Name: detection of 3-nitrotyrosine in atmospheric environments via a high-performance liquid chromatography-electrochemical detector system
Uploaded: 2019-01-30T12:30:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System at JoVE.com

Forfatterne takker Masayuki Kubo av det oss Environmental Protection Agency for hans hjelp med TS/PM2.5 prøvetaking. Dette arbeidet var støttes delvis av JSP KAKENHI Grant antall JP16K15373 og JP18H03039.

1. innsamling av totalt suspendert partikler, PM2.5, eller PM7og hydrolyse metoden for PM proteiner
<ol><li>Samle PM fra filtere forhåndsfiltrere eller sikkerhetskopiering.<ol>
<li>Før samlingen totale suspenderte partiklene (TSP), PM2.5og PM7, veie quartz-filter. Merk: Gitt at forurensning av PM proteiner og peptider ikke bør påvirke påvisning av tyrosin nitration (som de mangler slik nitro gruppe), vi ikke behandle quartz-filter ved høy temperatur før måling. I tillegg var 3-NT innhold i quartz-filter under gjenkjenning grensen, som bestemmes av HPLC-ECD.</li>
		<li>Angi quartz-filter på et høyt volum luft sampler med en partikkel størrelse velger å samle PM7 på en strømningshastighet på 1000 L/min kontinuerlig for 7 d (figur 1B). TSP kan samles på et quartz-filter uten en størrelse velger (figur 1A).</li>
		<li>Samle PM2.5 bruker en lav-volum luft sampler med en størrelse klassifisering enhet på en strømningshastighet på 116 L/min kontinuerlig for 7 d. enheten, partikler kan klassifiseres som PM4.5-2.5, PM7.3 4,5, PM15-7.3og TS-PM15 og samlet på quartz-filtre for klassifisering. PM2.5 kan samles på et backup filter (figur 1 c).</li>
		<li>Registrer total flow volum ved filtersamlingen. Måle vekten av TSP, PM2.5og PM7 på filtre ved å trekke precollection vekten fra postcollection vekten. Seal filteret i en plastpose og lagre den på 30 ° C før neste trinn (se avsnitt 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proteolyze prøvene.<ol>
<li>Oppløse uspesifikke protease cocktail med en 0.1 M acetate buffer (pH 7.4). Sette løsningen i en dialyse membran (molekylvekt cutoff = 5000 Da) og Dynk kjeden i 1 L 0.1 M acetate buffer med omrøring på 4 ° C. Erstatt bufferen 2 x hver 12 h, og deretter utføre dialyse over natten for å fjerne endogene 3-NT og nitritt (ingen2-). Etter dialyse, samle løsningen og måle protein konsentrasjonen av bicinchoninic acid (BCA) protein analysen.</li>
		<li>Punch runde sirkler av 6 mm forhåndsfiltrere eller backup filteret og sette dem inn i microtubes. Opptil fem brikker på 6 mm brøker kan brukes for analyse (figur 2).</li>
		<li>Legge til 300 µL 0.1 M acetate bufferen som inneholder 50 µg protein av uspesifikke protease cocktail (forberedt i trinn 1.2.1) til røret til hydrolyze PM proteiner ved 50 ° C i 16 timer med rotasjon. Merk: Vil trekke endogene 3-NT fra uspesifikke protease cocktail løsning, er det nødvendig å forberede og fordøye en uspesifisert protease cocktail-bare prøve.</li>
		<li>Skyll ultrafiltrasjon membranen sammen med den medfølgende rør ved å legge 0.1 M acetate buffer og sentrifugering (10 000 x g i 30 sek; eksakte hastigheten avhenger av membranen), grunn av forurensende kjemikalier ligner på 3-NT i membranen. Gjenta skylling 1 x.</li>
		<li>Etter proteolyse, sentrifuge prøvene 2500 x g for 10 min. Last nedbryting i ultrafiltrasjon membranen og sentrifuge det på 10.000 x g og 4 ° C i ultrafiltrasjon (MWCO = 10 000), til tilstrekkelig mengde elueringsrør samles. Lagre eluates på 4 ° C i mørket. Advarsel: Fordi deteksjon av en tilsvarende topp til 3-NT i kolonnen spinn er det nødvendig å vaske det godt med rent vann eller en buffer som HPLC vann og en 0.1 M acetate buffer før å bruke.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. fastsettelse av 3-NT innhold i TSP, PM2.5, og PM7via en høy-ytelse flytende kromatografi og elektrokjemiske varmestyring (såkalt HPLC-ECD)
Merk: Se Figur 3.
<ol><li>Forberede den mobile fasen.<ol>
<li>Forberede 0,2 M fosfat buffer (pH 2.5) inneholder 50 mg/L EDTA. Måle 98 mengder bufferen og to bind av acetonitrile (HPLC grad), hell dem i en ren glassflaske og bland kraftig med en cap.</li>
		<li>Utligne den mobile fasen i romtemperatur i flere timer før den oppløst luften går flat. Merk: Hvis systemet startes tidligere, den mobile fasen kan sonicated og degassed under et vakuum. Imidlertid vil over avgassing endre forholdet mellom vann og organisk fase via fordampning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>HPLC-ECD systemet består av en pumpe, en såkalt HPLC-kolonne, en degasser, en ECD og en injeksjonsbrønn. Equilibrate mobile fasen og stabilisere systemet å redusere bakgrunnen og støy.<ol>
<li>Installere mobile fasen og kolonnen HPLC i HPLC systemet. Slå på HPLC pumpen og stabilisere kolonnen med den mobile fasen på en strømningshastighet på 500 µL/min ved 25 ° C kolonnen temperatur fra dagen før startdagen.</li>
		<li>På den neste dagen, antennes på ECD og sette parametre (reduksjon spenningsnivået-900 mV og eksitasjon spenningsnivået 400 mV). Stabilisere det minst 3 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mål 3-NT konsentrasjonen i PM7.<ol>
<li>Klargjør ulike konsentrasjoner av 3-NT standarder (5-500 nM) og en tom (uten den 3-NT standard og uspesifikke protease cocktail, å sørge for at verken ampullen eller bufferen er forurenset) i en 0.1 M acetate buffer.</li>
		<li>Kjøre den HPLC dataprosessoren.</li>
		<li>Sette eksempel ampuller i auto-injektor og sett injeksjon volumet til 25 µL. opererer vilkårene mobile fase og strømningshastighet som nevnt i trinn 2.2.1. Merk: Hvis eksempel forberedelsen er fullført, skal det være prøver, en standard (5-500 nM), en uspesifisert protease cocktail-bare prøve og tom ampuller.</li>
		<li>Kontroller at opprinnelige i chromatogram er flat og starte eksempel injeksjon. Merk: Vanligvis 3-NT registreres i 20-21 min; ca 30 min anbefales imidlertid som kjøretiden per eksempel injeksjon. Ellers vil miljøgifter topper bli inkludert i neste.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. analyse av Chromatograms og måling av 3-NT innhold i PM7
<ol><li>Sjekk den 3-NT toppen i chromatograms og beregne innholdet.<ol>
<li>Etter datainnsamling, åpne filen chromatogram data med analyseprogramvare.</li>
		<li>Tegne en linje over 3-NT toppen fra flat grunnlinjen og lese peak høyden fra tegnet linjen. Merk: Kvantitative grensen er ca 5 nM (125 fmol i en 25 µL injeksjon). FORSIKTIG: Elektroden i ECD oppbrukt sakte, og grensen vil bli høy på grunn av S/N forholdet.</li>
		<li>Forberede en regresjonslinjen fra 3-NT standard fjelltopper, beregne skråningen og avskjære.</li>
		<li>Tilordne disse konstantene i denne formelen og beregne 3-NT innholdet i prøvene som følger. Eksempel 3-NT (nM) = [prøve topp-fange] / skråningen Eq. (1) Merk: Standardkurven bør være godt representert som en rett linje mellom 5 nM og 500 nM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beregne 3-NT i air miljøet og PM-7 fra prøven ampullen.<ol>
<li>Gang 3-NT konsentrasjonen av reaksjon volumet (og fortynningsfaktoren, hvis noen), og vurdere det absolutte 3-NT innholdet i PM7 fra sirkelen.</li>
		<li>Måle samlet filterområdet og beregne 3-NT innholdet i den totale PM7 filter med følgende ligning. Totalt PM7 = [3-NT innhold i PM7 av sirkelen] x [forholdet mellom PM7 filterområdet til skiområdet sirkel] x 226.19 (ved konvertering føflekker gram) Eq. (2)</li>
		<li>Vurdere 3-NT innholdet i air miljøet eller PM7 ved å dele den totale PM7 totalt air flow volum eller PM7 vekt (registrert i trinn 1.1.3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Castillo, J. A., Staton, S. J. R., Taylor, T. J., Herckes, P., Hayes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+feasibility+of+bioaerosol+analysis+as+a+novel+fingerprinting+technique.">Exploring the feasibility of bioaerosol analysis as a novel fingerprinting technique.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (1), 15-26 (2012).</li><li>Franze, T., Weller, M. G., Niessner, R., P&#246;schl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nitration+by+polluted+air.">Protein nitration by polluted air.</a> Environmental Science &amp; Technology. 39 (6), 1673-1678 (2005).</li><li>Abe, R. Y., Akutsu, Y., Kagemoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+amino+acids+as+markers+for+biological+sources+in+urban+aerosols.">Protein amino acids as markers for biological sources in urban aerosols.</a> Environmental Chemistry Letters. 14 (1), 155-161 (2016).</li><li>D'Amato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergenic+pollen+and+pollen+allergy+in+Europe.">Allergenic pollen and pollen allergy in Europe.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 62 (9), 976-990 (2007).</li><li>Bolzacchini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-phase+reaction+of+phenol+with+NO3.">Gas-phase reaction of phenol with NO3.</a> Environmental Science &amp; Technology. 35 (9), 1791-1797 (2001).</li><li>Shiraiwa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphase+chemical+kinetics+of+the+nitration+of+aerosolized+protein+by+ozone+and+nitrogen+dioxide.">Multiphase chemical kinetics of the nitration of aerosolized protein by ozone and nitrogen dioxide.</a> Environmental Science &amp; Technology. 46 (12), 6672-6680 (2012).</li><li>Gruijthuijsen, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitration+enhances+the+allergenic+potential+of+proteins.">Nitration enhances the allergenic potential of proteins.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 141 (3), 265-275 (2006).</li><li>Kubo, M., Ogino, K., Tsukahara, H., Kaneko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Procedures+for+Nitrative/Nitrosative+Stress.">Analytical Procedures for Nitrative/Nitrosative Stress.</a> Studies on Pediatric Disorders. , 149-158 (2014).</li><li>Thomson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-nitrotyrosine+modified+proteins+in+atherosclerosis.">3-nitrotyrosine modified proteins in atherosclerosis.</a> Disease Markers. 2015, 708282 (2015).</li><li>Kuhn, D. M., Sakowski, S. A., Sadidi, M., Geddes, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrotyrosine+as+a+marker+for+peroxynitrite-induced+neurotoxicity:+the+beginning+or+the+end+of+the+end+of+dopamine+neurons?.">Nitrotyrosine as a marker for peroxynitrite-induced neurotoxicity: the beginning or the end of the end of dopamine neurons?.</a> Journal of Neurochemistry. 89 (3), 529-536 (2004).</li><li>Teixeira, D., Fernandes, R., Prud&#234;ncio, C., Vieira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Nitrotyrosine+quantification+methods:+Current+concepts+and+future+challenges.">3-Nitrotyrosine quantification methods: Current concepts and future challenges.</a> Biochimie. 125, 1-11 (2016).</li><li>Hitomi, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposition+of+protein-bound+3-nitrotyrosine+in+rat+plasma+analysed+by+a+novel+protocol+for+HPLC-ECD.">Disposition of protein-bound 3-nitrotyrosine in rat plasma analysed by a novel protocol for HPLC-ECD.</a> Journal of Biochemistry. 141 (4), 495-502 (2007).</li><li>Ogino, K., Wang, D. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+oxidative/nitrosative+stress:+an+approach+to+disease+prevention.">Biomarkers of oxidative/nitrosative stress: an approach to disease prevention.</a> Acta Medica Okayama. 61 (4), 181-189 (2007).</li><li>Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. -. T., Gutzki, F. -. M., Stichtenoth, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+3-nitrotyrosine+in+human+urine+at+the+basal+state+by+gas+chromatography-tandem+mass+spectrometry+and+evaluation+of+the+excretion+after+oral+intake.">Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 827 (1), 146-156 (2005).</li><li>Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+particulate+matter+and+ozone+with+3-nitrotyrosine+in+the+atmosphere.">Relationship of particulate matter and ozone with 3-nitrotyrosine in the atmosphere.</a> Environmental Pollution. 236, 948-952 (2018).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Denne artikkelen beskriver en kvantifisering metode for å vurdere 3-NT i luftbårne PM samlet på quartz-filtre bruker svært sensitive HPLC-ECD teknikker.
Vanligvis har 3-NT målemetoder blitt utviklet som biomarkers oksidativt stress i menneskelige sykdommer. Antistoff-baserte metoder (f.eks, enzym knyttet immunosorbent analysen) regnes som semi kvantitative fordi det er ingen streng analysen validering og det er vanskelig å vurdere testens reliabilitet. HPLC med elektrokjemiske deteksjon (ECD) og masse massespektrometri-baserte analyser har tilstrekkelig sensitivitet for kvantifisering av NT 3-13. Selv om de er sensitiv, masse massespektrometri-baserte metoder som GC-MS eller GC--MS-/ MS krever derivatization av aminosyrer, og prosessen med derivatization ofte resulterer i dannelsen av gjenstander14.
I forhold til både GC og LC teknikker, HPLC-ECD er relativt billigere og har en tilstrekkelig sensitivitet til tiltak 3-NT. i tillegg til derivatization trinnet GC-og LC-MS ofte krever ekstra tid. Selv om metoden presenteres her krever 16 timer for protein fordøyelse trinn, det kan likevel gjennomføres overnatting (som beskrevet ovenfor, ca 30 minutter med hands-on tid er nødvendig per prøve). Automatisk gjenta målingen ved hjelp av en autosampler kan gi en høy gjennomstrømming målesystem. Tidligere studier har rapportert immunologiske metoder å måle 3-NT i PM2,7; men kan slike metoder ikke finne 3-NT i vintersesongen på grunn av de lave nivåene av 3-NT i PM15.
Metoden HPLC-ECD har flere fordeler fremfor andre standard metoder; for eksempel (i) en utpakkingen er ikke nødvendig i denne metoden, (ii) det er helt vaskemiddel-fri, (iii) har minimal eksempel krav og, viktigst, (iv) har høy følsomhet. Partikler som er samlet på filtre er ofte skilt med sonication for videre undersøkelser, inkludert kvantifisering av ulike komponenter. Vaskemidler brukes også til å isolere PM-bundet proteiner fra filtre. Men disse trinnene øker risikoen for forurensing, prøve tap og undervurdering på grunn av utvinning effektivitet, og dessuten de fleste vaskemidler er inkompatible med LC/MS. I metoden finnes HPLC-ECD kan HPLC prøver lett skilles fra filteret ved hjelp av en enkel hul punch og uten krav til en flere eksempler forberedelsesprosessen. Rund-formet prøven er 28.3 mm2, som er svært liten i forhold til størrelsen på det opprinnelige quartz-filteret (8 x 10 tommer = 203.2 x 254 mm = 51,600 mm2).
Betingelsen HPLC-ECD har gjennomgått nøye for å unngå interferens på NT 3-signalet, som beskrevet tidligere12. En sterk surt pH mobile fase og en tilstrekkelig konsentrasjonen av acetonitrile er viktig for gjenkjenning. Bruker disse forholdene, kan andre stoffer, inkludert nitro base, skilles fra nitrotyrosine. Den nåværende tilstanden er egnet for påvisning av 3-NT fra prøver med en annen fysisk eiendom (f.eks svevestøv og plasma).
For å evaluere 3-NT i luften, måling av filteret vekten og eliminering av bakgrunnen er avgjørende skritt. Over ca 100 mg av PM7 er generelt samlet over en periode på fire til sju dager. flere faktorer påvirker imidlertid filter vekten før og etter samlingen PM7 , inkludert fuktighet og statisk elektrisk ladning. For å unngå disse effektene, er stabilisering av filteret vekten over lengre nødvendig under subequal temperatur og fuktighet. Plasseringen der den elektroniske balansen er installert bør opprettholdes i et stabilt miljø. For eksempel forberedelse er det viktig å rette bakgrunnen effektene uspesifikke protease cocktail og ultrafiltrasjon membran, som ofte viser en tilsvarende topp til 3-NT.
Denne metoden kan brukes til andre partikler, inkludert de i innendørs miljøer. Nitration av proteiner kan øke deres allergifremkallende potensielle2. Derfor kan denne metoden bidra til å evaluere miljømessige renslighet og unngå nitrosative stress.
I denne studien rapporterer vi en svært følsom målemetode for atmosfæriske 3-NT av sampler luftfiltre med enkel å håndtere og rimelig apparater. Generering av 3-NT i atmosfæren er forbundet med miljøgifter som O3, ingen2, PM proteiner og meteorologiske elementer som påvirker menneskelig allergi fremkallende. Avslutningsvis kan metoden utviklet i stede etterforskningen hjelpe for å vurdere atmosfæriske reaksjon O3, forskjellige miljøgifter og PM proteiner under ulike havner. Med disse bestrebelser for å utvikle HPLC-ECD for en vurdering av 3-nitrotyrosine i atmosfæren, forventer vi bedre miljømessige renslighet, bedre helse.

Aerosol- eller luftbårne PM inneholder proteiner fra ulike biologiske opprinnelse, inkludert virus, prokaryoter, sopp, planter (stemt) og dyr (insekter, menneskelige)1. Forholdet mellom proteininnhold i PM er anslått til nesten 5%, som har vært innblandet spille en viktig rolle som en luftbårne allergener2. Siste rapportene tyder på at urbane ambient aerosol av ulike størrelser inneholder aminosyrer med prosenter varierer mellom 0,5% og 2%3. I tillegg er kjemiske modifikasjoner av PM proteiner foreslått genereres av reaksjoner av proteiner med forskjellige miljøgifter, som O3, nitrogendioksid (ingen2) og svoveldioksid (SO2)4.
3-NT-en protein modifikasjon, genereres av nitration av tyrosin rester. En høyere konsentrasjon av O3 og ingen2 har vist seg å fremme nitration av protein molekyler i pseudo atmosfæriske plass5,6. Nitration av tyrosin rester i polypeptid kjeden forbedrer allergifremkallende potensialet av pollen proteiner7. Således, kvantifisering og vurdering av luftbårne 3-NT er et viktig aspekt i møte bekymringene til miljørettet helsevern.
3-NT er også kjent som en biomarkør av oksidativt og nitrosative stress8. En voksende mengde bevis har vist en signifikant sammenheng 3-NT innhold med flere menneskelige sykdommer9,10. På grunn av dens skadevirkninger holder gjenkjenning og kvantitativ vurdering av 3-NT i en biologisk prøve stor relevans å bestemme tilstanden til en persons helse. De siste årene, ulike metoder har blitt introdusert for å beregne NT 3-innhold, inkludert enzym knyttet immunosorbent analyser, HPLC, og LC/MS11. I tidligere studier har vi rapportert en gjenkjennings-metoden bruker mye HPLC-ECD teknikken skjenket med flere fordeler sammenlignet med tidligere metoder. For eksempel krever HPLC-ECD ikke en utvinning eller derivatization prosedyre som gjør det en relativt enkel analysen systemet12. Vi har bekreftet at denne metoden er anvendelig å oppdage 3-NT fra biologiske prøver (plasma fra menneskelige og rotten).
Mange undersøkelser har understreket påvisning av 3-NT i biologiske prøver, oppdagelsen i nonbiological prøver forblir unnvikende og derfor studien har vært forfulgt. Faktisk, for å vurdere den skadelig effekten av luftbårne 3-NT, en kvantitativ metode som er nyttig å oppdage 3-NT direkte fra luftbårne partikler er påkrevd. Derfor vi brukt metoden for eksisterende HPLC-ECD å oppdage 3-NT fra PM2.5 samlet på et glassfiber filter. Ved hjelp av teknikken, 3-NT kan registreres direkte fra små biter (6 mm-diameter runde hull) av prøven fra et PM samling filter. Vi ytterligere vurdert innholdet i 3-NT for ulike PM størrelser og målt oppdagelsen grensen på 3-NT. Denne artikkel foreslår en høy-følsom og høy gjennomstrømming metode for å oppdage 3-NT direkte fra både nonbiological og biologiske prøver.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:940px;" width="940">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Quartz filter, backup quartz filter</td>
			<td style="width:240px;">PALL life sciences</td>
			<td style="width:168px;">7204</td>
			<td style="width:293px;">Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High-volume air sampler</td>
			<td style="width:240px;">SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td>
			<td style="width:168px;">HV-1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Particle size selector for SPM</td>
			<td style="width:240px;">SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td>
			<td style="width:168px;">080130-061</td>
			<td style="width:293px;">SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter.&#160; SPM is almost identical to PM7.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low-volume air sampler</td>
			<td style="width:240px;">SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td>
			<td style="width:168px;">AH-600F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Size classification unit for PM2.5</td>
			<td style="width:240px;">SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td>
			<td style="width:168px;">AH-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">Quartz filters for classification (PM4.5&#8211;2.5, PM7.3&#8211;4.5, PM15&#8211;7.3, and TSP-PM15)</td>
			<td style="width:240px;">Tokyo Dylec</td>
			<td style="width:168px;">AHQ-630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Non-specific protease cocktail</td>
			<td style="width:240px;">Roche</td>
			<td style="width:168px;">11459643001</td>
			<td style="width:293px;">Pronase from Streptomyces griseus&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">3-Nitrotyrosine</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td style="width:168px;">N7389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ultrafiltration membranes</td>
			<td style="width:240px;">Millipore</td>
			<td style="width:168px;">UFC5010BK</td>
			<td style="width:293px;">AMICON ULTRA 0.5 mL - 10kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">ECD</td>
			<td style="width:240px;">Eicom</td>
			<td style="width:168px;">HTEC-500, PEC-510</td>
			<td style="width:293px;">standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">HPLC column</td>
			<td style="width:240px;">Eicom</td>
			<td style="width:168px;">SC-5ODS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Data processor</td>
			<td style="width:240px;">Eicom</td>
			<td style="width:168px;">EPC-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Injector</td>
			<td style="width:240px;">Hitachi High-Tech Science&#160;</td>
			<td style="width:168px;">L-7200</td>
			<td style="width:293px;">Auto sampler</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Analyzing software</td>
			<td style="width:240px;">eDAQ Japan</td>
			<td style="width:168px;">ES280&#160;</td>
			<td style="width:293px;">PowerChrom software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of 3-nitrotyrosine in atmospheric environments via a high-performance liquid chromatography-electrochemical detector system

3-nitrotyrosine (3-NT) genereres fra tyrosin rester i atmosfæriske bio-aerosol proteiner via en reaksjon med ozon (O3) og nitrogendioksid (ingen2). Stabil 3-NT er en spesifikk markør for oksidative skader og er rapportert å ha en promotive effekt å lokke fram allergi. Studien rapporterer vi utviklingen av en svært følsom analysen å kvantifisere 3-NT i sampler luftfiltre samle < 2.5 µm svevestøv (PM2.5) fra urbane miljø luft, inkludert bio-aerosol. I denne metoden, en 6 mm-diameter runde hull ble kuttet fra filtrene av luft samplere og blandet med en uspesifisert protease cocktail for å hydrolyze proteiner. Protein prøver fordøyd til aminosyre nivå ble testet for 3-NT bruker en høy ytelse flytende kromatografi-elektrokjemiske detektor (såkalt HPLC-ECD). Maksimalt 3-NT innholdet ble oppdaget i en forhåndsfiltrere PM i størrelser fra 4,5 til 7.3 μm, med oppdagelsen limit 1.13 pg/m3.

HPLC-ECD prinsippet er enkelt. Prøver som inneholder målet skilles HPLC kolonne og mobile fase, og den separerte mål sammensatt er redusert og/eller oksidert i elektrokjemiske detektoren.
I HPLC-ECD systemet oppdages en 3-NT topp i ca 10 minutter. ECDs (PEC-510 og HTEC-500) er koblet sammen i HPLC linjen. Den første ECD reduserer hydroksyl gruppene i forbindelsene og neste oxidizes redusert kjemikalier. ECDs har en svært følsom rekkevidde av 10-15 M. Gjenkjenning grensen av HPLC-ECD var 1.13 pg/m3, som ble beregnet mean basale signal (mV) av 10 deler x 3.
Representative chromatograms vises i Figur 4. Ved å analysere en ren 3-NT-standard, en definitiv topp med en stabil plan kan være oppdaget (figur 4A). 3-NT i PM7 ble også målt med 6 mm rund-formet prøver (figur 4B).
Når det gjelder nøyaktigheten av 3-NT oppdagelsen evnen, når en 3-NT standard ble injisert i HPLC, ble toppen tilsvarer 3-NT oppdaget samtidig oppbevaring på 20 minutter. PM prøver, 3-NT var atskilt fra andre stoffer og uavhengige toppen ble oppdaget samtidig oppbevaring som standard. En typisk standardkurve er vist i figur 5der linearitet er observert mellom 5 og 40-nM. Linearitet kan bli sett opp til 500 nM (data ikke vist).
Tabell 1 viser 3-NT innholdet i atmosfæren, beregnet som pg/m3 luft. Den høyeste konsentrasjonen av 3-NT i en PM2.5 forhåndsfiltrere ble observert i #3 (PM7.3-4.5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig1.jpg"> Figur 1 : Samlingen ordning for TSP, PM7og PM2.5. (A) totalt suspenderte partiklene (TSP) samles inn direkte på en samling filter (på en strømningshastighet på 1000 L/min). (B) når PM7 samles, store partikler er utelukket ved en størrelse velger (på en strømningshastighet på 1000 L/min). (C) PM2.5 samles gjennom fire prefilters (på en strømningshastighet på 116 L/min). Et quartz-filter brukes vanligvis som backup filter for PM7 og PM2.5 eller som samling filter for TSP, som vist i figuren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig2.jpg"> Figur 2 : Utarbeidelse av en 6 mm runde sirkel. Samling filteret ble kuttet et hult punch verktøy med 6 mm diameter. Deretter ble prøven lagret i en 1,5 mL microtube. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig3.jpg"> Figur 3 : Skjematisk diagram av HPLC-ECD. 3-NT i en injisert prøve ble skilt i kolonnen HPLC der mobile fase renner. 3-NT ble redusert til aminotyrosine oksidert til iminotyrosine og oppdaget electrochemically på detektoren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig4.jpg"> Figur 4 : Typisk chromatograms i HPLC-ECD systemet. (A) ren 3-NT analysert av HPLC-ECD systemet. (B) 6 mm sirkel sample fra filtere PM7 brukes til å oppdage 3-NT. En 3-NT topp er angitt med en pil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig5.jpg"> Figur 5 : Standardkurven av ren 3-NT prøver. Resultatene på en lavere konsentrasjon er oppgitt i et annet diagram. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Emne</td>
			<td>Ukedager Samling</td>
			<td>Sted</td>
			<td>3-NT (pg/m3 luft)</td>
		</tr>
<tr>
<td>PM2.5</td>
			<td>Forhåndsfiltrere #1</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>8.25 ± 0,37</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Forhåndsfiltrere #2</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>29.66 ± 1,94</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Forhåndsfiltrere #3</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>74.37 ± 4.09</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Forhåndsfiltrere #4</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>32.70 ± 0,75</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Backfilter</td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
			<td>4.21 ± 0,91</td>
		</tr>
<tr>
<td>PM7</td>
			<td>Backfilter</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>89.16 ± 6.36</td>
		</tr>
<tr>
<td>TS</td>
			<td>Filter</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>10.34 ± 2.09</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: 3-NT i atmosfæren målt ved HPLC-ECD systemet. De 6 mm rund flekkene fra hvert filter ble målt ved hjelp av såkalt HPLC-ECD systemet. Prefilters #1 - #4 ble samlet i samme periode. Merk at konsentrasjonen av 3-NT i luften er påvirket av ulike faktorer, som samlet dato, år eller plassering. Dataene (n = 3-10) er representert som den gjennomsnittlig ± standardfeilen.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System at JoVE.com

Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System

Vi presenterer en metode for å oppdage 3-nitrotyrosine kjemiske modifikasjoner av atmosfæriske proteiner med 6 mm-diameter runder kuttet fra luften sampler prefilters ved hjelp av en høy ytelse flytende kromatografi-elektrokjemiske detektor (såkalt HPLC-ECD).

Påvisning av 3-Nitrotyrosine i atmosfæriske miljøer via en høy-ytelse flytende kromatografi-elektrokjemiske merker System

3-nitrotyrosine (3-NT) is generated from the tyrosine residue in atmospheric bio-aerosol proteins via a reaction with ozone (O3) and nitrogen dioxide ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i miljøforskning om Nitrapyrin og 3-nitrotyrosin. Den største fordelen med denne teknikken er at det er en unik og svært følsom metode for å oppdage 3-nitrotyrosin på luftprøvefiltre. For å samle totalt suspenderte partikler eller svevestøv på mindre enn syv mikron i størrelse, vei først et bindemiddel 3 kvartsfilter og fest det på en høyvolumluftprøvesprøve. Dekk filteret med en partikkelstørrelsesvelger for å samle PM7 eller la filteret avdekkes for å samle totalt suspenderte partikler. Kjør luftprøven på 1000 liter per minutt kontinuerlig i syv dager. Legg forfiltrene inn i en størrelsesklassifiseringsenhet og installer størrelsesklassifiseringsenheten og et reservefilter på luftprøveren med lavt volum. Kjør luftprøven på 116 kull per minutt kontinuerlig i syv dager for å samle PM2.5 på reservefilteret. Når prøvetakingen er ferdig, registreres det totale strømningsvolumet. Vei filteret og beregn vekten av de innsamlede partiklene. Forsegle filteret i en plastpose og lagre det på 30 grader Celsius.Neste forberede 500 mikroliter av 6X ikke-spesifikk protease cocktail og acetat buffer og plassere den i en dalasis membran med en molekylvekt cutoff av 5000 daltons. Senk den fylte membranen i 1 L av acetatbufferen og rør den ved 4 grader Celsius i 24 til 36 timer, og skift bufferen hver 12. Deretter fjerner du et filter fra fryseren og lar det varmes opp til romtemperatur mens det fortsatt er forseglet i posen. Slå deretter opp til fem 6 millimeter brede sirkler fra partikkelen dekket området av filteret, og plasser sirklene i en 1,5 milliliter mikro sentrifuge rør. Forbered 300 mikroliter acetatbuffer som inneholder 50

Research

JoVE Journal

Environment

Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Optimalisere Røykgass Innstillinger for å fremme Mikroalger Vekst i fotobioreaktorer via datasimulering

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Tracking Microbial Contamination in Retail Environments Using Fluorescent Powder - A Retail Delicatessen Environment Example

Sporing mikrobiell forurensning i Retail miljø Ved hjelp av fluorescerende pulver - En Retail Delicatessen Miljø Eksempel

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne ...

Exploring the Effects of Atmospheric Forcings on Evaporation: Experimental Integration of the Atmospheric Boundary Layer and Shallow Subsurface

Utforsker effekten av atmosfærisk pådriv på Fordamping: Experimental Integrasjon av Atmospheric Boundary Layer og Shallow Subsurface

Evaporation is directly influenced by the interactions between the atmosphere, land surface and soil subsurface. This work aims to experimentally study ...

Laboratory Simulation of an Iron(II)-rich Precambrian Marine Upwelling System to Explore the Growth of Photosynthetic Bacteria

Laboratory Simulation of an IronII-rich Precambrian Marine Upwelling System to Explore the Growth of Photosynthetic Bacteria

Laboratory Simulering av en Iron (II) rik prekambrium Marine Oppstrømning System til Utforsk Vekst av fotosyntetiske bakterier

A conventional concept for the deposition of some Precambrian Banded Iron Formations (BIF) proceeds on the assumption that ferrous iron [Fe(II)] upwelling ...

Extraction and Characterization of Surfactants from Atmospheric Aerosols

Ekstraksjon og karakterisering av overflateaktive midler fra atmosfære Aerosoler

Surface-active compounds, or surfactants, present in atmospheric aerosols are expected to play important roles in the formation of liquid water clouds in ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Måle og kartlegge jorderosjon og deponering relatert til jord Carbonate konsentrasjoner Under landbruks forvaltningen

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

Stedets molekylær påvisning av jord-Borne Phytopathogens ved å bruke en bærbar sanntid PCR

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

In Situ Hybridisering teknikker for parafin-Embedded voksen Coral prøver

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

Sampling, Sorting, and Characterizing Microplastics in Aquatic Environments with High Suspended Sediment Loads and Large Floating Debris

Prøvetaking, sortering og karakteriserer Microplastics i akvatiske miljøer med høy suspendert Sediment laster og stort flytende avfall

The ubiquitous presence of plastic debris in the ocean is widely recognized by the public, scientific communities, and government agencies. However, only ...