Nous tenons à remercier Mme Rui Chen pour la dissection et les images de la drosophile CNS illustrés sur les figures.

1. matériel et matériaux
<ol><li>Préparer les composants requis (répertoriés dans la Table des matières) de la plate-forme d’électrophysiologie pour effectuer des enregistrements d’électrode d’aspiration de la drosophile CNS. Remarque : Avant expérimentation, il est nécessaire de construire des chambres pour la dissection de la drosophile CNS et à utiliser pour les ganglions dans une solution saline de baignade pendant les enregistrements. Un plan étape par étap...

<ol>
	<li>Sparks, T. C., Nauen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRAC:+Mode+of+action+classification+and+insecticide+resistance+management.">IRAC: Mode of action classification and insecticide resistance management.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 121, 122-128 (2015).</li><li>Swale, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insecticide+resistance-breaking+mosquitocide+targeting+inward+rectifier+potassium+channels+in+vectors+of+Zika+virus+and+malaria.">An insecticide resistance-breaking mosquitocide targeting inward rectifier potassium channels in vectors of Zika virus and malaria.</a> Scientific Reports. 6, 36954 (2016).</li><li>Troczka, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+expression+and+functional+characterisation+of+the+diamondback+moth+ryanodine+receptor+G4946E+variant+conferring+resistance+to+diamide+insecticides.">Stable expression and functional characterisation of the diamondback moth ryanodine receptor G4946E variant conferring resistance to diamide insecticides.</a> Scientific Reports. 5, 14680 (2015).</li><li>Bloomquist, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+potassium+KV2+channels+as+new+targets+for+insecticides.">Voltage-sensitive potassium KV2 channels as new targets for insecticides.</a> Biopesticides: State of the Art and Future Opportunities. 1172, 71-81 (2014).</li><li>Jenson, L. J., Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+serum+and+ion+channel+block+on+growth+and+hormonally-induced+differentiation+of+Spodoptera+frugiperda+(Sf21)+insect+cells.">Role of serum and ion channel block on growth and hormonally-induced differentiation of Spodoptera frugiperda (Sf21) insect cells.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 90 (3), 131-139 (2015).</li><li>Jenson, L. J., Sun, B., Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+potassium+channels+expressed+after+20-Hydroxyecdysone+treatment+of+a+mosquito+cell+line.">Voltage-sensitive potassium channels expressed after 20-Hydroxyecdysone treatment of a mosquito cell line.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biolology. 87, 75-80 (2017).</li><li>Chintapalli, V. R., Wang, J., Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+FlyAtlas+to+identify+better+Drosophila+melanogaster+models+of+human+disease.">Using FlyAtlas to identify better Drosophila melanogaster models of human disease.</a> Nature Genetics. 39 (6), 715-720 (2007).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li><li>St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+Drosophila+melanogaster.">The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).</li><li>Luan, Z., Li, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+channels+in+Drosophila.">Inwardly rectifying potassium channels in Drosophila.</a> Sheng Li Xue Bao. 64 (5), 515-519 (2012).</li><li>Muenzing, S. E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larvalign:+Aligning+gene+expression+patterns+from+the+larval+brain+of+Drosophila+melanogaster.">Larvalign: Aligning gene expression patterns from the larval brain of Drosophila melanogaster.</a> Neuroinformatics. 16 (1), 65-80 (2017).</li><li>Sprecher, S. G., Reichert, H., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+patterns+in+primary+neuronal+clusters+of+the+Drosophila+embryonic+brain.">Gene expression patterns in primary neuronal clusters of the Drosophila embryonic brain.</a> Gene Expression Patterns. 7 (5), 584-595 (2007).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+for+toxicogenomics:+Genetic+variation+in+susceptibility+to+heavy+metal+exposure.">A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure.</a> PLoS Genetics. 13 (7), e1006907 (2017).</li><li>Manev, H., Dimitrijevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+model+for+in+vivo+pharmacological+analgesia+research.">Drosophila model for in vivo pharmacological analgesia research.</a> European Journal of Pharmacology. 491 (2-3), 207-208 (2004).</li><li>Pandey, U. B., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+disease+models+in+Drosophila+melanogaster+and+the+role+of+the+fly+in+therapeutic+drug+discovery.">Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery.</a> Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).</li><li>Hekmat-Scafe, D. S., Lundy, M. Y., Ranga, R., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+K+/Cl-+cotransporter+gene+kazachoc+(kcc)+increase+seizure+susceptibility+in+Drosophila.">Mutations in the K+/Cl- cotransporter gene kazachoc (kcc) increase seizure susceptibility in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 26 (35), 8943-8954 (2006).</li><li>Whitworth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutathione+S-transferase+activity+rescues+dopaminergic+neuron+loss+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (22), 8024-8029 (2005).</li><li>Watson, M. R., Lagow, R. D., Xu, K., Zhang, B., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+for+amyotrophic+lateral+sclerosis+reveals+motor+neuron+damage+by+human+SOD1.">A Drosophila model for amyotrophic lateral sclerosis reveals motor neuron damage by human SOD1.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24972-24981 (2008).</li><li>Rajendra, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+melanogaster+model+of+spinal+muscular+atrophy+reveals+a+function+for+SMN+in+striated+muscle.">A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle.</a> Journal of Cell Biology. 176 (6), 831-841 (2007).</li><li>Chan, H. Y., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+of+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila models of human neurodegenerative disease.</a> Cell Death and Differentiation. 7 (11), 1075-1080 (2000).</li><li>Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+blood-brain+barrier:+development+and+function+of+a+glial+endothelium.">The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+characterization+of+the+entire+interneuron+population+reveals+principles+of+neuromere+organization+in+the+ventral+nerve+cord+of+Drosophila.">Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 31 (44), 15870-15883 (2011).</li><li>Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+the+mesenchymal-epithelial+transition+of+blood-brain+barrier+forming+glia+in+Drosophila.">Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila.</a> Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li><li>Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+to+predict+drug+permeation+across+the+blood-brain+barrier,+and+distribution+to+brain.">Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain.</a> Current Drug Metabolism. 9 (9), 901-910 (2008).</li><li>Swale, D. R., Sun, B., Tong, F., Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxicity+and+mode+of+action+of+N,+N-diethyl-meta-toluamide+(DEET).">Neurotoxicity and mode of action of N, N-diethyl-meta-toluamide (DEET).</a> PLoS One. 9 (8), e103713 (2014).</li><li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+larval+CNS+in+Drosophila+melanogaster.">Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (1), 85 (2006).</li><li>Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+of+atracotoxin+at+central+and+peripheral+synapses+of+insects.">Mode of action of atracotoxin at central and peripheral synapses of insects.</a> Invertebrate Neuroscience. 5 (1), 45-50 (2003).</li><li>Bloomquist, J. R., Roush, R. T., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+neuronal+sensitivity+to+dieldrin+and+picrotoxinin+in+a+cyclodiene-resistant+strain+of+Drosophila+melanogaster+(Meigen).">Reduced neuronal sensitivity to dieldrin and picrotoxinin in a cyclodiene-resistant strain of Drosophila melanogaster (Meigen).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 19 (1), 17-25 (1992).</li><li>Mutunga, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxicology+of+bis(n)-tacrines+on+Blattella+germanica+and+Drosophila+melanogaster+acetylcholinesterase.">Neurotoxicology of bis(n)-tacrines on Blattella germanica and Drosophila melanogaster acetylcholinesterase.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 83 (4), 180-194 (2013).</li><li>Chen, R., Swale, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+(Kir)+channels+represent+a+critical+ion+conductance+pathway+in+the+nervous+systems+of+insects.">Inwardly rectifying potassium (Kir) channels represent a critical ion conductance pathway in the nervous systems of insects.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1617 (2018).</li><li>Francis, S. A., Taylor-Wells, J., Gross, A. D., Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+and+physiological+actions+of+carbonic+anhydrase+inhibitors+to+Aedes+aegypti+and+Drosophila+melanogaster.">Toxicity and physiological actions of carbonic anhydrase inhibitors to Aedes aegypti and Drosophila melanogaster.</a> Insects. 8 (1), 2 (2016).</li><li>Swale, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitor+profile+of+bis(n)-tacrines+and+N-methylcarbamates+on+acetylcholinesterase+from+Rhipicephalus+(Boophilus)+microplus+and+Phlebotomus+papatasi.">Inhibitor profile of bis(n)-tacrines and N-methylcarbamates on acetylcholinesterase from Rhipicephalus (Boophilus) microplus and Phlebotomus papatasi.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 85-92 (2013).</li><li>Corbel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+inhibition+of+cholinesterases+in+insect+and+mammalian+nervous+systems+by+the+insect+repellent+deet.">Evidence for inhibition of cholinesterases in insect and mammalian nervous systems by the insect repellent deet.</a> BMC Biology. 7, 47 (2009).</li></ol>

Les détails fournis dans la vidéo associée et texte ont fourni des étapes clés afin d’enregistrer l’activité et l’épi s’acquitter de fréquence de la drosophile CNS ex vivo. L’efficacité de la dissection est l’aspect le plus important de la méthode parce que peu de neurones décroissant ou court réduira la taux qui se traduira par grands écarts entre les répétitions de combustion de base. Cependant, une fois que la technique de dissection a été maîtrisée, les données recuei...

L’objectif global de cette approche est de permettre aux chercheurs de mesurer rapidement l’électrogénèse du système nerveux central (SNC) chez l’insecte modèle, Drosophila melanogaster. Cette méthode est fiable, rapide et rentable d’effectuer l’expérimentation physiologique et toxicologique. Le CNS est essentiel pour la vie et par conséquent, les voies physiologiques essentiels pour le bon fonctionnement neuronal ont été explorées intensivement dans un effort pour comprendre ou modifier la fonction neurale. Caractérisation des voies de signalisation dans le système nerveux central arthropod a permis la découverte de plusieurs classes chimiques des insecticides qui perturbent la fonction neurale d’invertébrés pour induire la mortalité tout en limitant les conséquences hors cible. Ainsi, la capacité de mesurer l’activité neurale des insectes est d’un intérêt majeur pour le domaine de la physiologie et toxicologie insecte étant donné que le système nerveux est le tissu de cible de la plupart des insecticides déployé1. Pourtant, suite à une croissance des connaissances fondamentales et appliquées sur l’insectes du système nerveux nécessite des techniques neurophysiologiques avancées qui sont limitées à une faisabilité, étant donné que les techniques actuelles sont demande beaucoup de travail et nécessitent une grande dépense, insecte lignées de cellules neurales sont limitées, et/ou il y a un accès limité aux synapses centrales de la plupart des arthropodes. Caractérisation de la plupart des protéines neuronales insectes exige actuellement, la cible ne la découverte de médicaments suivantes clonés et façon hétérologue expresse pour et enregistrements électrophysiologiques, qu’a été décrit pour les canaux potassiques de rectification entrante insectes2 , récepteur de la ryanodine insectes3, moustiques sensibles au voltage K+ canaux4et d’autres. Pour atténuer le besoin d’expression hétérologue et le potentiel d’expression fonctionnelle faible, Bloomquist et collègues visant à induire un phénotype neuronal dans Spodoptera frugiperda (Sf21) cellules cultivées comme nouvelle méthode pour insecticide découverte5,6. Ces méthodes fournissent une approche valable pour le développement de la chimie nouvelle, mais ils créent souvent un goulot d’étranglement insurmontable pour la caractérisation des agents pharmacologiques, identifier des mécanismes de résistance aux insecticides et caractérisation des principes physiologiques fondamentaux. Nous décrivons ici une méthode ex vivo qui permet l’enregistrement de l’activité électrique d’un insecte de modèle qui a malléable génétique7,8,9 et des modèles d’expressions connus de neurones complexes de10,11,12 pour permettre la caractérisation des mécanismes de résistance au niveau du nerf, le mode d’action des nouveaux médicaments et autres études toxicologiques.
La mouche à fruit, d. melanogaster, est un organisme modèle commun pour la définition des systèmes neuronaux insectes ou mécanisme insecticide d’action et a été établi comme un organisme modèle bien adapté pour l’étude toxicologique13, pharmacologiques14 ,15, neurophysiologiques16et physiopathologiques17,18,19,20 processus de vertébrés. D.melanogaster est un insecte holométaboles qui effectue la métamorphose complète, y compris un stade larvaire et nymphal avant d’atteindre le stade adulte reproducteur. Tout au long du processus de développement, le système nerveux subit un remodelage important à différents stades de vie, mais le CNS larvaire fera l’objet de cette méthodologie. La décélération CNS larvaire est anatomiquement simple avec des segments thoraciques et abdominales qui sont fusionnés et forment le ganglion ventral, qui représente un tableau de neuromeric répétées et presque identiques unités21,22. Descendant des nerfs moteurs proviennent de l’extrémité caudale des ganglions sous-oesophagien et descendre pour innerver les muscles de la paroi du corps et des organes viscéraux des larves. La figure 1 décrit l’anatomie générale de la larves de drosophile CNS.
La barrière Drosophila sang - encéphalique (BHE) se développe à la fin de l’embryogenèse et est formée par la subperineurial des cellules gliales (SPG)21. Les cellules SPG forment de nombreux processus filopodes-like qui se propagent à établir une feuille de contigus, très plate, endothéliales semblable qui couvre l’ensemble de Drosophila CNS23. La drosophile BBB a des similitudes avec le vertébrés BBB, qui comprend à préserver l’homéostasie du microenvironnement neuronaux en contrôlant l’entrée des nutriments et des xénobiotiques dans le CNS21. C’est une condition sine qua non pour la transmission neuronale fiable et fonction, mais la protection du SNC par le BBB restreint la perméation de drogues de synthèse, la plupart des peptides et autres xénobiotiques24,25, qui introduit le potentiel problèmes lors de caractériser les puissances de modulateurs de petites molécules. La méthode utilise une transection simple pour perturber cette barrière prêt pharmacologique et y accéder et les synapses centrales. La plus grande force de la méthodologie décrite est la simplicité, la reproductibilité et relativement haut débit capacité inhérente à ce système. Le protocole est relativement facile à maîtriser, l’installation requiert peu d’espace, et seulement un apport financier initial est nécessaire qui est réduite à réactifs et consommables. En outre, la méthode décrite est complètement modifiable pour enregistrer l’activité centrale de nerf décroissant de la mouche domestique, Musca domestica26.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster (strain OR)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Kinetic Systems</td>
			<td>9200 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday Cage</td>
			<td>Kinetic Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope on a Boom</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800N</td>
			<td>Multiple scopes can be used; boom stand is critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/DC differential amplifier</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>AM3000H</td>
			<td>The model 1700 can be used instead of the model 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>audio monitor</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>AM3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hum Bug Noise Eliminator</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>726300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition System (PowerLab)</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>PL3504</td>
			<td>Multiple PowerLab models can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Chart Pro Software</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>N/A - Online Download</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Lights</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>89-740</td>
			<td>Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holder</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH715</td>
			<td>Different models are acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC cables</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>multiple based on size</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PG52151-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Also can use Narashige PC-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Wax</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>974228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-coated insect pins, size #2</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1208S2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fince Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recording of the central nervous system activity of third-instar drosophila melanogaster

La majorité des insecticides disponibles actuellement cible le système nerveux et des mutations génétiques des protéines neuronales invertébrés donnent souvent des conséquences délétères, mais les méthodes actuelles pour l’enregistrement de l’activité du système nerveux d’un individu l’animal est coûteuse et laborieuse. Cette aspiration électrode préparation du troisième stade larvaire central nerveux système de Drosophila melanogaster, est un système souple pour tester les effets physiologiques des agents de neuroactive, déterminer le rôle physiologique des différents neurones voies d’activité de la CNS, ainsi que l’influence de mutations génétiques à fonction neurale. Cette préparation ex vivo nécessite seulement modérée disséquant les compétences et l’expertise électrophysiologique générer des enregistrements reproductibles de l’activité neuronale insecte. Une grande variété de modulateurs chimiques, y compris les peptides, puis peut être appliquée que directement sur le système nerveux en solution avec du sérum physiologique pour mesurer l’influence sur l’activité de la CNS. Technologies plus, génétiques, comme le système de GAL4/UAS, peuvent être appliquées indépendamment ou en collaboration avec des agents pharmacologiques afin de déterminer le rôle des canaux ioniques spécifiques, transporteurs ou récepteurs d’arthropode fonction CNS. Dans ce contexte, les essais décrits dans les présentes sont d’un intérêt majeur pour les toxicologues insecticide insectes physiologistes et des biologistes du développement pour laquelle d. melanogaster est un organisme modèle établi. Le but du présent protocole est de décrire une méthode électrophysiologique pour permettre la mesure de l’électrogénèse du système nerveux central chez l’insecte modèle, Drosophila melanogaster, qui est utile pour tester une diversité des scientifiques hypothèses.

L’activité spontanée des nerfs périphériques décroissant découlant de la drosophile du système nerveux central peut être enregistrée en utilisant des électrodes d’aspiration extracellulaires avec une reproductibilité cohérente. L’activité spontanée de l’excisée et percement Drosophila CNS produit un modèle cyclique d’éclatement avec 1-2 s de tir avec environ 1 s de près l’activité quiescente. Par exemple, le système nerveux central se trou...

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Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

Ce protocole décrit une méthode pour enregistrer l’activité électrique descendante du système nerveux central Drosophila melanogaster pour permettre le rapport coût-efficacité et pratique essais d’agents pharmacologiques, les mutations génétiques des protéines neuronales, et/ou le rôle des voies physiologiques inexplorées.

Enregistrement électrophysiologique de l’activité du système nerveux Central du troisième stade de Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans les domaines de la toxicologie des insectes et de la physiologie des insectes en mesurant l’électrogenèse du système nerveux central de Drosophila melanogaster. Cela permet de tester un large éventail d’hypothèses scientifiques et d’aider à la découverte de nouveaux modes d’action insecticides. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit un système simple, reproductible et relativement élevé avec un apport financier minimal pour étudier le système nerveux de la drosophile.Pour commencer, ouvrez le logiciel d’acquisition/analyse. Cliquez sur Configuration dans la barre d’outils principale et sélectionnez Paramètres de canal, qui ouvrira une boîte de dialogue. Réduisez le nombre total de canaux à trois.Le canal 1 enregistrera le signal brut de l’amplificateur avec une portée de 100 millivolts. Le canal deux sera utilisé pour compter le nombre d’événements du canal un qui sont au-dessus d’un seuil donné. Pour cela, cliquez sur l’onglet Calcul pour ouvrir un menu drop-down pour le canal deux.Sélectionnez Mesures cycliques, qui ouvriront une deuxième boîte de dialogue. Sélectionnez le canal un comme source. Ensuite, sur la mesure du menu drop-down, sélectionnez Spike unitaire lors des événements.Enfin, dans la zone paramètres de détection, à partir du menu drop-down, sélectionnez Seuil simple. Le niveau de seuil est l’entrée sur la fenêtre d’ajustement de détection à définir au-dessus du bruit de fond. Pour convertir l’activité électrique en une parcelle de taux exprimée en hertz, sélectionnez Arithmétique sur le troisième canal.Sur la nouvelle fenêtre, entrée 1000 fois smoothsec, parenthèses canal deux virgule deux. Ensuite, sélectionnez au menu de drop-down des unités l’unité de fréquence hertz. Fermez les boîtes de dialogue pour revenir à l’écran principal.L’axe y du canal trois doit être exprimé dans hertz et l’axe x dans le temps. Disséquer la larvaire Drosophila CNS en identifiant et en extrayant d’abord un troisième stade errant Drosophila melanogaster du flacon de culture et en le plaçant dans 200 microlitres de solution saline. Ensuite, saisissez les crochets de la bouche avec une paire de forceps fins, et prenez l’abdomen de l’asticot avec une deuxième paire de forceps, avec une légère pression, pour éviter de déchirer la mince couche cuticulaire.Tirez doucement les crochets de la bouche et l’abdomen dans différentes directions pour séparer l’extrémité caudale de l’asticot de la région de la tête et exposer les viscères de l’asticot. Le SNC sera étroitement lié à la trachée et au tube digestif. Taquiner le SNC hors du tube digestif et de la trachée avec des forceps.La dissection du système nerveux central de Drosophila de l’asticot est une étape critique pour le succès. Les ganglions disséqués doivent être intacts, sans dommages significatifs aux nerfs moteurs descendants. Un plus grand nombre de nerfs moteurs attachés aux ganglions augmenteront les fréquences de tir de base.Si nécessaire, perturber la barrière céphalo-encéphalique en transectant manuellement le postérieur du SNC aux lobes cérébraux avec des ciseaux à ressort Vannas. La transection doit être effectuée en fonction des propriétés physiochimiques du produit chimique utilisé. La ligne rouge est le point de transection suggéré et le SNC transected avec les troncs périphériques intacts de nerf descendant montrés ici.Pour commencer, tirez d’abord l’électrode de pipette en verre des capillaires en verre borosilicate à une résistance de cinq à 15 mégaohms. Insérez le SNC transecté dans une chambre de cire contenant 200 microlitres de solution saline. Serrez une épingle à insectes non cintrée avec un clip alligator soudé au fil de terre, et insérez la broche dans la solution saline pour compléter le circuit.À l’aide des micromanipulateurs, orientez l’électrode vers l’extrémité caudale du SNC transecté. Éliminez le bruit de fond en ajustant le seuil dans le logiciel d’acquisition/analyse avant de connecter les troncs nerveux périphériques. Appliquez une légère pression négative sur la seringue pour attirer les nerfs périphériques dans l’électrode d’aspiration.Démarrez l’enregistrement sur le logiciel d’acquisition de données et le taux de tir de base pour l’équilibrer pendant cinq minutes avant de recueillir des données de taux de tir de base. Après cinq minutes, ajouter 200 microlitres de solution saline et de véhicule pour porter le volume total de la chambre à 400 microlitres pour commencer à enregistrer les taux de tir de commande. Jetez la préparation et l’enregistrement si le modèle de cuisson du traitement de contrôle n’est pas similaire à l’exemple montré ici.Lorsque la ligne de base a été établie après trois à cinq minutes d’enregistrement, retirez 200 microlitres de solution saline et ajoutez 200 microlitres de l’agent expérimental solubilisé en solution saline. Étiquetez ce point de temps d’application de médicaments dans le logiciel d’acquisition/analyse en incluant un commentaire qui inclut le médicament et la concentration finale. Il est indiqué ici qu’il y a une trace représentative de décharge nerveuse avant et après l’exposition au DMSO.La flèche indique l’heure d’application. On voit une réponse limitée au DMSO. L’augmentation des doses de propoxur a amplifié la fréquence de décharge de pointe du CNS transected de Drosophila d’une manière concentration-dépendante, alors que le neurodepresseur GABA a réduit la fréquence de décharge de pointe d’une manière concentration-dépendante.Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler qu’il s’agit d’une expérience ex vivo, et donc les conditions de la solution saline, comme le pH et la température, est critique pour l’activité prolongée de la préparation du système nerveux central. De même, le manque d’activité électrique extraneous, une cage efficace de Faraday, et une réduction du bruit de 60-hertz sont critiques pour le succès de cet essai. Les données recueillies grâce à cet essai peuvent aider à identifier le mode d’action spécifique des insecticides.La validation ultérieure de ces données par d’autres méthodes telles que l’électrophysiologie tension-pince, les analyses biochimiques, et les essais pharmacologiques additionnels peut être exécutée.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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