Name: detection of 3-nitrotyrosine in atmospheric environments via a high-performance liquid chromatography-electrochemical detector system
Uploaded: 2019-01-30T12:30:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System at JoVE.com

המחברים תודה יתבוננו Kubo של אותנו הסוכנות להגנת הסביבה על עזרתו עם כפית/PM2.5 הדגימה. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי JSPS KAKENHI גרנט מספר JP16K15373 ו- JP18H03039.

1. אוסף של סכום מושעה חלקיקי PM2.5, או PM7, השיטה הידרוליזה חלבונים PM
<ol><li>לאסוף רה מ מסנן prefilter או גיבוי.<ol>
<li>לפני האוסף של חלקיקים על תנאי מוחלט (כפית), PM2.5ו- PM7, לשקול את המסנן קוורץ. הערה: ניתן כי זיהום על ידי חלבונים PM פפטידים לא תשפיע על הגילוי של טירוזין ניטרציה (כמו היעדר קבוצה כזאת ניטרו), אנחנו לא התייחס המסנן קוורץ בטמפרטורה גבוהה לפני המדידה. בנוסף, 3-NT תוכן במסנן קוורץ היה תחת המגבלה זיהוי, כפי שנקבע על ידי HPLC-ECD.</li>
		<li>להגדיר את המסנן קוורץ דוגמאות אוויר בנפח גבוה עם בורר גודל חלקיקים כדי לאסוף PM7 בספיקה של 1,000 L/דקה ברציפות במשך 7 d (איור 1B). כפית ניתן לאסוף על מסנן קוורץ ללא בורר גודל (איור 1 א').</li>
		<li>לאסוף PM2.5 באמצעות דוגמאות אוויר בנפח נמוך עם יחידת סיווג גודל בקצב הזרימה של 116 L/min באופן רציף 7 ד באמצעות היחידה הזו, ניתן לסווג חלקיקי PM4.5-2.5, PM7.3-4.5, מאי15-7.3ו כפית-PM15 ונאסף אל קוורץ מסננים עבור סיווג. ניתן לאסוף PM2.5 על מסנן גיבוי (איור 1C).</li>
		<li>להקליט את נפח הזרימה הכולל בזמנו של האוסף מסנן. למדוד את המשקל של כפית, PM2.5ו PM7 על מסנני על ידי הפחתת המשקל precollection לפי המשקל postcollection. לאטום את המסנן בשקית ניילון ואחסן אותו ב-30 ° C עד השלב הבא (ראה סעיף 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proteolyze הדגימות.<ol>
<li>להמיס פרוטאז לא ספציפית קוקטייל עם מאגר אצטט 0.1 M (pH 7.4). מכניסים את הפתרון קרום דיאליזה (משקל מולקולרי הקיצוץ = 5,000 Da), לטבול אותו בבית 1 ליטר של 0.1 M מאגר אצטט עם ערבוב ב 4 º C. להחליף את המאגר 2 x כל 12 שעות, ולאחר מכן לבצע דיאליזה למשך הלילה כדי להסיר 3 אנדוגני-NT ו חנקיתי (לא2–). לאחר בדיאליזה, לאסוף את הפתרון, למדוד את ריכוז החלבון על ידי שיטת (BCA) חומצה bicinchoninic.</li>
		<li>אגרוף בסיבוב מעגלי 6 מ מ את prefilter או את המסנן גיבוי ולשים אותם לתוך microtubes. עד חמש חתיכות של 6 מ מ שברים יכול לשמש לניתוח (איור 2).</li>
		<li>להוסיף 300 µL 0.1 M אצטט מאגר המכיל 50 µg של חלבון הפרוטאז ספציפי קוקטייל (להכין בשלב 1.2.1) אל צינור כדי hydrolyze את החלבונים PM ב 50 מעלות צלזיוס במשך 16 h עם סיבוב. הערה: כדי לחסר אנדוגני 3-NT מהפתרון קוקטייל פרוטאז לא ספציפית, יש צורך להכין ולעכל מדגם קוקטייל בלבד פרוטאז לא ספציפית.</li>
		<li>לשטוף את קרום אולטראפילטרציה יחד עם שלה tube שסופקו על-ידי הוספת המאגר אצטט 0.1 M צריך שתוציאו (10,000 x g למשך 30 שניות; המהירות תלויה הקרום), עקב זיהום כימיקלים דומה 3-NT ממברנה. אני חוזר על רינס 1 x.</li>
		<li>פוסט-proteolysis, centrifuge את הדגימות-g 2,500 x עבור 10 דקות לטעון תגובת שיקוע לתוך קרום אולטראפילטרציה ו centrifuge זה ב 10,000 x g ו- 4 ° C עבור אולטראפילטרציה (MWCO = 10,000), עד נפח מספיק של • תנאי נאספת. אחסן את eluates ב 4 ° C בחושך. התראה: עקב הזיהוי לשיא דומה ל 3-NT בעמודה ספין, זה הכרחי כדי לשטוף אותה היטב עם מים נקיים או עם מאגר כגון HPLC מים, מאגר אצטט 0.1 M מוקדמת לשימוש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. קביעת תוכן 3-NT כפית, PM2.5ו- PM7באמצעות ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית, מערכת איתור אלקטרוכימי (HPLC-ECD)
הערה: ראה איור 3.
<ol><li>הכן השלב ניידים.<ol>
<li>להכין 0.2 מ' פוספט מאגר (pH 2.5) המכיל 50 mg/L EDTA. למדוד 98 כרכים של המאגר, שני כרכים של acetonitrile (hplc, קורס כיתה), שופכים אותם לתוך בקבוק זכוכית נקי, מערבבים היטב עם כובע.</li>
		<li>ליישב את השלב ניידים בטמפרטורת החדר למשך מספר שעות עד האוויר מומס ילך שטוח. הערה: אם את המערכת הוא התחיל מוקדם יותר, השלב נייד יכול להיות sonicated, degassed תחת ואקום. עם זאת, יתר על המידה degassing ישתנה היחס בין המים לבין שלב אורגני באמצעות אידוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מערכת HPLC-ECD מורכבת משאבה, עמודת HPLC, degasser, ECD ו של מזרק. Equilibrate שלב ניידים ולייצב את המערכת כדי להפחית את הרקע ואת רעש.<ol>
<li>התקן את שלב ניידים, לבין עמודת HPLC מערכת HPLC. תדליק את המשאבה HPLC ולייצב את העמודה עם השלב ניידים בספיקה של 500 µL/min בטמפרטורה 25 ° C עמודה של יום לפני היום הראשון.</li>
		<li>ביום הבא, להצית ECD ולהגדיר את הפרמטרים (הפחתת מתח ב-900 mV ואת המתח עירור 400 mV). . ייצוב פצועים. זה לפחות 3 שעות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מודדים את ריכוז 3-NT ב- PM7.<ol>
<li>להכין ריכוזים שונים של 3-NT סטנדרטים (5-500 ננומטר) ו ריק (ללא 3-NT רגיל ולא ספציפי פרוטאז קוקטייל, כדי לוודא את המבחנה וגם המאגר מזוהם) במאגר אצטט 0.1 M.</li>
		<li>להפעיל את המעבד נתונים HPLC.</li>
		<li>להכניס מדגם בקבוקונים אוטומטית-מזרק ולהגדיר האחסון הזרקת µL 25. לפעול באותם התנאים של שלב ניידים, קצב הזרימה כאמור בשלב 2.2.1. הערה: אם הכנת הדוגמא הושלמה, צריך להיות דוגמאות, תקן (5-500 ננומטר), מדגם קוקטייל בלבד פרוטאז לא ספציפית, בקבוקון ריק.</li>
		<li>ודא כי הבסיס ב chromatogram הוא שטוח ולהתחיל את הזריקה מדגם. הערה: בדרך כלל, 3-NT מזוהה בדקות 20-21; עם זאת, כ 30 דקות מומלצת הזמן רץ לכל דגימה זריקה. אחרת, מזהם פסגות ייכלל בהפעלה הבאה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ניתוח של Chromatograms ושל כימות של 3-NT תוכן ב- PM7
<ol><li>בדוק הפסגה 3-NT ב chromatograms, לחשב את התוכן.<ol>
<li>לאחר איסוף הנתונים, פתח את קובץ הנתונים של chromatogram עם ניתוח תוכנה.</li>
		<li>לצייר קו לרוחב הפסגה 3-NT מקו הבסיס שטוח ולקרוא את גובה שיא מהקו מצוירות. הערה: מגבלת כמותית היא כ 5 nM (125 fmol ב זריקה 25 µL). התראה: האלקטרודה ב ECD הופך להיות דלה לאט, הגבול יהיה גבוה בשל היחס S/N.</li>
		<li>להכין קו רגרסיה של פסגות סטנדרטי 3-NT, לחשב את השיפוע ו ליירט.</li>
		<li>להקצות בקבועים אלה לתוך המשוואה הבאה ולחשב את התוכן 3-NT הדגימות כדלקמן. דוגמה 3 – NT (ננומטר) = [לטעום שיא – ליירט] / שיפוע הציוד (1) הערה: העקומה רגיל צריך להיות מיוצגים היטב בתור קו ישר בין 5 nM ו 500 ננומטר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחשב את 3-NT בסביבה האוויר ואת PM7 מ המבחנה הדגימה.<ol>
<li>להכפיל את הריכוז 3-NT שעוצמת התגובה (, הגורם דילול, אם בכלל), בחן את תוכן 3-NT מוחלטת ב- PM7 מהכיכר.</li>
		<li>למדוד לאזור המסנן שנאספו ולחשב את התוכן 3-NT ב רה מ הכולל7 סנן לפי המשוואה הבאה. PM סך7 = [3-NT בתוכן PM7 המעגל] x [יחס של אזור מסנן7 PM לאזור מעגל] x 226.19 (במקרה של המרת שומות גרם) הציוד (2)</li>
		<li>בחן את תוכן 3-NT הסביבה אוויר או PM7 על-ידי חלוקת PM סך7 על ידי נפח הזרימה של האוויר או PM משקל7 (רשמת בשלב 1.1.3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Castillo, J. A., Staton, S. J. R., Taylor, T. J., Herckes, P., Hayes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+feasibility+of+bioaerosol+analysis+as+a+novel+fingerprinting+technique.">Exploring the feasibility of bioaerosol analysis as a novel fingerprinting technique.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (1), 15-26 (2012).</li><li>Franze, T., Weller, M. G., Niessner, R., P&#246;schl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nitration+by+polluted+air.">Protein nitration by polluted air.</a> Environmental Science &amp; Technology. 39 (6), 1673-1678 (2005).</li><li>Abe, R. Y., Akutsu, Y., Kagemoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+amino+acids+as+markers+for+biological+sources+in+urban+aerosols.">Protein amino acids as markers for biological sources in urban aerosols.</a> Environmental Chemistry Letters. 14 (1), 155-161 (2016).</li><li>D'Amato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergenic+pollen+and+pollen+allergy+in+Europe.">Allergenic pollen and pollen allergy in Europe.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 62 (9), 976-990 (2007).</li><li>Bolzacchini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-phase+reaction+of+phenol+with+NO3.">Gas-phase reaction of phenol with NO3.</a> Environmental Science &amp; Technology. 35 (9), 1791-1797 (2001).</li><li>Shiraiwa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphase+chemical+kinetics+of+the+nitration+of+aerosolized+protein+by+ozone+and+nitrogen+dioxide.">Multiphase chemical kinetics of the nitration of aerosolized protein by ozone and nitrogen dioxide.</a> Environmental Science &amp; Technology. 46 (12), 6672-6680 (2012).</li><li>Gruijthuijsen, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitration+enhances+the+allergenic+potential+of+proteins.">Nitration enhances the allergenic potential of proteins.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 141 (3), 265-275 (2006).</li><li>Kubo, M., Ogino, K., Tsukahara, H., Kaneko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Procedures+for+Nitrative/Nitrosative+Stress.">Analytical Procedures for Nitrative/Nitrosative Stress.</a> Studies on Pediatric Disorders. , 149-158 (2014).</li><li>Thomson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-nitrotyrosine+modified+proteins+in+atherosclerosis.">3-nitrotyrosine modified proteins in atherosclerosis.</a> Disease Markers. 2015, 708282 (2015).</li><li>Kuhn, D. M., Sakowski, S. A., Sadidi, M., Geddes, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrotyrosine+as+a+marker+for+peroxynitrite-induced+neurotoxicity:+the+beginning+or+the+end+of+the+end+of+dopamine+neurons?.">Nitrotyrosine as a marker for peroxynitrite-induced neurotoxicity: the beginning or the end of the end of dopamine neurons?.</a> Journal of Neurochemistry. 89 (3), 529-536 (2004).</li><li>Teixeira, D., Fernandes, R., Prud&#234;ncio, C., Vieira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Nitrotyrosine+quantification+methods:+Current+concepts+and+future+challenges.">3-Nitrotyrosine quantification methods: Current concepts and future challenges.</a> Biochimie. 125, 1-11 (2016).</li><li>Hitomi, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposition+of+protein-bound+3-nitrotyrosine+in+rat+plasma+analysed+by+a+novel+protocol+for+HPLC-ECD.">Disposition of protein-bound 3-nitrotyrosine in rat plasma analysed by a novel protocol for HPLC-ECD.</a> Journal of Biochemistry. 141 (4), 495-502 (2007).</li><li>Ogino, K., Wang, D. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+oxidative/nitrosative+stress:+an+approach+to+disease+prevention.">Biomarkers of oxidative/nitrosative stress: an approach to disease prevention.</a> Acta Medica Okayama. 61 (4), 181-189 (2007).</li><li>Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. -. T., Gutzki, F. -. M., Stichtenoth, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+3-nitrotyrosine+in+human+urine+at+the+basal+state+by+gas+chromatography-tandem+mass+spectrometry+and+evaluation+of+the+excretion+after+oral+intake.">Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 827 (1), 146-156 (2005).</li><li>Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+particulate+matter+and+ozone+with+3-nitrotyrosine+in+the+atmosphere.">Relationship of particulate matter and ozone with 3-nitrotyrosine in the atmosphere.</a> Environmental Pollution. 236, 948-952 (2018).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

מאמר זה מתאר שיטה כימות להערכה 3-NT PM מוטס שנאסף על מסננים קוורץ בשיטות HPLC-ECD רגישה מאוד.
באופן כללי, פותחו שיטות מדידה 3-NT כמו סמנים ביולוגיים של סטרס חמצוני של מחלות אנושיות. נוגדן מבוססי שיטות (למשל, וזמינותו מקושרים-אנזים immunosorbent) נחשבים כמו חצי כמותית כי יש ללא אימות assay קפדנית שקשה להעריך את מהימנות המבחן. HPLC עם איתור אלקטרוכימי (ECD) מבחני מבוססי ספקטרומטר מסה יש רגישות מספקת עבור כימות של 3-NT13. למרות שהם רגישים, שיטות מבוססות ספקטרומטר מסה כמו GC-MS או GC-MS/MS לדרוש את derivatization של חומצות אמינו, התהליך של derivatization לעיתים קרובות גורמת להיווצרות של חפצים14.
לעומת טכניקות GC והן LC, HPLC-ECD יקר יחסית פחות ויש לו רגישות מספקת מידה 3-NT. בנוסף, הצעד derivatization GC-MS ו- LC-MS לעתים דרוש זמן נוסף. למרות השיטה המובאת כאן דורש 16 שעות עבור השלב עיכול חלבון, זה יכול, בכל זאת, יבוצע לילה (כפי שתואר לעיל, בערך 30 דקות של זמן על הידיים נדרשת עבור דגימה). מדידה חוזרת אוטומטית על-ידי שימוש של תעשיה עשוי לספק מערכת מדידה תפוקה גבוהה. מחקרים קודמים דיווחו אימונולוגי שיטות למדוד 3-NT ב PM2,7; עם זאת, שיטות כאלה לא היתה אפשרות לזהות 3-NT בעונת החורף בשל רמות נמוכות של 3-NT PM15.
השיטה HPLC-ECD יש יתרונות נוספים על פני אחרים בשיטות הרגילות; לדוגמה, (i) תהליך החילוץ לא נדרש בשיטה זו, (ii) זה לגמרי ללא דטרגנט, (iii) יש דרישה מדגם מינימלי, וזה, חשוב, (iv) רגישות גבוהה. חלקיקים שנאספו על גבי המסננים מופרדות לעתים קרובות sonication לחקירה נוספת, לרבות כימות של הרכיבים השונים. חומרי ניקוי משמשים גם כדי לבודד חלבונים PM-מחויב ממסנני. עם זאת, אלה צעדים נוספים להגביר את הסיכון של זיהום, אובדן מדגם underestimation עקב מיצוי יעילות, יתר על כן, רוב חומרי ניקוי אינם תואמים LC/MS. ב שיטת HPLC-ECD הנוכחי, דגימות HPLC בקלות ניתן להפריד מהמסנן באמצעות אגרוף חלול פשוטה וללא הדרישה של תהליך הכנת דוגמאות נוספות. האזור של המדגם בצורת עגול נמצא 28.3 מ"מ2, שהוא קטן מאוד בהשוואה לגודל של המסנן קוורץ המקורי (8 x 10 אינץ = 203.2 x 254 מ מ = 51,600 מ מ2).
התנאי HPLC-ECD נצפה היטב כדי למנוע הפרעה לאות 3-NT, כפי שתואר לעיל12. PH חומצי חזק של שלב ניידים וריכוז נאותה של acetonitrile חשוב לצורך זיהוי. שימוש בתנאים אלה, ניתן להפריד תרכובות אחרות, כולל בסיס, ניטרו מן nitrotyrosine. המצב הקיים מתאים זיהוי 3-NT מדגימות בעלי מאפיין פיזי שונה (למשל, חלקיקי ו פלזמה).
כדי להעריך את 3-NT באוויר, את מידת משקל מסנן חיסול הרקע הם שלבים קריטיים. באופן כללי, על פני כ- 100 מ ג של PM7 נאספים על פני תקופה של ארבעה עד שבעה ימים; עם זאת, מספר גורמים להשפיע על המשקל מסנן לפני ואחרי האוסף7 PM, כולל מטען חשמלי סטטי חום ולחות. כדי למנוע תופעות אלה, הייצוב של המשקל מסנן לתקופות ארוכות הכרחי תחת subequal טמפרטורה ולחות. המיקום שבו מותקן האיזון אלקטרונית לשמור על סביבה יציבה. על הכנת הדוגמא, חשוב לתקן את ההשפעות רקע מ פרוטאז לא ספציפית הקוקטיילים ואת קרום אולטראפילטרציה, אשר לעתים קרובות להציג לשיא דומה ל 3-NT.
בשיטה זו ניתן ליישם חלקיקים אחרים, כולל אלה בסביבות מקורה. ניטרציה של חלבונים עשויה להגדיל את פוטנציאל אלרגני2. לכן, שיטה זו עשויה לסייע להעריך ניקיון הסביבה ולמנוע nitrosative מתח.
במחקר זה, אנו מדווחים על שיטת מדידה רגישה מאוד 3-NT אטמוספרי של מסנני אוויר סמפלר עם מנגנון אחיזה נוחה וזולה. דור 3-NT באווירה משויכת מזהמים סביבתיים כגון O3, לא2, חלבונים PM ואלמנטים אשר משפיעים על האדם allergenicity. לסיכום, שיטת פותח בחקירה נוכח עשוי לעזור כדי להעריך את התגובה עם אווירה של O3, מזהמים שונים, וחלבונים PM תחת תנאים מטאורולוגיים שונים. במאמצים אלה לפתח HPLC-ECD עבור הערכת 3-nitrotyrosine באטמוספרה, אנו צופים יותר ניקיון סביבתי, לשפר את בריאות האדם.

תרסיס או PM באוויר מכיל חלבונים ממקורות ביולוגיים שונים, לרבות וירוסים, אאוקריוטים, פטריות, צמחים (אבקה) בעלי חיים (חרקים, האדם)1. היחס של תכולת החלבון ב- PM מוערך כמעט 5%, אשר היה מעורב לשחק תפקיד מרכזי אלרגנים באוויר2. דיווחים אחרונים מראים את תרסיס אמביינט עירוניים שונים הגדלים מכילים חומצות אמינו עם יחס הנע בין 0.5% ל-2%3. בנוסף, שינויים כימיים של חלבונים PM שהוצעו כדי ליצור את התגובות של חלבונים עם מזהמים שונים,3O, חנקן דו-חמצני (2) ו גופרית דו-חמצנית (SO2)4.
3-NT – שינוי חלבון – נוצר על ידי ניטרציה של שאריות טירוזין. ריכוז גבוה יותר של O3 ו-2 הוכח כדי לקדם את ניטרציה של מולקולות חלבון מדומים אטמוספרי שטח5,6. ניטרציה של טירוזין שאריות פוליפפטיד מגביר את פוטנציאל אלרגני של אבקה חלבונים7. לכן, כימות והערכה של 3 מוטס-NT הוא היבט חשוב בהתייחסות את החששות של בריאות וסביבה.
3-NT הידוע גם סמן של חמצון, nitrosative להדגיש8. גוף המתעוררים של ראיות הראו קשר משמעותי של תוכן 3-NT עם מחלות האדם מספר9,10. בשל השפעות מזיקות שלה, זיהוי, הערכה כמותית של 3-NT דגימה ביולוגית החזק רלבנטיות גדולה בקביעת מצב בריאותו של הפרט. בשנים האחרונות הוכנסו שיטות מגוונות כדי להעריך את התוכן 3-NT, כולל מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent, HPLC, LC/MS11. במחקרים קודמים, אנו מדווחים על שיטת זיהוי בטכניקה HPLC-ECD וחטאיו עם מספר יתרונות לעומת שיטות קודמות. לדוגמה, HPLC-ECD אינו דורש הליך חילוץ או derivatization, מה שהופך אותו עם מערכת פשוטה יחסית assay12. יש לנו אישר כי שיטה זו ישימה לזהות 3-NT של דגימות ביולוגיות (פלזמה מן האדם, עכברוש).
למרות חקירות רבות הדגישו את הגילוי של 3-NT בדגימות ביולוגיות, זיהוי שלו בדגימות nonbiological עודנו, ומכאן יש כנראה תפס את המחקר הנוכחי. למעשה, כדי להעריך את ההשפעה המזיקה של מוטס 3-NT, שיטה כמותית זה שימושי לזהות 3-NT ישירות מחלקיקים באוויר נדרש; לכן, והגשנו בקשה השיטה HPLC-ECD הקיימת לזהות 3-NT של PM2.5 שנאסף על מסנן סיבי זכוכית. באמצעות הטכניקה, 3-NT יכול להתגלות ישירות מתוך קטן חתיכות (חורים עגולים 6 מ מ קוטר) של המדגם של מסנן אוסף PM. אנו עוד יותר להעריך את התוכן של 3-NT במגוון גדלים PM, מדדו את מגבלת זיהוי של 3-NT. המאמר הנוכחי מציעה שיטה גבוהה רגיש תפוקה גבוהה כדי לזהות 3-NT ישירות מתוך דוגמאות הן nonbiological והן ביולוגי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:940px;" width="940">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Quartz filter, backup quartz filter</td>
			<td style="width:240px;">PALL life sciences</td>
			<td style="width:168px;">7204</td>
			<td style="width:293px;">Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High-volume air sampler</td>
			<td style="width:240px;">SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td>
			<td style="width:168px;">HV-1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Particle size selector for SPM</td>
			<td style="width:240px;">SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td>
			<td style="width:168px;">080130-061</td>
			<td style="width:293px;">SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter.&#160; SPM is almost identical to PM7.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low-volume air sampler</td>
			<td style="width:240px;">SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td>
			<td style="width:168px;">AH-600F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Size classification unit for PM2.5</td>
			<td style="width:240px;">SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td>
			<td style="width:168px;">AH-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">Quartz filters for classification (PM4.5&#8211;2.5, PM7.3&#8211;4.5, PM15&#8211;7.3, and TSP-PM15)</td>
			<td style="width:240px;">Tokyo Dylec</td>
			<td style="width:168px;">AHQ-630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Non-specific protease cocktail</td>
			<td style="width:240px;">Roche</td>
			<td style="width:168px;">11459643001</td>
			<td style="width:293px;">Pronase from Streptomyces griseus&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">3-Nitrotyrosine</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td style="width:168px;">N7389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ultrafiltration membranes</td>
			<td style="width:240px;">Millipore</td>
			<td style="width:168px;">UFC5010BK</td>
			<td style="width:293px;">AMICON ULTRA 0.5 mL - 10kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">ECD</td>
			<td style="width:240px;">Eicom</td>
			<td style="width:168px;">HTEC-500, PEC-510</td>
			<td style="width:293px;">standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">HPLC column</td>
			<td style="width:240px;">Eicom</td>
			<td style="width:168px;">SC-5ODS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Data processor</td>
			<td style="width:240px;">Eicom</td>
			<td style="width:168px;">EPC-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Injector</td>
			<td style="width:240px;">Hitachi High-Tech Science&#160;</td>
			<td style="width:168px;">L-7200</td>
			<td style="width:293px;">Auto sampler</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Analyzing software</td>
			<td style="width:240px;">eDAQ Japan</td>
			<td style="width:168px;">ES280&#160;</td>
			<td style="width:293px;">PowerChrom software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of 3-nitrotyrosine in atmospheric environments via a high-performance liquid chromatography-electrochemical detector system

3-nitrotyrosine (3-NT) מופק השאריות טירוזין ב אטמוספרי ביו-תרסיס חלבונים באמצעות תגובה עם האוזון (O3), חנקן דו-חמצני (2). 3 יציב-NT סמן ספציפי עבור נזק חמצוני, דווח כי אפקט promotive לעורר אלרגיה. במחקר הנוכחי, מדווחים על התפתחות assay רגישה מאוד לכמת 3-NT ב מסנני אוויר סמפלר לאסוף < 2.5 מיקרומטר של חלקיקים (PM2.5) מהאוויר סביבתי עירוני, כולל ביו-תרסיס. בשיטה זו, 6 מ מקוטר חור עגול נחתך מן המסננים של אוויר דוגמי ולאחר מעורבב עם קוקטייל פרוטאז לא ספציפית על מנת hydrolyze חלבונים. דגימות חלבון מתעכל אל רמת חומצת אמינו נבדקו עבור 3-NT באמצעות ביצועים גבוהים נוזלי כרומטוגרפיה-אלקטרוכימיות גלאי (HPLC-ECD). התוכן 3-NT המרבי זוהה עם prefilter עבור PM הגדלים בין 4.5 ל 7.3 μm, עם מגבלה בזיהוי של pg/m 1.133.

העיקרון HPLC-ECD פשוטה. דגימות המכיל את המטרה מופרדות על ידי טור HPLC ו שלב ניידים, וכל המתחם היעד מופרדים מופחתת ו/או מחומצן, גלאי אלקטרוכימי.
במערכת HPLC-ECD, לשיא 3-NT זוהה כ- 22 דקות. ECDs (PEC-510, HTEC-500) מחוברים במשולב בקו HPLC. ECD הראשונה מפחיתה את קבוצות הידרוקסיל ב תרכובות, הבא מתחמצן הכימיקלים מופחת. ECDs יש מגוון מאוד רגיש זיהוי של 10-15 מ'. המגבלה זיהוי של מערכת HPLC-ECD היה 1.13 pg/m3, אשר מחושב כמו האות הבזליים רשע (mV) של 10 חלקים x 3.
Chromatograms נציג מוצגים באיור4. על ידי ניתוח רגיל 3-NT טהור, לשיא סופית עם בסיס יציב יכול להיות מזוהה (איור 4A). 3-NT ב PM7 גם נמדדה באמצעות 6 מ מ, דגימות בצורת עגול (איור 4B).
בנוגע למידת הדיוק של יכולת איתור 3-NT, כאשר תקן 3-NT הוזרק ב- HPLC, הפסגה המתאים 3-NT זוהה בזמן השמירה של 20 דקות. בדגימות PM, 3-NT הופרד מחומרים אחרים, הפסגה עצמאית זוהה באותו זמן השמירה התקנית. עיקול רגיל טיפוסי מוצג באיור 5, שבו נצפית ליניאריות בין 5 ל 40 ננומטר. ניתן לראות ליניאריות עד 500 ננומטר (נתונים לא מוצג).
טבלה 1 מציג את תוכן 3-NT באטמוספרה, מחושבת pg/m3 אוויר. הריכוז הגבוה ביותר של 3-NT ב prefilter2.5 PM נצפתה ב #3 (PM7.3-4.5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig1.jpg"> איור 1 : ערכת אוסף עבור כפית, מאי7, ו- PM2.5. (א) החלקיקים על תנאי מוחלט (כפית) נאספים ישירות על גבי מסנן אוסף (בקצב הזרימה של 1,000 L/min). (B) כאשר נאסף PM7 , חלקיקים גדולים אינם נכללים על ידי בורר גודל (בקצב הזרימה של 1,000 L/min). (ג) PM2.5 נאסף באמצעות ארבעה prefilters (בקצב הזרימה של 116 L/min). מסנן קוורץ הוא נפוץ כמו מסנן גיבוי PM7 ו- PM2.5 או כמו מסנן אוסף כפית, כפי שמוצג באיור זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig2.jpg"> איור 2 : הכנה של מעגל הסיבוב מ מ 6- המסנן ' אוסף ' נחתך באמצעות כלי ניקוב חלולים בקוטר 6 מ מ. לאחר מכן, המדגם היה מאוחסנים של 1.5 mL microtube. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig3.jpg"> איור 3 : תרשים סכמטי של מערכת HPLC-ECD. 3-NT ב דוגמה מוזרק הופרד בעמודה HPLC דרך אשר זורם שלב ניידים. 3-NT היה ירד ל aminotyrosine, תחמוצת כדי iminotyrosine, והוא זוהה electrochemically הגלאי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig4.jpg"> איור 4 : Chromatograms אופייני במערכת HPLC-ECD. (א) טהור 3-NT נותחו על ידי מערכת HPLC-ECD. מעגל (B) 6 מ מ מדגם מסנן7 PM המשמשים לזיהוי 3-NT. לשיא 3-NT מסומן על ידי חץ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig5.jpg"> איור 5 : עיקול רגיל של דגימות 3-NT טהור. התוצאות-ריכוז נמוך הם הצביעו על גרף אחר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">נושא</td>
			<td>ימי אוסף</td>
			<td>ספוט</td>
			<td>3-NT (pg/m3 אוויר)</td>
		</tr>
<tr>
<td>PM 2.5</td>
			<td>לסנן מראש #1</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>8.25 ± 0.37</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>לסנן מראש #2</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>29.66 ± 1.94</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>לסנן מראש #3</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>74.37 ± 4.09</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>לסנן מראש #4</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>32.70 ± 0.75</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Backfilter</td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
			<td>4.21 ± 0.91</td>
		</tr>
<tr>
<td>טכנולוגיית השמה משטחית</td>
			<td>Backfilter</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>89.16 ± 6.36</td>
		</tr>
<tr>
<td>כפית</td>
			<td>מסנן</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>10.34 ± 2.09</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: 3-NT באטמוספרה נמדד על ידי מערכת HPLC-ECD. המקומות עגולים 6 מ מ מ כל מסנן נמדדו באמצעות מערכת HPLC-ECD. Prefilters #1 - #4 נאספו באותה תקופה. שימו לב ריכוזי 3-NT באוויר מושפעות על ידי גורמים שונים, כגון תאריך שנאספו, שנה או מיקום. הנתונים (n = 3-10) הם שמיוצגות זאת אומרת ± השגיאה הסטנדרטית.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System at JoVE.com

Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System

אנו מציגים שיטה כדי לזהות שינויים כימיים 3-nitrotyrosine של חלבונים אטמוספרי עם 6 מ מ קוטר סבבים של אוויר סמפלר prefilters באמצעות ביצועים גבוהים נוזלי כרומטוגרפיה-אלקטרוכימיות גלאי (HPLC-ECD).

זיהוי של 3-Nitrotyrosine סביבות אטמוספרי דרך ביצועים גבוהים מערכת גלאי אלקטרוכימי-כרומטוגרפיה נוזלית

3-nitrotyrosine (3-NT) is generated from the tyrosine residue in atmospheric bio-aerosol proteins via a reaction with ozone (O3) and nitrogen dioxide ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח במחקר סביבתי על ניטורפירין ו 3-ניטרוטרירוסין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי היא שיטה ייחודית רגישה מאוד לגילוי 3-nitrotyrosine על מסנני מדגם אוויר. כדי לאסוף חלקיקים מושעים הכולל או חומר חלקיקי של פחות משבעה מיקרון בגודל, תחילה לשקול קלסר 3 מסנן קוורץ ולאבטח אותו על סמפלר אוויר בנפח גבוה. לכסות את המסנן עם בורר גודל חלקיקים כדי לאסוף PM7 או להשאיר את המסנן חשוף כדי לאסוף חלקיקים מושעים הכולל. הפעל את סמפלר האוויר ב 1000 ליטר לדקה ברציפות במשך שבעה ימים. טען את המסננים מראש ליחידת סיווג גודל והתקן את יחידת סיווג הגודל ומסנן גיבוי על סמפלר האוויר בנפח נמוך. הפעל את סמפלר האוויר ב 116 המלטה לדקה ברציפות במשך שבעה ימים כדי לאסוף PM2.5 על מסנן הגיבוי. בסיום הדגימה, רשום את נפח הזרימה הכולל. לשקול את המסנן ולחשב את המשקל של החלקיקים שנאספו. לאטום את המסנן בשקית ניילון ולאחסן אותו ב 30 מעלות צלזיוס.הבא להכין 500 microliters של קוקטייל פרוטאז 6X לא ספציפי חיץ אצטט ולמקם אותו קרום דלסיס עם ניתוק משקל מולקולרי של 5000 דלתונים. לטבול את הממברנה המלאה ב 1 L של חיץ אצטט ומערבבים אותו ב 4 מעלות צלזיוס במשך 24 עד 36 שעות, החלפת החיץ כל 12 שעות כדי להסיר indogenous 3-Nitrotyrosine ו Nitrite.Then למדוד את ריכוז החלבון בתווית פרוטאז דיאליזה עם אסאי חלבון חומצה ביצינצ'ונית. לאחר מכן להסיר מסנן מהמקפיא ולאפשר לו להתחמם לטמפרטורת החדר תוך עדיין אטום בשקית. לאחר מכן אגרוף עד חמישה 6 מילימטרים רחב עיגולים מן החומר החלקיקים מכוסה באזור של המסנן, ולמקום את העיגולים בצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. הכן 300 מיקרוליטרים של מאגר אצטט המכיל 50

Research

JoVE Journal

Environment

Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

לייעל ארובות הגדרות גז לקידום Microalgae צמיחה בphotobioreactors באמצעות הדמיות מחשב

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Tracking Microbial Contamination in Retail Environments Using Fluorescent Powder - A Retail Delicatessen Environment Example

מעקב מיקרוביאלית זיהום בסביבות קמעונאיות באמצעות פלורסנט אבקה - קמעונאות מעדני סביבת דוגמא

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne ...

Exploring the Effects of Atmospheric Forcings on Evaporation: Experimental Integration of the Atmospheric Boundary Layer and Shallow Subsurface

היכרות האפקטים של האטמוספרה Forcings באידוי: שילוב ניסיוני של שכבת האטמוספרה הגבול ומתחת לפני קרקע רדודה

Evaporation is directly influenced by the interactions between the atmosphere, land surface and soil subsurface. This work aims to experimentally study ...

Laboratory Simulation of an Iron(II)-rich Precambrian Marine Upwelling System to Explore the Growth of Photosynthetic Bacteria

Laboratory Simulation of an IronII-rich Precambrian Marine Upwelling System to Explore the Growth of Photosynthetic Bacteria

סימולצית מעבדה של הברזל (II) -rich Precambrian ימי גאות מערכת לחקור את הצמיחה של חיידקים פוטוסינתטיים

A conventional concept for the deposition of some Precambrian Banded Iron Formations (BIF) proceeds on the assumption that ferrous iron [Fe(II)] upwelling ...

Extraction and Characterization of Surfactants from Atmospheric Aerosols

הפקת ואפיון של חומרים פעילי שטח מ אירוסולים באטמוספירה

Surface-active compounds, or surfactants, present in atmospheric aerosols are expected to play important roles in the formation of liquid water clouds in ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

מדידה ומיפוי דפוסים של סחף אדמה ומשקעים הקשורים אדמה ריכוזים קרבונט תחת ניהול חקלאיים

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

זיהוי מולקולרי באתר של קרקע בתפו Phytopathogens באמצעות מערכת ה-PCR נייד בזמן אמת

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

בחיי עיר טכניקות הכלאה פרפין-מוטבע דגימות אלמוגים למבוגרים

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

Sampling, Sorting, and Characterizing Microplastics in Aquatic Environments with High Suspended Sediment Loads and Large Floating Debris

דגימה, מיון של אפיון Microplastics בסביבות מימיות עם המון משקעים מושעה גבוהה ופסולת צף גדול

The ubiquitous presence of plastic debris in the ocean is widely recognized by the public, scientific communities, and government agencies. However, only ...