Nos gustaría agradecer a la Sra. Rui Chen por la disección y las imágenes de la Drosophila del CNS se muestra en las figuras.

1. equipos y materiales
<ol><li>Preparar los componentes necesarios (listados en la Tabla de materiales) de la plataforma de electrofisiología para realizar grabaciones de electrodo de succión de la Drosophila del CNS. Nota: Antes de la experimentación, es necesario construir cámaras para la disección de la Drosophila CNS y ser utilizado para bañarse los ganglios en solución salina durante las grabaciones. Un esquema paso a paso de construcción de la cámara se proporciona ...

<ol>
	<li>Sparks, T. C., Nauen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRAC:+Mode+of+action+classification+and+insecticide+resistance+management.">IRAC: Mode of action classification and insecticide resistance management.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 121, 122-128 (2015).</li><li>Swale, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insecticide+resistance-breaking+mosquitocide+targeting+inward+rectifier+potassium+channels+in+vectors+of+Zika+virus+and+malaria.">An insecticide resistance-breaking mosquitocide targeting inward rectifier potassium channels in vectors of Zika virus and malaria.</a> Scientific Reports. 6, 36954 (2016).</li><li>Troczka, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+expression+and+functional+characterisation+of+the+diamondback+moth+ryanodine+receptor+G4946E+variant+conferring+resistance+to+diamide+insecticides.">Stable expression and functional characterisation of the diamondback moth ryanodine receptor G4946E variant conferring resistance to diamide insecticides.</a> Scientific Reports. 5, 14680 (2015).</li><li>Bloomquist, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+potassium+KV2+channels+as+new+targets+for+insecticides.">Voltage-sensitive potassium KV2 channels as new targets for insecticides.</a> Biopesticides: State of the Art and Future Opportunities. 1172, 71-81 (2014).</li><li>Jenson, L. J., Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+serum+and+ion+channel+block+on+growth+and+hormonally-induced+differentiation+of+Spodoptera+frugiperda+(Sf21)+insect+cells.">Role of serum and ion channel block on growth and hormonally-induced differentiation of Spodoptera frugiperda (Sf21) insect cells.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 90 (3), 131-139 (2015).</li><li>Jenson, L. J., Sun, B., Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+potassium+channels+expressed+after+20-Hydroxyecdysone+treatment+of+a+mosquito+cell+line.">Voltage-sensitive potassium channels expressed after 20-Hydroxyecdysone treatment of a mosquito cell line.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biolology. 87, 75-80 (2017).</li><li>Chintapalli, V. R., Wang, J., Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+FlyAtlas+to+identify+better+Drosophila+melanogaster+models+of+human+disease.">Using FlyAtlas to identify better Drosophila melanogaster models of human disease.</a> Nature Genetics. 39 (6), 715-720 (2007).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li><li>St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+Drosophila+melanogaster.">The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).</li><li>Luan, Z., Li, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+channels+in+Drosophila.">Inwardly rectifying potassium channels in Drosophila.</a> Sheng Li Xue Bao. 64 (5), 515-519 (2012).</li><li>Muenzing, S. E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larvalign:+Aligning+gene+expression+patterns+from+the+larval+brain+of+Drosophila+melanogaster.">Larvalign: Aligning gene expression patterns from the larval brain of Drosophila melanogaster.</a> Neuroinformatics. 16 (1), 65-80 (2017).</li><li>Sprecher, S. G., Reichert, H., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+patterns+in+primary+neuronal+clusters+of+the+Drosophila+embryonic+brain.">Gene expression patterns in primary neuronal clusters of the Drosophila embryonic brain.</a> Gene Expression Patterns. 7 (5), 584-595 (2007).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+for+toxicogenomics:+Genetic+variation+in+susceptibility+to+heavy+metal+exposure.">A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure.</a> PLoS Genetics. 13 (7), e1006907 (2017).</li><li>Manev, H., Dimitrijevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+model+for+in+vivo+pharmacological+analgesia+research.">Drosophila model for in vivo pharmacological analgesia research.</a> European Journal of Pharmacology. 491 (2-3), 207-208 (2004).</li><li>Pandey, U. B., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+disease+models+in+Drosophila+melanogaster+and+the+role+of+the+fly+in+therapeutic+drug+discovery.">Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery.</a> Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).</li><li>Hekmat-Scafe, D. S., Lundy, M. Y., Ranga, R., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+K+/Cl-+cotransporter+gene+kazachoc+(kcc)+increase+seizure+susceptibility+in+Drosophila.">Mutations in the K+/Cl- cotransporter gene kazachoc (kcc) increase seizure susceptibility in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 26 (35), 8943-8954 (2006).</li><li>Whitworth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutathione+S-transferase+activity+rescues+dopaminergic+neuron+loss+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (22), 8024-8029 (2005).</li><li>Watson, M. R., Lagow, R. D., Xu, K., Zhang, B., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+for+amyotrophic+lateral+sclerosis+reveals+motor+neuron+damage+by+human+SOD1.">A Drosophila model for amyotrophic lateral sclerosis reveals motor neuron damage by human SOD1.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24972-24981 (2008).</li><li>Rajendra, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+melanogaster+model+of+spinal+muscular+atrophy+reveals+a+function+for+SMN+in+striated+muscle.">A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle.</a> Journal of Cell Biology. 176 (6), 831-841 (2007).</li><li>Chan, H. Y., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+of+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila models of human neurodegenerative disease.</a> Cell Death and Differentiation. 7 (11), 1075-1080 (2000).</li><li>Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+blood-brain+barrier:+development+and+function+of+a+glial+endothelium.">The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+characterization+of+the+entire+interneuron+population+reveals+principles+of+neuromere+organization+in+the+ventral+nerve+cord+of+Drosophila.">Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 31 (44), 15870-15883 (2011).</li><li>Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+the+mesenchymal-epithelial+transition+of+blood-brain+barrier+forming+glia+in+Drosophila.">Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila.</a> Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li><li>Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+to+predict+drug+permeation+across+the+blood-brain+barrier,+and+distribution+to+brain.">Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain.</a> Current Drug Metabolism. 9 (9), 901-910 (2008).</li><li>Swale, D. R., Sun, B., Tong, F., Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxicity+and+mode+of+action+of+N,+N-diethyl-meta-toluamide+(DEET).">Neurotoxicity and mode of action of N, N-diethyl-meta-toluamide (DEET).</a> PLoS One. 9 (8), e103713 (2014).</li><li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+larval+CNS+in+Drosophila+melanogaster.">Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (1), 85 (2006).</li><li>Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+of+atracotoxin+at+central+and+peripheral+synapses+of+insects.">Mode of action of atracotoxin at central and peripheral synapses of insects.</a> Invertebrate Neuroscience. 5 (1), 45-50 (2003).</li><li>Bloomquist, J. R., Roush, R. T., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+neuronal+sensitivity+to+dieldrin+and+picrotoxinin+in+a+cyclodiene-resistant+strain+of+Drosophila+melanogaster+(Meigen).">Reduced neuronal sensitivity to dieldrin and picrotoxinin in a cyclodiene-resistant strain of Drosophila melanogaster (Meigen).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 19 (1), 17-25 (1992).</li><li>Mutunga, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxicology+of+bis(n)-tacrines+on+Blattella+germanica+and+Drosophila+melanogaster+acetylcholinesterase.">Neurotoxicology of bis(n)-tacrines on Blattella germanica and Drosophila melanogaster acetylcholinesterase.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 83 (4), 180-194 (2013).</li><li>Chen, R., Swale, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+(Kir)+channels+represent+a+critical+ion+conductance+pathway+in+the+nervous+systems+of+insects.">Inwardly rectifying potassium (Kir) channels represent a critical ion conductance pathway in the nervous systems of insects.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1617 (2018).</li><li>Francis, S. A., Taylor-Wells, J., Gross, A. D., Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+and+physiological+actions+of+carbonic+anhydrase+inhibitors+to+Aedes+aegypti+and+Drosophila+melanogaster.">Toxicity and physiological actions of carbonic anhydrase inhibitors to Aedes aegypti and Drosophila melanogaster.</a> Insects. 8 (1), 2 (2016).</li><li>Swale, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitor+profile+of+bis(n)-tacrines+and+N-methylcarbamates+on+acetylcholinesterase+from+Rhipicephalus+(Boophilus)+microplus+and+Phlebotomus+papatasi.">Inhibitor profile of bis(n)-tacrines and N-methylcarbamates on acetylcholinesterase from Rhipicephalus (Boophilus) microplus and Phlebotomus papatasi.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 85-92 (2013).</li><li>Corbel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+inhibition+of+cholinesterases+in+insect+and+mammalian+nervous+systems+by+the+insect+repellent+deet.">Evidence for inhibition of cholinesterases in insect and mammalian nervous systems by the insect repellent deet.</a> BMC Biology. 7, 47 (2009).</li></ol>

Los datos facilitados en el vídeo asociado y texto han dado pasos para registrar la actividad y la espiga alta frecuencia de Drosophila CNS ex vivo. La eficacia de la disección es el aspecto más crítico del método ya corto o pocas neuronas descendentes reducirá la base disparando ritmo que dan lugar a grandes variaciones entre repeticiones. Sin embargo, una vez que domina la técnica de disección, los datos recogidos con este ensayo son altamente reproducibles y modificable para una amplia varied...

El objetivo general de este enfoque es ayudar a los investigadores a medir rápidamente la electrogenesis del sistema nervioso central (SNC) en el insecto modelo, Drosophila melanogaster. Este método es confiable, rápida y costo-eficiente para llevar a cabo la experimentación fisiológica y toxicológica. El SNC es esencial para la vida y por lo tanto, los caminos fisiológicos críticos para funcionamiento neuronal han sido exploradas extensivamente en un esfuerzo por comprender o modificar la función neural. Caracterización de las vías de señalización dentro del CNS artrópodo ha permitido el descubrimiento de varias clases químicas de insecticidas que interrumpen la función neural invertebrada para inducir mortalidad limitando las consecuencias fuera del objetivo. Así, la capacidad de medir la actividad neuronal de los insectos es de gran interés para el campo de la fisiología y toxicología de insectos ya que el sistema nervioso es el tejido diana de la mayoría de insecticidas desplegados1. Sin embargo, continuó el crecimiento del conocimiento fundamental y aplicado sobre el sistema nervioso del insecto requiere técnicas neurofisiológicas avanzadas que están limitadas en su viabilidad, puesto que las técnicas actuales de mano de obra y requieren un gasto alto, insecto líneas celulares neuronales son limitadas, y hay acceso limitado a la sinapsis central de mayoría artrópodos. Caracterización de la mayoría de las proteínas neuronal insectos requiere actualmente, el objetivo de ser clonado y expresado heterologously para fármacos posteriores y las grabaciones electrofisiológicas, como fue descrito por canales de potasio rectificador hacia adentro insectos2 , receptor de rianodina insectos3, mosquito sensible a voltaje K+ canales4y otros. Para mitigar la necesidad de expresión heteróloga y el potencial de expresión funcional baja, Bloomquist y colegas para inducir un fenotipo neuronal en cultivan células de Spodoptera frugiperda (Sf21) como un método novedoso para insecticida descubrimiento5,6. Estos métodos proporcionan un enfoque válido para el desarrollo de la nueva química, sin embargo, a menudo crean un cuello de botella insalvable para la caracterización de los agentes farmacológicos, identificar mecanismos de resistencia a los insecticidas y caracterización de los principios fisiológicos fundamentales. Aquí, describimos un método ex vivo que permite la grabación de la actividad eléctrica de un insecto de modelo que tiene genética maleable7,8,9 y los patrones de la conocida expresión de nervios complejos10,11,12 para permitir la caracterización de mecanismos de resistencia a nivel del nervio, el modo de acción de fármacos recientemente desarrollados y otros estudios toxicológicos.
La mosca de la fruta D. melanogaster es un organismo modelo común para la definición de insecto sistemas neuronales o mecanismo insecticida de acción y se ha establecido como un organismo modelo muy adecuado para el estudio de la toxicología13, farmacológicas14 ,15, neurofisiológicos16y patofisiológicos17,18,19,20 procesos de vertebrados. D.melanogaster es un insectos holometábolos que realiza metamorfosis completa, incluyendo una etapa larvaria y de pupa antes de llegar a la etapa adulta reproductiva. Durante el proceso de desarrollo, el sistema nervioso sufre importantes remodelaciones en diferentes estadios, pero el larvas SNC será el tema central de esta metodología. El CNS larvas completamente desarrollado es anatómico simple con segmentos torácicos y abdominales que se fusionan y forman el ganglio ventral, que representa una matriz de neuromeric repetida y casi idénticas unidades21,22. Nervios motores descendentes se originan desde el extremo caudal de los ganglios subesophageal y descienden para inervar los músculos de la pared del cuerpo y órganos viscerales de la larva. La figura 1 describe la anatomía macroscópica de la larvas Drosophila CNS.
La barrera Drosophila blood - brain (BBB) se convierte en el final de la embriogénesis y está formada por células gliales (SPG) de subperineurial21. Las células SPG forman numerosos procesos como filopodios que extensión para establecer una hoja contigua, muy plana, como endoteliales que cubre el entero Drosophila CNS23. La Drosophila BBB tiene similitudes con el BBB vertebrado, que incluye preservar la homeostasis del microambiente neuronal controlando la entrada de nutrientes y xenobióticos en la CNS21. Esto es un prerrequisito para confiable transmisión neural y la función, sin embargo, la protección del SNC por el BBB restringe la penetración de drogas sintéticas, la mayoría de péptidos y otros xenobióticos24,25, que presenta potencial problemas cuando caracterizan potencias de moduladores de moléculas pequeñas. El método utiliza un simple corte transversal para interrumpir esta barrera y proporcionar acceso farmacológica a la sinapsis central. La mayor fortaleza de la metodología descrita es la simplicidad, la reproducibilidad y la relativamente alta-capacidad inherente a este sistema. El protocolo es relativamente fácil de dominar, el programa de instalación requiere poco espacio, y sólo una entrada financiera inicial es necesario que se reduce a reactivos y consumibles. Además, el método descrito es completamente modificable para registrar la actividad nerviosa descendente central de la mosca doméstica, Musca domestica26.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster (strain OR)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Kinetic Systems</td>
			<td>9200 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday Cage</td>
			<td>Kinetic Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope on a Boom</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800N</td>
			<td>Multiple scopes can be used; boom stand is critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/DC differential amplifier</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>AM3000H</td>
			<td>The model 1700 can be used instead of the model 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>audio monitor</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>AM3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hum Bug Noise Eliminator</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>726300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition System (PowerLab)</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>PL3504</td>
			<td>Multiple PowerLab models can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Chart Pro Software</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>N/A - Online Download</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Lights</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>89-740</td>
			<td>Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holder</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH715</td>
			<td>Different models are acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC cables</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>multiple based on size</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PG52151-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Also can use Narashige PC-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Wax</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>974228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-coated insect pins, size #2</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1208S2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fince Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recording of the central nervous system activity of third-instar drosophila melanogaster

La mayoría de los insecticidas disponibles actualmente atacar el sistema nervioso y mutaciones genéticas de las proteínas neuronales invertebradas a menudo producen consecuencias perjudiciales, sin embargo, los métodos actuales para el registro de actividad del sistema nervioso de un individuo animal es costoso y laborioso. Esta aspiración preparación del electrodo del sistema nervioso central de larvas tercer estadio de Drosophila melanogaster, es un sistema manejable para las pruebas de los efectos fisiológicos de los agentes neuroactivos, determinar el papel fisiológico de varios nervios caminos hacia la actividad del CNS, así como la influencia de las mutaciones genéticas a la función neuronal. Esta preparación ex vivo requiere sólo moderada disección electrofisiológico experiencia y habilidad generar grabaciones reproducibles de insecto actividad neuronal. Una amplia variedad de moduladores químicos, incluyendo péptidos, entonces puede aplicarse directamente al sistema nervioso en la solución con la solución fisiológica salina para medir la influencia en la actividad del CNS. Genéticas, otras tecnologías, como el sistema de GAL4/UAS, pueden aplicarse independientemente o conjuntamente con los agentes farmacológicos para determinar la función de canales iónicos específicos, transportadores o receptores a artrópodos función del CNS. En este contexto, los ensayos aquí descritos son de gran interés para toxicólogos insecticida insectos fisiólogos y biólogos del desarrollo para que D. melanogaster es un organismo modelo establecido. El objetivo de este protocolo es describir un método electrofisiológico para permitir la medición de la electrogenesis del sistema nervioso central en el insecto modelo, Drosophila melanogaster, que es útil para probar una diversidad de científicos hipótesis.

La actividad espontánea de los nervios periféricos descendentes del Drosophila del sistema nervioso central puede grabarse utilizando electrodos de succión extracelulares con reproducibilidad consistente. La actividad espontánea de la suprimida y seccionado Drosophila CNS produce un patrón cíclico de explosión con 1-2 s de disparo con aproximadamente 1 s de cerca la actividad de reposo. Por ejemplo, el SNC está quieto (1-2 Hz) de 0.5-1 s, seguido de una explosió...

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Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

Este protocolo describe un método para registrar la actividad eléctrica descendente de la sistema de nervioso central de Drosophila melanogaster para permitir pruebas de agentes farmacológicos, mutaciones genéticas de las proteínas neuronales, conveniente y rentable o el papel de los caminos fisiológicos inexplorados.

Registro electrofisiológico de la actividad del sistema nervioso Central de tercer estadio de Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la toxicología de insectos y la fisiología de insectos midiendo la electrogénesis del sistema nervioso central Drosophila melanogaster. Esto permite probar una amplia gama de hipótesis científicas y ayudar en el descubrimiento de nuevos modos de acción insecticida. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un sistema simple, reproducible y relativamente alto rendimiento con un mínimo de insumo financiero para estudiar el sistema nervioso de Drosophila.Para empezar, abra el software de adquisición/análisis. Haga clic en Configurar en la barra de herramientas principal y seleccione Configuración de canal, que abrirá un cuadro de diálogo. Reduzca el número de canales totales a tres.El canal uno grabará la señal cruda del amplificador con un rango de 100 milivoltios. El canal dos se utilizará para contar el número de eventos del canal uno que están por encima de un umbral determinado. Para ello, haga clic en la pestaña Cálculo para abrir un menú desplegable para el canal dos.Seleccione Mediciones cíclicas, que abrirá un segundo cuadro de diálogo. Seleccione el canal uno como origen. A continuación, en la medida del menú desplegable, seleccione Pico de unidad en eventos.Por último, en el área de configuración de detección, en el menú desplegable, seleccione Umbral simple. El nivel de umbral se introduce en la ventana de ajuste de detección que se establecerá por encima del ruido de fondo. Para convertir la actividad eléctrica en una gráfica de velocidad expresada en hercios, seleccione Aritmética en el tercer canal.En la nueva ventana, introduzca 1000 veces smoothsec, paréntesis canal dos comas dos. A continuación, seleccione en el menú desplegable de unidades los hercios de la unidad de frecuencia. Cierre los cuadros de diálogo para volver a la pantalla principal.El eje Y del canal tres debe expresarse en hercios y en el eje X en el tiempo. Diseccionar la larva Drosophila CNS identificando y extrayendo primero un Drosophila melanogaster errante de tercera estrella del vial de cultivo y colocándolo en 200 microlitros de solución salina. Luego, agarra los ganchos de la boca con un par de fórceps finos, y agarra el abdomen del gusano con un segundo par de fórceps, con ligera presión, para evitar romper la fina capa cuticular.Tire suavemente de los ganchos de la boca y el abdomen en diferentes direcciones para separar el extremo caudal del gusano de la región de la cabeza y exponer las vísceras del gusano. El SNC se entrelazará con la tráquea y el tracto digestivo. Saca el SNC fuera del tracto digestivo y la tráquea con fórceps.La disección del sistema nervioso central De Drosophila del gusano es un paso crítico para el éxito. Los ganglios diseccionados deben estar intactos, sin ningún daño significativo a los nervios motores descendentes. Un mayor número de nervios motores unidos a los ganglios aumentará las frecuencias de disparo basales.Si es necesario, interrumpa la barrera hematoencefálica transectando manualmente el SNC posterior a los lóbulos cerebrales con tijeras de resorte Vannas. La transección debe realizarse sobre la base de las propiedades fisioquímicas del producto químico utilizado. La línea roja es el punto de transección sugerido y el SNC transectado con troncos nerviosos periféricos descendentes intactos que se muestran aquí.Para empezar, primero tire del electrodo de pipeta de vidrio de los capilares de vidrio borosilicato a una resistencia de cinco a 15 megamios. Inserte el SNC transectado en una cámara de cera que contenga 200 microlitros de solución salina. Sujete un pasador de insecto sin recubrimiento con un clip de cocodrilo soldado al cable de tierra e inserte el pasador en la solución salina para completar el circuito.Usando los micromanipuladores, oriente el electrodo hacia el extremo caudal del SNC transectado. Elimine el ruido de fondo ajustando el nivel de umbral en el software de adquisición/análisis antes de conectar los troncos nerviosos periféricos. Aplique una ligera presión negativa sobre la jeringa para atraer los nervios periféricos al electrodo de aspiración.Inicie la grabación en el software de adquisición de datos y la velocidad de disparo de línea base se equilibre durante cinco minutos antes de recopilar los datos de la velocidad de disparo de línea de base. Después de cinco minutos, agregue 200 microlitros de solución salina y vehículo para llevar el volumen total de la cámara a 400 microlitros para comenzar a registrar las tasas de disparo de control. Deseche la preparación y el registro si el patrón de disparo del tratamiento de control no es similar al ejemplo que se muestra aquí.Cuando se haya establecido la línea de base después de tres a cinco minutos de registro, retire 200 microlitros de solución salina y añada 200 microlitros del agente experimental solubilizados en solución salina. Etiquetar este punto de tiempo de aplicación de drogas en el software de adquisición / análisis mediante la inclusión de un comentario que incluye el medicamento y la concentración final. Aquí se muestra un rastro representativo de secreción nerviosa antes y después de la exposición a DMSO.La flecha indica la hora de aplicación. Se observa una respuesta limitada a DMSO. El aumento de las dosis de propoxur amplificó la frecuencia de descarga de picos del SNC Drosophila transectado de una manera dependiente de la concentración, mientras que el GABA neurodepresor redujo la frecuencia de descarga de picos de una manera dependiente de la concentración.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que es un experimento ex vivo, y por lo tanto las condiciones de la solución salina, como el pH y la temperatura, es fundamental para la actividad prolongada de la preparación del sistema nervioso central. Del mismo modo, la falta de actividad eléctrica acarneada, una jaula faraday eficaz y una reducción del ruido de 60 hercios son fundamentales para el éxito de este ensayo. Los datos recopilados a través de este ensayo pueden ayudar a identificar el modo específico de acción de los insecticidas.Se puede realizar la validación posterior de estos datos a través de otros métodos, como la electrofisiología de la abrazadera de voltaje, los análisis bioquímicos y los ensayos farmacológicos adicionales.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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