-NT-Konzentration durch das Reaktionsvolumen (und den Verdünnungsfaktor, falls vorhanden), und bewerten Sie den absolute 3-NT-Inhalt in PM7 aus dem Kreis zu.</li>
		<li>Die gesammelten Filterfläche messen und berechnen den 3-NT-Inhalt in der gesamten PM7 Filter durch die folgende Gleichung. Insgesamt PM7 [3-NT Inhalt in der PM-7 des Kreises] = x [Verhältnis der PM7 Filterfläche zum Bereich Kreis] x 226.19 (im Falle der Umwandlung Maulwürfe in Gramm) GL. (2)</li>
		<li>Bewerten Sie den 3-NT-Inhalt in der Umgebungsluft oder PM7 durch Division der gesamten PM7 durch den gesamten Volumenstrom oder PM7 Gewicht (registriert im Schritt 1.1.3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Castillo, J. A., Staton, S. J. R., Taylor, T. J., Herckes, P., Hayes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+feasibility+of+bioaerosol+analysis+as+a+novel+fingerprinting+technique.">Exploring the feasibility of bioaerosol analysis as a novel fingerprinting technique.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (1), 15-26 (2012).</li><li>Franze, T., Weller, M. G., Niessner, R., P&#246;schl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nitration+by+polluted+air.">Protein nitration by polluted air.</a> Environmental Science &amp; Technology. 39 (6), 1673-1678 (2005).</li><li>Abe, R. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieser Artikel beschreibt eine Quantifizierungsmethode um 3-NT in Luft PM gesammelt auf Quarz-Filter mit hochsensiblen HPLC-ECD-Techniken zu bewerten.
Im Allgemeinen wurden 3-NT Messmethoden als Biomarker für oxidativen Stress bei menschlichen Erkrankungen entwickelt. Antikörper-basierten Methoden (z.B. die Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay) gelten als semi-quantitativen, da gibt es keine strengen Assay-Validierung und es schwierig ist zu beurteilen, die Test-Zuverlässigkeit. HPLC mit elektrochemischen Detektion (ECD) und Massenspektrometrie-basierte Assays haben ausreichende Empfindlichkeit für die Quantifizierung von 3-NT13. Obwohl sie empfindlich sind, Massenspektrometrie-basierte Methoden wie GC-MS oder GC-MS/MS erfordern die Derivatisierung von Aminosäuren und der Prozess der Derivatisierung oft führt zur Bildung von Artefakten14.
Im Vergleich zu den GC und LC-Techniken, HPLC-ECD ist relativ weniger teuer und hat eine ausreichende Empfindlichkeit zu messen 3-NT. Darüber hinaus der Derivatisierung Schritt in GC-MS und LC-MS oft erfordert zusätzliche Zeit. Obwohl die hier vorgestellte Methode für den Protein-Verdauung-Schritt 16 Stunden benötigt, es kann, dennoch durchgeführt werden über Nacht (wie oben beschrieben, ist der Arbeitsaufwand beträgt ca. 30 Minuten pro Probe erforderlich). Automatische Wiederholungsmessung mit einem Autosampler kann eine Hochdurchsatz-Mess-System bereitstellen. Frühere Studien haben berichtet, immunologische Methoden messen 3-NT in PM2,7; solche Methoden konnte jedoch keinen 3-NT in der Wintersaison aufgrund der niedrigen 3-NT in der PM-15erkennen.
Die HPLC-ECD-Methode hat zusätzliche Vorteile gegenüber anderen standard-Methoden; z. B. (i) eine Extraktion ist nicht erforderlich, bei dieser Methode, (Ii) Es ist völlig frei von Waschmittel, (Iii) es hat minimales Beispiel Anforderung, und, wichtiger, (iv) es hat hohen Empfindlichkeit. Partikel, die auf Filter gesammelt werden sind häufig durch Beschallung für weitere Untersuchungen, einschließlich die Quantifizierung der verschiedenen Komponenten getrennt. Reinigungsmittel werden auch verwendet, um PM-gebundene Proteine aus Filtern zu isolieren. Jedoch diese zusätzlichen Schritte erhöhen das Risiko der Kontamination, Probenverlust und Unterschätzung durch Extraktionseffizienz, und darüber hinaus die meisten Reinigungsmittel sind nicht kompatibel mit LC/MS. In dem vorliegenden HPLC-ECD-Verfahren können HPLC Proben leicht aus dem Filter mithilfe einen einfachen hohlen Schlag und ohne das Erfordernis einer zusätzlichen Probe Vorbereitungsphase getrennt werden. Der Bereich der runden Probe ist 28,3 mm2, die sehr klein im Vergleich zu der Größe des ursprünglichen Quartz-Filter ist (8 x 10 Zoll = 203,2 x 254 mm = 51.600 mm2).
Die HPLC-ECD-Bedingung wurde zur Vermeidung von Störungen auf das Signal 3-NT sorgfältig überprüft wie zuvor12beschrieben. Einen starken sauren pH-Wert der mobilen Phase und eine ausreichende Konzentration von Acetonitril ist wichtig für die Erkennung. Diese Nutzungsbedingungen können andere Verbindungen, einschließlich Nitro Basis, vom Nitrotyrosine getrennt werden. Der gegenwärtige Zustand ist geeignet für den Nachweis von 3-NT von Proben mit einer anderen physikalischen Eigenschaft (z. B. Feinstaub und Plasma).
Zur Bewertung 3-NT in der Luft, die Messung des Gewichts Filter und die Beseitigung des Hintergrunds sind wichtige Schritte. Im Allgemeinen werden über ca. 100 mg von PM7 gesammelt über einen Zeitraum von vier bis sieben Tage; jedoch können verschiedene Faktoren beeinflussen das Filter Gewicht vor und nach der PM-7 -Sammlung, darunter Feuchtigkeit und statische elektrische Ladung. Um diese Effekte zu vermeiden, ist die Stabilisierung der Filter Gewicht über einen längeren Zeitraum unter subequal Temperatur und Luftfeuchtigkeit erforderlich. Der Installationsort für die elektronische Waage sollte in einem stabilen Umfeld aufrechterhalten werden. Für die Probenvorbereitung ist es wichtig, die Hintergrundeffekte aus der unspezifischen Protease cocktail und der Ultrafiltration Membran, die oft eine ähnliche Peak 3-NT zeigen zu korrigieren.
Diese Methode kann auf andere Partikel, einschließlich derjenigen in Innenräumen angewendet werden. Die Nitrierung von Proteinen kann ihre allergenes Potenzial2erhöhen. Daher kann diese Methode helfen, saubere Umwelt zu bewerten und zu verhindern, dass Nitrosative Stress.
In dieser Studie berichten wir über ein hochempfindlicher Messverfahren für atmosphärische 3-NT von Luftfiltern Sampler mit einfach zu bedienende und kostengünstige Apparat. Die Generation der 3-NT in der Atmosphäre ist mit Umweltschadstoffen wie O3, keine2PM Proteine und meteorologischen Elemente betreffen menschlichen Allergenität verbunden. Zusammenfassend kann die in der vorliegenden Untersuchung entwickelte Methode helfen, um die atmosphärische Reaktion der O3, verschiedene Schadstoffe und PM Proteine unter verschiedenen meteorologischen Bedingungen zu bewerten. Mit diesen Bemühungen HPLC-ECD für eine Abschätzung der 3-Nitrotyrosine in der Atmosphäre zu entwickeln gehen wir besser saubere Umwelt, Verbesserung der menschlichen Gesundheit.

Aerosol oder in der Luft PM enthält Proteine aus verschiedenen biologischen Ursprungs, einschließlich Viren, Prokaryoten, Pilzen, Pflanzen (Pollen) und Tiere (Insekten, Mensch)1. Das Verhältnis der Proteingehalt in der PM wird voraussichtlich knapp 5 %, die verwickelt hat, als ein airborne Allergen2eine große Rolle spielen. Jüngste Berichte deuten darauf hin, dass städtische ambient Aerosol verschiedener Größen enthalten Aminosäuren mit Anteilen zwischen 0,5 % und 2 %3. Darüber hinaus sind chemische Veränderungen der PM Proteine vorgeschlagen worden, durch die Reaktionen der Proteine mit verschiedenen Schadstoffen, z. B. O3Stickstoffdioxid (Nr.2) und Schwefeldioxid (SO2)4erzeugt werden.
3-NT — eine Protein-Änderung – entsteht durch die Nitrierung von Tyrosin Rückstände. Eine höhere Konzentration von O3 und Nr.2 hat sich gezeigt, die Nitrierung von Eiweißmolekülen in Pseudo-atmosphärischen Raum5,6zu fördern. Die Nitrierung von Tyrosin-Rückständen in der Polypeptidkette verbessert das Allergene Potenzial von Pollen Proteine7. So, die Quantifizierung und Bewertung der in der Luft 3-NT ist ein wichtiger Aspekt im Hinblick auf die Belange der Umwelt und Gesundheit.
3-NT ist auch bekannt als Biomarker für oxidativen und Nitrosative stress8. Ein aufstrebender Körper des Beweises ergab eine signifikante Assoziation 3-NT Inhalte mit mehreren menschlichen Krankheiten9,10. Aufgrund ihrer schädlichen Auswirkungen, die Erkennung und die quantitative Abschätzung der 3-NT in einer biologischen Probe halten Sie großen Bedeutung bei der Bestimmung eines Individuums Gesundheitszustand. In den letzten Jahren diverse Methoden eingeführt, um die 3-NT-Inhalte, einschließlich der Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays, HPLC, schätzen und LC/MS11. In früheren Studien haben wir eine Methode mit der HPLC-ECD-Technik mit mehrere Vorteile im Vergleich zu bisherigen Methoden verliehen berichtet. Beispielsweise erfordert die HPLC-ECD keine Extraktion und Derivatisierung Verfahren macht es einem relativ einfachen Test System12. Wir haben bestätigt, dass dieses Verfahren anwendbar, 3-NT aus biologischen Proben (Plasma von Mensch und Ratte) zu erkennen ist.
Obwohl es viele Untersuchungen die Erkennung von 3-NT in biologischen Proben betont haben, seine Entdeckung in biologischen Proben schwer fassbaren und daher die vorliegende Studie verfolgt worden. In der Tat ist die schädliche Wirkung von in der Luft zu bewerten 3-NT, eine quantitative Methode, die nützlich, 3-NT direkt von luftgetragenen Partikel zu erkennen ist, erforderlich; Daher wir die bestehenden HPLC-ECD-Methode zur Erkennung angewendet 3-NT von PM2,5 auf einen Glasfaser Filter gesammelt. Mithilfe die Technik, 3-NT konnte nachgewiesen werden, direkt aus kleinen Stücken (6 mm Durchmesser Runde Löcher) der Probe von einem PM-Sammlung-Filter. Weiter bewertet den Inhalt der 3-NT für verschiedene PM-Größen und die Nachweisgrenze von 3-NT gemessen. Der vorliegende Artikel schlägt eine hoch-Sensitive und Hochdurchsatz-Methode um 3-NT direkt aus biologischen und biologische Proben zu erkennen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:940px;" width="940">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Quartz filter, backup quartz filter</td>
			<td style="width:240px;">PALL life sciences</td>
			<td style="width:168px;">7204</td>
			<td style="width:293px;">Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High-volume air sampler</td>
			<td style="width:240px;">SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td>
			<td style="width:168px;">HV-1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Particle size selector for SPM</td>
			<td style="width:240px;">SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td>
			<td style="width:168px;">080130-061</td>
			<td style="width:293px;">SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter.&#160; SPM is almost identical to PM7.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low-volume air sampler</td>
			<td style="width:240px;">SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td>
			<td style="width:168px;">AH-600F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Size classification unit for PM2.5</td>
			<td style="width:240px;">SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td>
			<td style="width:168px;">AH-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">Quartz filters for classification (PM4.5&#8211;2.5, PM7.3&#8211;4.5, PM15&#8211;7.3, and TSP-PM15)</td>
			<td style="width:240px;">Tokyo Dylec</td>
			<td style="width:168px;">AHQ-630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Non-specific protease cocktail</td>
			<td style="width:240px;">Roche</td>
			<td style="width:168px;">11459643001</td>
			<td style="width:293px;">Pronase from Streptomyces griseus&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">3-Nitrotyrosine</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td style="width:168px;">N7389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ultrafiltration membranes</td>
			<td style="width:240px;">Millipore</td>
			<td style="width:168px;">UFC5010BK</td>
			<td style="width:293px;">AMICON ULTRA 0.5 mL - 10kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">ECD</td>
			<td style="width:240px;">Eicom</td>
			<td style="width:168px;">HTEC-500, PEC-510</td>
			<td style="width:293px;">standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">HPLC column</td>
			<td style="width:240px;">Eicom</td>
			<td style="width:168px;">SC-5ODS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Data processor</td>
			<td style="width:240px;">Eicom</td>
			<td style="width:168px;">EPC-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Injector</td>
			<td style="width:240px;">Hitachi High-Tech Science&#160;</td>
			<td style="width:168px;">L-7200</td>
			<td style="width:293px;">Auto sampler</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Analyzing software</td>
			<td style="width:240px;">eDAQ Japan</td>
			<td style="width:168px;">ES280&#160;</td>
			<td style="width:293px;">PowerChrom software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of 3-nitrotyrosine in atmospheric environments via a high-performance liquid chromatography-electrochemical detector system

3-Nitrotyrosine (3-NT) entsteht aus dem Tyrosin Rückstand in atmosphärischen Bio-Aerosol Proteine über eine Reaktion mit Ozon (O3) und Stickstoffdioxid (Nr.2). Stabile 3-NT ist eine spezifische Marker für oxidative Schäden und wird berichtet, dass sich promotive auswirken, Allergien hervorrufen. In der vorliegenden Studie berichten wir die Entwicklung eines hochsensiblen Assays, 3-NT in Sampler Luftfilter < 2,5 µm Feinstaub (PM2,5) sammeln zu quantifizieren von städtischen Umgebungsluft, einschließlich Bio-Aerosol. Bei dieser Methode, einem Durchmesser von 6 mm Rundloch wurde von den Filtern der Luft Sampler geschnitten und gemischt mit einem unspezifischen Protease cocktail um Proteine Hydrolyseneigung. Proteinproben verdaut, die Aminosäure-Niveau wurden für 3-NT mit einem Hochleistungs-flüssige Chromatographie-elektrochemischen Detektor (HPLC-ECD) getestet. Der Höchstgehalt von 3-NT wurde in ein Vorfilter für PM Größen von 4,5 bis 7,3 μm, mit einer Nachweisgrenze von 1,13 Pg/m3erkannt.

Die HPLC-ECD-Prinzip ist einfach. Proben mit dem Ziel durch die HPLC-Säule und der mobilen Phase getrennt sind, und die Verbindung getrennt Ziel ist reduziert bzw. oxidiert in den elektrochemischen Detektor.
In der HPLC-ECD-System ist eine 3-NT-Spitze in etwa 22 Minuten erkannt. ECDs (PEC-510 und HTEC-500) sind im Tandem in der HPLC-Linie verbunden. Die ersten ECD reduziert Hydroxyl-Gruppen in den Verbindungen und der nächsten oxidiert weniger Chemikalien. ECDs haben einen hochempfindlichen Erfassungsbereich von 10-15 M. Die Nachweisgrenze des HPLC-ECD Systems war 1,13 Pg/m3, die als das mittlere basale Signal (mV) von 10 Teilen X 3 berechnet wurde.
Repräsentative Chromatogramme sind in Abbildung 4dargestellt. Durch die Analyse eines reinen 3-NT-Standards, kann eine endgültige Spitze mit einer stabilen Basislinie werden erkannt (Abb. 4A). 3-NT in PM7 wurde auch gemessen mit 6 mm, rundes Proben (Abbildung 4 b).
Wenn ein Standard 3-NT in HPLC, injiziert wurde, wurde die Spitze entspricht 3-NT bezüglich der Genauigkeit von 3-NT Detektionsvermögen bei einer Retentionszeit von 20 Minuten erkannt. In PM Proben 3-NT wurde von anderen Stoffen getrennt und die unabhängige Gipfel Aufbewahrung gleichzeitig als Standard erkannt wurde. Eine typische Standardkurve ist in Abbildung 5dargestellt wo Linearität zwischen 5 und 40 nM beobachtet wird. Linearität kann man bis zu 500 nM (Daten nicht gezeigt).
Tabelle 1 zeigt die 3-NT-Inhalte in der Atmosphäre, als Pg/m3 Luft berechnet. Die höchste Konzentration von 3-NT in einer PM2,5 Vorfilter wurde in #3 (PM7.3-4.5) beobachtet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig1.jpg"> Abbildung 1 : Sammlung Schema für TSP, PM7und PM2,5. (A) der Schwebstaub (TSP) sind direkt auf eine Sammlung Filter (bei einer Durchflussrate von 1.000 L/min) gesammelt. (B) Wenn PM7 erfasst werden, sind große Partikel mit einer Größe-Selektor (bei einer Durchflussrate von 1.000 L/min) ausgeschlossen. (C) PM2,5 wird durch vier Tiefenfilter (bei einer Durchflussrate von 116 L/min) gesammelt. Quartz-Filter dient häufig als backup Filter für PM7 und PM2,5 oder als Sammlung Filter für TSP, wie in dieser Abbildung dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig2.jpg"> Abbildung 2 : Vorbereitung eines 6 mm-runden Kreises. Erfassungsfilter wurde mit einem hohlen Stanzwerkzeug mit einem Durchmesser von 6 mm geschnitten. Dann wurde die Probe in einem 1,5 mL Reaktionscup gelagert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig3.jpg"> Abbildung 3 : Schematische Darstellung des Systems der HPLC-ECD. 3-NT in einer injizierten Probe trennte sich in der HPLC-Säule durch die mobile Phase fließt. Die 3-NT wurde auf Aminotyrosine reduziert, oxidiert, Iminotyrosine und elektrochemisch im Detektor erkannt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig4.jpg"> Abbildung 4 : Typische Chromatogramme in das HPLC-ECD System. (A) reine 3-NT von HPLC-ECD-System analysiert. (B) 6 mm Kreis Probe von einem PM-7 -Filter verwendet, um 3-NT zu erkennen. Eine 3-NT-Spitze wird durch einen Pfeil angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig5.jpg"> Abbildung 5 : Standardkurve von reinen 3-NT Proben. Die Ergebnisse bei einer niedrigeren Konzentration werden in eine andere Grafik angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Betreff</td>
			<td>Tage der Kollektion</td>
			<td>Vor Ort</td>
			<td>3-NT (Pg/m3 Luft)</td>
		</tr>
<tr>
<td>PM2, 5</td>
			<td>Vorfilter #1</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>8,25 ± 0,37</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Vorfilter #2</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>29.66 ± 1,94</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Vorfilter #3</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>74.37 ± 4,09</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Vorfilter #4</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>32,70 ± 0,75</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Backfilter</td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
			<td>4.21 ± 0.91</td>
		</tr>
<tr>
<td>PM7</td>
			<td>Backfilter</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>89.16 ± 6.36</td>
		</tr>
<tr>
<td>TSP</td>
			<td>Filter</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>10,34 ± 2.09</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: 3-NT in der Atmosphäre durch die HPLC-ECD-System gemessen. Die 6 mm Runde Flecken von jeder Filter wurden mit der HPLC-ECD-System bewertet. Tiefenfilter #1 - #4 wurden im gleichen Zeitraum gesammelt. Beachten Sie, dass die Konzentrationen von 3-NT in der Luft durch verschiedene Faktoren, wie die gesammelten Datum, Jahr oder Standort beeinflusst werden. Die Daten (n = 3-10) sind als Mittelwert ± der Standardfehler dargestellt.

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Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System

Wir präsentieren Ihnen eine Methode, um 3 Nitrotyrosine chemische Veränderungen der atmosphärischen Proteine mit 6 mm Durchmesser runden Schnitt von Luft Sampler Tiefenfilter mit einem Hochleistungs-flüssige Chromatographie-elektrochemischen Detektor (HPLC-ECD) zu erkennen.

Erkennung von 3-Nitrotyrosine in atmosphärischen Umgebungen über eine High-Performance Liquid Chromatography-elektrochemischen Detektor-System

3-nitrotyrosine (3-NT) is generated from the tyrosine residue in atmospheric bio-aerosol proteins via a reaction with ozone (O3) and nitrogen dioxide ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Umweltforschung über Nitrapyrin und 3-Nitrotyrosin zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es sich um eine einzigartige und hochempfindliche Methode zum Nachweis von 3-Nitrotyrosin auf Luftprobenfiltern handelt. Um scheineteilchen partikel- oder partikelmäßig mit einer Größe von weniger als sieben Mikrometern zu sammeln, wiegen Sie zunächst einen Bindemittel-3-Quarzfilter und sichern ihn an einem Luftprobennehmer mit hohem Volumen. Bedecken Sie den Filter mit einem Partikelgrößenwähler, um PM7 zu sammeln, oder lassen Sie den Filter unbedeckt, um die gesamten Schwebstoffpartikel zu sammeln. Führen Sie den Luftprobenehmer sieben Tage lang kontinuierlich mit 1000 Litern pro Minute aus. Laden Sie die Vorfilter in eine Größenklassifizierungseinheit und installieren Sie die Größenklassifizierungseinheit und einen Sicherungsfilter auf dem Luftsampler mit geringem Volumen. Führen Sie den Luftprobenehmer sieben Tage lang kontinuierlich mit 116 Würfen pro Minute aus, um PM2.5 auf dem Sicherungsfilter zu sammeln. Wenn die Probenahme abgeschlossen ist, wird das gesamte Durchflussvolumen erfasst. Wiegen Sie den Filter und berechnen Sie das Gewicht der gesammelten Partikel. Versiegeln Sie den Filter in einer Plastiktüte und lagern Sie ihn bei 30 Grad Celsius. Als nächstes 500 Mikroliter 6X unspezifischen Protease-Cocktail und Acetatpuffer vorbereiten und in eine Dalasismembran mit einem Molekulargewicht Cutoff von 5000 Daltonen legen. Tauchen Sie die gefüllte Membran in 1 L des Acetatpuffers ein und rühren Sie sie 24 bis 36 Stunden lang bei 4 Grad Celsius, indem Sie den Puffer alle 12 Stunden ersetzen, um indogenöses 3-Nitrotyrosin und Nitrit zu entfernen. Danach entfernen Sie einen Filter aus dem Gefrierschrank und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur erwärmen, während noch in der Tasche versiegelt. Dann stanzen Bis zu fünf 6 Millimeter breite Kreise aus dem Partikelbedeckten Bereich des Filters und legen Sie die Kreise in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Bereiten Sie 300 Mikroliter Acetatpuffer mit 50

Research

JoVE Journal

Environment

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