Vorremmo ringraziare ms. Rui Chen per la dissezione e immagini di Drosophila CNS mostrato nelle figure.

1. attrezzature e materiali
<ol><li>Preparare i componenti necessari (elencati in Tabella materiali) dell'impianto di perforazione elettrofisiologia per eseguire registrazioni di aspirazione elettrodo di Drosophila CNS. Nota: Prima della sperimentazione, è necessario costruire alloggiamenti per dissezione della drosofila CNS e da utilizzarsi per la balneazione dei gangli in soluzione salina durante le registrazioni. Seguito viene fornito un profilo graduale di costruzione a camera...

<ol>
	<li>Sparks, T. C., Nauen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRAC:+Mode+of+action+classification+and+insecticide+resistance+management.">IRAC: Mode of action classification and insecticide resistance management.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 121, 122-128 (2015).</li><li>Swale, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insecticide+resistance-breaking+mosquitocide+targeting+inward+rectifier+potassium+channels+in+vectors+of+Zika+virus+and+malaria.">An insecticide resistance-breaking mosquitocide targeting inward rectifier potassium channels in vectors of Zika virus and malaria.</a> Scientific Reports. 6, 36954 (2016).</li><li>Troczka, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+expression+and+functional+characterisation+of+the+diamondback+moth+ryanodine+receptor+G4946E+variant+conferring+resistance+to+diamide+insecticides.">Stable expression and functional characterisation of the diamondback moth ryanodine receptor G4946E variant conferring resistance to diamide insecticides.</a> Scientific Reports. 5, 14680 (2015).</li><li>Bloomquist, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+potassium+KV2+channels+as+new+targets+for+insecticides.">Voltage-sensitive potassium KV2 channels as new targets for insecticides.</a> Biopesticides: State of the Art and Future Opportunities. 1172, 71-81 (2014).</li><li>Jenson, L. J., Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+serum+and+ion+channel+block+on+growth+and+hormonally-induced+differentiation+of+Spodoptera+frugiperda+(Sf21)+insect+cells.">Role of serum and ion channel block on growth and hormonally-induced differentiation of Spodoptera frugiperda (Sf21) insect cells.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 90 (3), 131-139 (2015).</li><li>Jenson, L. J., Sun, B., Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+potassium+channels+expressed+after+20-Hydroxyecdysone+treatment+of+a+mosquito+cell+line.">Voltage-sensitive potassium channels expressed after 20-Hydroxyecdysone treatment of a mosquito cell line.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biolology. 87, 75-80 (2017).</li><li>Chintapalli, V. R., Wang, J., Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+FlyAtlas+to+identify+better+Drosophila+melanogaster+models+of+human+disease.">Using FlyAtlas to identify better Drosophila melanogaster models of human disease.</a> Nature Genetics. 39 (6), 715-720 (2007).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li><li>St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+Drosophila+melanogaster.">The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).</li><li>Luan, Z., Li, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+channels+in+Drosophila.">Inwardly rectifying potassium channels in Drosophila.</a> Sheng Li Xue Bao. 64 (5), 515-519 (2012).</li><li>Muenzing, S. E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larvalign:+Aligning+gene+expression+patterns+from+the+larval+brain+of+Drosophila+melanogaster.">Larvalign: Aligning gene expression patterns from the larval brain of Drosophila melanogaster.</a> Neuroinformatics. 16 (1), 65-80 (2017).</li><li>Sprecher, S. G., Reichert, H., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+patterns+in+primary+neuronal+clusters+of+the+Drosophila+embryonic+brain.">Gene expression patterns in primary neuronal clusters of the Drosophila embryonic brain.</a> Gene Expression Patterns. 7 (5), 584-595 (2007).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+for+toxicogenomics:+Genetic+variation+in+susceptibility+to+heavy+metal+exposure.">A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure.</a> PLoS Genetics. 13 (7), e1006907 (2017).</li><li>Manev, H., Dimitrijevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+model+for+in+vivo+pharmacological+analgesia+research.">Drosophila model for in vivo pharmacological analgesia research.</a> European Journal of Pharmacology. 491 (2-3), 207-208 (2004).</li><li>Pandey, U. B., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+disease+models+in+Drosophila+melanogaster+and+the+role+of+the+fly+in+therapeutic+drug+discovery.">Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery.</a> Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).</li><li>Hekmat-Scafe, D. S., Lundy, M. Y., Ranga, R., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+K+/Cl-+cotransporter+gene+kazachoc+(kcc)+increase+seizure+susceptibility+in+Drosophila.">Mutations in the K+/Cl- cotransporter gene kazachoc (kcc) increase seizure susceptibility in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 26 (35), 8943-8954 (2006).</li><li>Whitworth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutathione+S-transferase+activity+rescues+dopaminergic+neuron+loss+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (22), 8024-8029 (2005).</li><li>Watson, M. R., Lagow, R. D., Xu, K., Zhang, B., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+for+amyotrophic+lateral+sclerosis+reveals+motor+neuron+damage+by+human+SOD1.">A Drosophila model for amyotrophic lateral sclerosis reveals motor neuron damage by human SOD1.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24972-24981 (2008).</li><li>Rajendra, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+melanogaster+model+of+spinal+muscular+atrophy+reveals+a+function+for+SMN+in+striated+muscle.">A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle.</a> Journal of Cell Biology. 176 (6), 831-841 (2007).</li><li>Chan, H. Y., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+of+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila models of human neurodegenerative disease.</a> Cell Death and Differentiation. 7 (11), 1075-1080 (2000).</li><li>Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+blood-brain+barrier:+development+and+function+of+a+glial+endothelium.">The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+characterization+of+the+entire+interneuron+population+reveals+principles+of+neuromere+organization+in+the+ventral+nerve+cord+of+Drosophila.">Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 31 (44), 15870-15883 (2011).</li><li>Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+the+mesenchymal-epithelial+transition+of+blood-brain+barrier+forming+glia+in+Drosophila.">Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila.</a> Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li><li>Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+to+predict+drug+permeation+across+the+blood-brain+barrier,+and+distribution+to+brain.">Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain.</a> Current Drug Metabolism. 9 (9), 901-910 (2008).</li><li>Swale, D. R., Sun, B., Tong, F., Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxicity+and+mode+of+action+of+N,+N-diethyl-meta-toluamide+(DEET).">Neurotoxicity and mode of action of N, N-diethyl-meta-toluamide (DEET).</a> PLoS One. 9 (8), e103713 (2014).</li><li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+larval+CNS+in+Drosophila+melanogaster.">Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (1), 85 (2006).</li><li>Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+of+atracotoxin+at+central+and+peripheral+synapses+of+insects.">Mode of action of atracotoxin at central and peripheral synapses of insects.</a> Invertebrate Neuroscience. 5 (1), 45-50 (2003).</li><li>Bloomquist, J. R., Roush, R. T., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+neuronal+sensitivity+to+dieldrin+and+picrotoxinin+in+a+cyclodiene-resistant+strain+of+Drosophila+melanogaster+(Meigen).">Reduced neuronal sensitivity to dieldrin and picrotoxinin in a cyclodiene-resistant strain of Drosophila melanogaster (Meigen).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 19 (1), 17-25 (1992).</li><li>Mutunga, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxicology+of+bis(n)-tacrines+on+Blattella+germanica+and+Drosophila+melanogaster+acetylcholinesterase.">Neurotoxicology of bis(n)-tacrines on Blattella germanica and Drosophila melanogaster acetylcholinesterase.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 83 (4), 180-194 (2013).</li><li>Chen, R., Swale, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+(Kir)+channels+represent+a+critical+ion+conductance+pathway+in+the+nervous+systems+of+insects.">Inwardly rectifying potassium (Kir) channels represent a critical ion conductance pathway in the nervous systems of insects.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1617 (2018).</li><li>Francis, S. A., Taylor-Wells, J., Gross, A. D., Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+and+physiological+actions+of+carbonic+anhydrase+inhibitors+to+Aedes+aegypti+and+Drosophila+melanogaster.">Toxicity and physiological actions of carbonic anhydrase inhibitors to Aedes aegypti and Drosophila melanogaster.</a> Insects. 8 (1), 2 (2016).</li><li>Swale, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitor+profile+of+bis(n)-tacrines+and+N-methylcarbamates+on+acetylcholinesterase+from+Rhipicephalus+(Boophilus)+microplus+and+Phlebotomus+papatasi.">Inhibitor profile of bis(n)-tacrines and N-methylcarbamates on acetylcholinesterase from Rhipicephalus (Boophilus) microplus and Phlebotomus papatasi.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 85-92 (2013).</li><li>Corbel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+inhibition+of+cholinesterases+in+insect+and+mammalian+nervous+systems+by+the+insect+repellent+deet.">Evidence for inhibition of cholinesterases in insect and mammalian nervous systems by the insect repellent deet.</a> BMC Biology. 7, 47 (2009).</li></ol>

I dettagli forniti nel video associato e testo hanno fornito passaggi chiave al fine di registrare l'attività e spike scaricano frequenza di Drosophila CNS ex vivo. L'efficacia di dissezione è l'aspetto più critico del metodo perché breve o pochi neuroni discendenti ridurrà la linea di base tasso che si tradurrà in grandi scostamenti tra repliche di infornamento. Tuttavia, una volta che la tecnica di dissezione è stata masterizzata, i dati raccolti con questa analisi sono altamente riproducibili ...

L'obiettivo generale di questo approccio è quello di consentire ai ricercatori di misurare rapidamente l'electrogenesis del sistema nervoso centrale (CNS) nell'insetto modello, Drosophila melanogaster. Questo metodo è affidabile, veloce e conveniente per eseguire esperimenti fisiologici e tossicologici. Lo SNC è essenziale per la vita e di conseguenza, le vie fisiologiche critiche per la corretta funzione neurale sono stati esplorati estesamente nel tentativo di comprendere o modificare la funzione neurale. Caratterizzazione delle vie di segnalazione all'interno del SNC dell'artropodo ha permesso la scoperta di diverse classi di chimiche di insetticidi che interrompono la funzione neurale invertebrati marini per indurre la mortalità limitando le conseguenze fuori bersaglio. Così, la capacità di misurare l'attività neurale degli insetti è di notevole interesse nel campo della fisiologia e tossicologia degli insetti poiché il sistema nervoso è il tessuto dell'obiettivo della maggioranza degli insetticidi distribuito1. Ancora, ha continuato la crescita della conoscenza fondamentale ed applicata per quanto riguarda il sistema nervoso degli insetti richiede avanzate tecniche neurofisiologiche che sono limitate nella fattibilità, poiché le tecniche attuali sono lavoro intensivo e richiedono una spesa elevata, insetto linee cellulari neurali sono limitate, e/o di accesso limitato per le sinapsi centrali della maggior parte degli artropodi. Attualmente, la caratterizzazione della maggior parte delle proteine neurali dell'insetto richiede l'obiettivo di essere clonato e heterologously espresse per successive drug discovery e registrazioni elettrofisiologiche, come è stato descritto per i canali di potassio insetto raddrizzatore2 , insetto rianodina recettore3, zanzara tensione-sensibili K+ canali4e altri. Per attenuare il requisito per l'espressione eterologa e il potenziale di espressione funzionale basso, Bloomquist e colleghi mirati a indurre un fenotipo neuronale in Spodoptera frugiperda (Sf21) cellule coltivate come un nuovo metodo per insetticida scoperta5,6. Questi metodi forniscono un valido approccio per lo sviluppo della nuova chimica, ma creano spesso un collo di bottiglia insormontabile per la caratterizzazione degli agenti farmacologici, identificazione dei meccanismi di resistenza agli insetticidi e caratterizzazione dei principi fisiologici fondamentali. Qui, descriviamo un metodo di ex vivo che consente la registrazione dell'attività elettrica da un insetto di modello che ha malleabile genetica7,8,9 e modelli di nota espressione di neurale complessi10,11,12 per consentire la caratterizzazione dei meccanismi di resistenza a livello del nervo, la modalità d'azione dei farmaci di nuova concezione e altri studi tossicologici.
Moscerino della frutta, d. melanogaster, è un organismo modello comune per la definizione di sistemi neurali insetti o insetticida meccanismo d'azione ed è stato stabilito come organismo modello particolarmente adatto per lo studio di tossicologici13, farmacologici14 ,15, neurofisiologici16e patofisiologici17,18,19,20 processi di vertebrati. Melanogaster è un insetto olometaboli che esegue la metamorfosi completa, tra cui una fase larvale e pupal prima di raggiungere la fase adulta riproduttiva. Durante tutto il processo di sviluppo, il sistema nervoso subisce rimodellamento significativo alle diverse fasi della vita, ma il CNS larvale sarà al centro di questa metodologia. Lo SNC larvale pienamente sviluppato è anatomicamente semplice con segmenti toracici ed addominali che si fondono e formano il ganglio ventrale, che rappresenta una matrice di neuromeric ripetute e quasi identica unità21,22. Decrescente di nervi motori provengono dall'estremità caudale dei gangli subesophageal e scendere a innervare i muscoli della parete del corpo e degli organi viscerali delle larve. Figura 1 descrive l'anatomia lorda del larvale della drosofila CNS.
La Drosophila emato - encefalica (BBB) si sviluppa alla fine dell'embriogenesi ed è formata da subperineurial cellule gliali (SPG)21. Le cellule SPG formano numerosi processi di filopodi-come stendere per stabilire un foglio contiguo, molto piatto, endoteliale-like che copre l'intero Drosophila CNS23. La Drosophila BBB ha somiglianze con i vertebrati BBB, che comprende preservare l'omeostasi del microambiente neurale controllando l'entrata di sostanze nutritive e xenobiotici nel CNS21. Questo è un prerequisito per affidabile trasmissione neurale e la funzione, ma la protezione del SNC di BBB limita la permeazione di droghe sintetiche, maggior parte dei peptidi e altri xenobiotici24,25, che introduce il potenziale problemi che caratterizzano le potenze di modulatori della piccolo-molecola. Il metodo utilizza un transection semplice per interrompere questa barriera e fornire accesso pronto farmacologico per la sinapsi centrali. La forza più grande della metodologia descritta è la semplicità, riproducibilità e relativamente alto-rendimento capacità inerente a questo sistema. Il protocollo è relativamente facile da padroneggiare, il programma di installazione richiede poco spazio, e solo un input finanziario iniziale è necessario che si riduce a reagenti e materiali di consumo. Inoltre, il metodo descritto è completamente modificabile per registrare l'attività di nervo centrale discendente della mosca domestica, Musca domestica26.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster (strain OR)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Kinetic Systems</td>
			<td>9200 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday Cage</td>
			<td>Kinetic Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope on a Boom</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800N</td>
			<td>Multiple scopes can be used; boom stand is critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/DC differential amplifier</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>AM3000H</td>
			<td>The model 1700 can be used instead of the model 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>audio monitor</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>AM3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hum Bug Noise Eliminator</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>726300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition System (PowerLab)</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>PL3504</td>
			<td>Multiple PowerLab models can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Chart Pro Software</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>N/A - Online Download</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Lights</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>89-740</td>
			<td>Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holder</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH715</td>
			<td>Different models are acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC cables</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>multiple based on size</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PG52151-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Also can use Narashige PC-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Wax</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>974228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-coated insect pins, size #2</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1208S2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fince Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recording of the central nervous system activity of third-instar drosophila melanogaster

La maggior parte degli insetticidi attualmente disponibili di destinazione il sistema nervoso e mutazioni genetiche delle proteine neurali invertebrati marini producono spesso conseguenze deleterie, eppure gli attuali metodi per la registrazione delle attività del sistema nervoso di un individuo animale è costoso e laborioso. Questa aspirazione elettrodo preparazione del terza-instar larvale sistema nervoso centrale di Drosophila melanogaster, è un sistema trattabile per testare gli effetti fisiologici di agenti neuroattivi, determinazione del ruolo fisiologico di vari neurale percorsi di attività del SNC, come pure l'influenza delle mutazioni genetiche alla funzione neurale. Questa preparazione ex vivo richiede solo moderato abilità e competenza elettrofisiologico di dissezione generare riproducibile registrazioni dell'attività neuronale degli insetti. Un'ampia varietà di modulatori chimici, compresi peptidi, quindi può essere applicata direttamente al sistema nervoso in soluzione con la soluzione fisiologica per misurare l'influenza sull'attività CNS. Tecnologie più ulteriormente, genetiche, come il sistema GAL4/UAS, possono essere applicati in modo indipendente o in tandem con gli agenti farmacologici per determinare il ruolo dei canali ionici specifici, trasportatori o recettori alla funzione CNS dell'artropodo. In questo contesto, i saggi descritti nel presente documento sono di notevole interesse per tossicologi di insetticida, insetto fisiologi e biologi inerente allo sviluppo, per cui d. melanogaster è un organismo modello stabilito. L'obiettivo del presente protocollo è di descrivere un metodo elettrofisiologico per consentire la misurazione della electrogenesis del sistema nervoso centrale nell'insetto modello, Drosophila melanogaster, che è utile per testare una diversità di scientifico ipotesi.

Attività spontanea dei nervi periferici discendenti derivanti dal sistema nervoso centrale Drosophila possono essere registrate utilizzando elettrodi aspirazione extracellulari con riproducibilità coerente. Attività spontanea di asportata e transected Drosophila CNS produce un modello ciclico di scoppio con s 1-2 di infornamento con circa 1 s di vicino attività quiescente. Per esempio, il CNS è vicino quiescente (1-2 Hz) per 0,5-1 s, seguita da una raffica (100-400 ...

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Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

Questo protocollo descrive un metodo per registrare l'attività elettrica discendente del sistema nervoso centrale Drosophila melanogaster per abilitare il costo-efficiente e conveniente test degli agenti farmacologici, mutazioni genetiche delle proteine neuronali, e/o il ruolo di inesplorate vie fisiologiche.

Registrazione elettrofisiologica dell'attività del sistema nervoso centrale di terza-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della tossicologia degli insetti e della fisiologia degli insetti misurando l'elettrogenesi del sistema nervoso centrale Drosophila melanogaster. Ciò consente di testare una vasta gamma di ipotesi scientifiche e aiutare nella scoperta di nuove modalità d'azione insetticide. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un sistema semplice, riproducibile e relativamente ad alta produttività con un input finanziario minimo per studiare il sistema nervoso della Drosophila.Per iniziare, aprire il software di acquisizione/analisi. Fare clic su Imposta sulla barra degli strumenti principale e selezionare Impostazioni canale, che aprirà una finestra di dialogo. Ridurre il numero di canali totali a tre.Il canale uno registrerà il segnale grezzo dall'amplificatore con un intervallo di 100 millivolt. Il canale due verrà utilizzato per contare il numero di eventi dal canale uno che sono al di sopra di una determinata soglia. A tale proposito, fare clic sulla scheda Calcolo per aprire un menu a discesa per il canale due.Selezionate Misure cicliche (Cyclic Measurements), che aprirà una seconda finestra di dialogo. Selezionare il canale uno come origine. Quindi, nella misurazione del menu a discesa, selezionare Unit Spike at Events.Infine, nell'area delle impostazioni di rilevamento, scegliere Soglia semplice dal menu a discesa. Il livello di soglia viene immesso nella finestra di regolazione del rilevamento da impostare sopra il rumore di fondo. Per convertire l'attività elettrica in un plottaggio di velocità espresso in hertz, selezionate Aritmetica (Arithmetic) sul terzo canale.Nella nuova finestra, input 1000 volte smoothsec, parentesi canale due virgola due. Quindi, selezionare nel menu a discesa delle unità l'unità di frequenza hertz. Chiudere le finestre di dialogo per tornare alla schermata principale.L'asse y del canale tre dovrebbe essere espresso in hertz e l'asse x nel tempo. Sezionare il SNC larvale Drosophila identificando ed estraendo prima una Drosophila melanogaster vagante della terza instar dalla fiala di coltura e collocandolo in 200 microlitri di soluzione salina. Quindi, afferrare i ganci della bocca con un paio di forcep fini e afferrare l'addome del verme con un secondo paio di forcep, con pressione leggera, per evitare di strappare il sottile strato cuticolare.Tirare delicatamente i ganci della bocca e l'addome in diverse direzioni per separare l'estremità caudale del verme dalla regione della testa ed esporre i visceri del verme. Il SNC si intreccierà con la trachea e il tratto digestivo. Prendere in giro il SNC dal tratto digestivo e dalla trachea con le forcep.La dissezione del sistema nervoso centrale Drosophila dal verme è un passo fondamentale per il successo. I gangli sezionati devono essere intatti, senza danni significativi ai nervi motori discendenti. Un maggior numero di nervi motori attaccati ai gangli aumenterà le frequenze di fuoco di base.Se necessario, interrompere la barriera eto-encefalica trasmetta manualmente il SNC posteriore ai lobi cerebrali con le forbici a molla Vannas. La trasezione deve essere effettuata in base alle proprietà fisiochimiche della sostanza chimica utilizzata. La linea rossa è il punto di trasezione suggerito e il SNC trasetto con tronchi nervosi periferici discendenti intatti mostrati qui.Per iniziare, prima tirare l'elettrodo di pipetta di vetro dai capillari di vetro borosilicato a una resistenza da cinque a 15 megaohms. Inserire il SNC trasetto in una camera di cera contenente 200 microlitri di soluzione salina. Bloccare un perno insetto non rivestito con una clip di alligatore saldata al filo di terra e inserire il perno nella salina per completare il circuito.Utilizzando i micromanipolatori, orientare l'elettrodo verso l'estremità caudale del SNC trasetto. Eliminare il rumore di fondo regolando il livello di soglia nel software di acquisizione/analisi prima di collegare i tronchi nervosi periferici. Applicare una leggera pressione negativa sulla siringa per attirare i nervi periferici nell'elettrodo di aspirazione.Avviare la registrazione sul software di acquisizione dati e il tasso di attivazione di base per equilibrare per cinque minuti prima di raccogliere i dati del tasso di attivazione di base. Dopo cinque minuti, aggiungere 200 microlitri di soluzione salina e veicolo per portare il volume totale della camera a 400 microlitri per iniziare a registrare i tassi di cottura di controllo. Scartare la preparazione e la registrazione se il modello di cottura del trattamento di controllo non è simile all'esempio mostrato qui.Quando il basale è stato stabilito dopo tre o cinque minuti di registrazione, prelevare 200 microlitri di salina e aggiungere 200 microlitri dell'agente sperimentale solubilizzato in salina. Etichettare questo punto di tempo di applicazione del farmaco nel software di acquisizione / analisi includendo un commento che include il farmaco e la concentrazione finale. Qui è mostrata una traccia rappresentativa della scarica nervosa prima e dopo l'esposizione al DMSO.La freccia indica l'ora di applicazione. Si vede una risposta limitata al DMSO. L'aumento delle dosi di propoxur ha amplificato la frequenza di scarica del picco del SNC Drosophila trasetto in modo dipendente dalla concentrazione, mentre il GABA neurodepressivo ha ridotto la frequenza di scarica del picco in modo dipendente dalla concentrazione.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che si tratta di un esperimento ex vivo, e quindi le condizioni della soluzione salina, come pH e temperatura, sono fondamentali per l'attività prolungata della preparazione del sistema nervoso centrale. Allo stesso modo, la mancanza di attività elettrica estranea, un'efficace gabbia di Faraday e una riduzione del rumore di 60 hertz sono fondamentali per il successo di questo saggio. I dati raccolti attraverso questo saggio possono aiutare a identificare la modalità specifica di azione degli insetticidi.È possibile eseguire la successiva convalida di questi dati attraverso altri metodi come l'elettrofisiologia tensione-morsetto, le analisi biochimiche e ulteriori test farmacologici.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualizzazione del sistema nervoso embrionale in Whole-mount Drosophila Embrioni

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Ricerca

Neuroscienze

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During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Produzione di vettori lentivirali per Celle di trasduzione del Sistema Nervoso Centrale

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Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

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An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

Un paradigma Infortunio per Indagare riparazione del sistema nervoso centrale in<em&gt; Drosophila</em

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