Vi vill tacka Ms. Rui Chen för dissektion och bilder av den Drosophila CNS visas i figurer.

1. utrustning och material
<ol><li>Förbereda de nödvändiga komponenterna (anges i Tabell för material) av elektrofysiologi riggen att utföra sug elektrod inspelningar av den Drosophila CNS. Obs: Innan experiment är det nödvändigt att konstruera kammare för dissekering av den Drosophila CNS och ska användas för badning ganglier i saltlösning under inspelningar. Nedan följer en stegvis beskrivning av kammare konstruktion.</li>
	<li>Förbereda larval kammaren.<ol>
<li>Sm?...

<ol>
	<li>Sparks, T. C., Nauen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRAC:+Mode+of+action+classification+and+insecticide+resistance+management.">IRAC: Mode of action classification and insecticide resistance management.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 121, 122-128 (2015).</li><li>Swale, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insecticide+resistance-breaking+mosquitocide+targeting+inward+rectifier+potassium+channels+in+vectors+of+Zika+virus+and+malaria.">An insecticide resistance-breaking mosquitocide targeting inward rectifier potassium channels in vectors of Zika virus and malaria.</a> Scientific Reports. 6, 36954 (2016).</li><li>Troczka, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+expression+and+functional+characterisation+of+the+diamondback+moth+ryanodine+receptor+G4946E+variant+conferring+resistance+to+diamide+insecticides.">Stable expression and functional characterisation of the diamondback moth ryanodine receptor G4946E variant conferring resistance to diamide insecticides.</a> Scientific Reports. 5, 14680 (2015).</li><li>Bloomquist, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+potassium+KV2+channels+as+new+targets+for+insecticides.">Voltage-sensitive potassium KV2 channels as new targets for insecticides.</a> Biopesticides: State of the Art and Future Opportunities. 1172, 71-81 (2014).</li><li>Jenson, L. J., Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+serum+and+ion+channel+block+on+growth+and+hormonally-induced+differentiation+of+Spodoptera+frugiperda+(Sf21)+insect+cells.">Role of serum and ion channel block on growth and hormonally-induced differentiation of Spodoptera frugiperda (Sf21) insect cells.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 90 (3), 131-139 (2015).</li><li>Jenson, L. J., Sun, B., Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+potassium+channels+expressed+after+20-Hydroxyecdysone+treatment+of+a+mosquito+cell+line.">Voltage-sensitive potassium channels expressed after 20-Hydroxyecdysone treatment of a mosquito cell line.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biolology. 87, 75-80 (2017).</li><li>Chintapalli, V. R., Wang, J., Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+FlyAtlas+to+identify+better+Drosophila+melanogaster+models+of+human+disease.">Using FlyAtlas to identify better Drosophila melanogaster models of human disease.</a> Nature Genetics. 39 (6), 715-720 (2007).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li><li>St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+Drosophila+melanogaster.">The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).</li><li>Luan, Z., Li, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+channels+in+Drosophila.">Inwardly rectifying potassium channels in Drosophila.</a> Sheng Li Xue Bao. 64 (5), 515-519 (2012).</li><li>Muenzing, S. E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larvalign:+Aligning+gene+expression+patterns+from+the+larval+brain+of+Drosophila+melanogaster.">Larvalign: Aligning gene expression patterns from the larval brain of Drosophila melanogaster.</a> Neuroinformatics. 16 (1), 65-80 (2017).</li><li>Sprecher, S. G., Reichert, H., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+patterns+in+primary+neuronal+clusters+of+the+Drosophila+embryonic+brain.">Gene expression patterns in primary neuronal clusters of the Drosophila embryonic brain.</a> Gene Expression Patterns. 7 (5), 584-595 (2007).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+for+toxicogenomics:+Genetic+variation+in+susceptibility+to+heavy+metal+exposure.">A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure.</a> PLoS Genetics. 13 (7), e1006907 (2017).</li><li>Manev, H., Dimitrijevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+model+for+in+vivo+pharmacological+analgesia+research.">Drosophila model for in vivo pharmacological analgesia research.</a> European Journal of Pharmacology. 491 (2-3), 207-208 (2004).</li><li>Pandey, U. B., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+disease+models+in+Drosophila+melanogaster+and+the+role+of+the+fly+in+therapeutic+drug+discovery.">Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery.</a> Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).</li><li>Hekmat-Scafe, D. S., Lundy, M. Y., Ranga, R., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+K+/Cl-+cotransporter+gene+kazachoc+(kcc)+increase+seizure+susceptibility+in+Drosophila.">Mutations in the K+/Cl- cotransporter gene kazachoc (kcc) increase seizure susceptibility in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 26 (35), 8943-8954 (2006).</li><li>Whitworth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutathione+S-transferase+activity+rescues+dopaminergic+neuron+loss+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (22), 8024-8029 (2005).</li><li>Watson, M. R., Lagow, R. D., Xu, K., Zhang, B., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+for+amyotrophic+lateral+sclerosis+reveals+motor+neuron+damage+by+human+SOD1.">A Drosophila model for amyotrophic lateral sclerosis reveals motor neuron damage by human SOD1.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24972-24981 (2008).</li><li>Rajendra, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+melanogaster+model+of+spinal+muscular+atrophy+reveals+a+function+for+SMN+in+striated+muscle.">A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle.</a> Journal of Cell Biology. 176 (6), 831-841 (2007).</li><li>Chan, H. Y., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+of+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila models of human neurodegenerative disease.</a> Cell Death and Differentiation. 7 (11), 1075-1080 (2000).</li><li>Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+blood-brain+barrier:+development+and+function+of+a+glial+endothelium.">The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+characterization+of+the+entire+interneuron+population+reveals+principles+of+neuromere+organization+in+the+ventral+nerve+cord+of+Drosophila.">Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 31 (44), 15870-15883 (2011).</li><li>Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+the+mesenchymal-epithelial+transition+of+blood-brain+barrier+forming+glia+in+Drosophila.">Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila.</a> Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li><li>Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+to+predict+drug+permeation+across+the+blood-brain+barrier,+and+distribution+to+brain.">Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain.</a> Current Drug Metabolism. 9 (9), 901-910 (2008).</li><li>Swale, D. R., Sun, B., Tong, F., Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxicity+and+mode+of+action+of+N,+N-diethyl-meta-toluamide+(DEET).">Neurotoxicity and mode of action of N, N-diethyl-meta-toluamide (DEET).</a> PLoS One. 9 (8), e103713 (2014).</li><li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+larval+CNS+in+Drosophila+melanogaster.">Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (1), 85 (2006).</li><li>Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+of+atracotoxin+at+central+and+peripheral+synapses+of+insects.">Mode of action of atracotoxin at central and peripheral synapses of insects.</a> Invertebrate Neuroscience. 5 (1), 45-50 (2003).</li><li>Bloomquist, J. R., Roush, R. T., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+neuronal+sensitivity+to+dieldrin+and+picrotoxinin+in+a+cyclodiene-resistant+strain+of+Drosophila+melanogaster+(Meigen).">Reduced neuronal sensitivity to dieldrin and picrotoxinin in a cyclodiene-resistant strain of Drosophila melanogaster (Meigen).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 19 (1), 17-25 (1992).</li><li>Mutunga, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxicology+of+bis(n)-tacrines+on+Blattella+germanica+and+Drosophila+melanogaster+acetylcholinesterase.">Neurotoxicology of bis(n)-tacrines on Blattella germanica and Drosophila melanogaster acetylcholinesterase.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 83 (4), 180-194 (2013).</li><li>Chen, R., Swale, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+(Kir)+channels+represent+a+critical+ion+conductance+pathway+in+the+nervous+systems+of+insects.">Inwardly rectifying potassium (Kir) channels represent a critical ion conductance pathway in the nervous systems of insects.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1617 (2018).</li><li>Francis, S. A., Taylor-Wells, J., Gross, A. D., Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+and+physiological+actions+of+carbonic+anhydrase+inhibitors+to+Aedes+aegypti+and+Drosophila+melanogaster.">Toxicity and physiological actions of carbonic anhydrase inhibitors to Aedes aegypti and Drosophila melanogaster.</a> Insects. 8 (1), 2 (2016).</li><li>Swale, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitor+profile+of+bis(n)-tacrines+and+N-methylcarbamates+on+acetylcholinesterase+from+Rhipicephalus+(Boophilus)+microplus+and+Phlebotomus+papatasi.">Inhibitor profile of bis(n)-tacrines and N-methylcarbamates on acetylcholinesterase from Rhipicephalus (Boophilus) microplus and Phlebotomus papatasi.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 85-92 (2013).</li><li>Corbel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+inhibition+of+cholinesterases+in+insect+and+mammalian+nervous+systems+by+the+insect+repellent+deet.">Evidence for inhibition of cholinesterases in insect and mammalian nervous systems by the insect repellent deet.</a> BMC Biology. 7, 47 (2009).</li></ol>

Detaljerna i den associera videon och text har gett viktiga steg för att registrera aktivitet och spike ansvarsfrihet frekvensen av den Drosophila CNS ex vivo. Dissektion effekten är den mest kritiska aspekten av metoden eftersom kort eller några fallande nervceller kommer att minska baslinjen bränning kurs som kommer att resultera i stora avvikelser mellan replikat. Men när dissektion tekniken har varit bemästrat, är data samlas in med denna analys mycket reproducerbara och Parkeringsleverantör...

Det övergripande målet för denna strategi är att ge forskarna möjlighet att snabbt mäta av electrogenesis av det centrala nervsystemet (CNS) i modell insekt, Drosophila melanogaster. Denna metod är tillförlitlig, snabb och kostnadseffektiv att utföra fysiologiska och toxikologiska experiment. CNS är avgörande för liv och därför de fysiologiska vägarna som är kritiska för korrekt neurala funktion har undersökts utförligt i ett försök att förstå eller ändra neurala funktion. Karakterisering av signalvägar inom leddjur CNS har aktiverat upptäckten av flera kemiska klasser av insekticider som stör ryggradslösa neurala funktion för att inducera dödlighet samtidigt begränsa ej åsyftade konsekvenser. Således, förmågan att mäta neural aktiviteten av insekter är av betydande intresse för området insekt toxikologi och fysiologi eftersom nervsystemet är målvävnaden majoriteten av distribuerade insekticider1. Ändå fortsatte tillväxten av grundforskning och tillämpad kunskap om insekt nervsystemet kräver avancerad neurofysiologisk tekniker som är begränsade i genomförbarhet, eftersom aktuella tekniker som är arbetsintensiva och kräver en hög kostnad, insekt neurala cellinjer begränsas, och/eller det finns begränsad tillgång till de centrala synapserna av de flesta leddjur. Karakterisering av de flesta insekt neurala proteiner kräver för närvarande, målet att vara klonade och heterologously uttryckt för efterföljande läkemedelsutveckling och elektrofysiologiska inspelningar, som beskrevs för insekt inåt likriktare kaliumkanaler2 , insekt ryanodine receptor3, mygga spänningskänsliga K+ kanaler4, m.fl. För att minska kravet på heterologa uttryck och potentialen för låga funktionella uttryck, Bloomquist och kollegor som syftar till att framkalla en neuronal fenotyp i odlade Spodoptera frugiperda (Sf21) celler som en ny metod för insektsmedel discovery5,6. Dessa metoder ger en giltig metod för utveckling av nya kemi, men de skapar ofta ett oöverstigligt flaskhals för karakterisering av farmakologiska agenter, att identifiera mekanismer av insektsmedel motstånd och karakterisering av grundläggande fysiologiska principer. Här beskriver vi ett ex vivo -metod som möjliggör inspelning av elektrisk aktivitet från en modell insekt som har aducerade genetik7,8,9 och kända uttrycksmönster av neurala komplex10,11,12 till aktivera karakterisering av resistensmekanismer på nivån av nerven, verkningsmekanismen av nyutvecklade droger och andra toxikologiska studier.
Bananflugan, D. melanogaster, är en gemensam modellorganism för att definiera insekt neurala system eller insektsmedel verkningsmekanism och har etablerat sig som en väl lämpad modellorganism för studien av toxikologiska13, farmakologiska14 ,15, neurofysiologiska16och patofysiologiska17,18,19,20 processer av ryggradsdjur. D.melanogaster är en holometabola insekter som utför fullständig metamorfos, inklusive ett larval och Pupp skede innan den når den reproduktiva adult Stadium. Hela utvecklingsprocess, nervsystemet genomgår betydande remodeling i olika levnadsstadier, men larval CNS kommer att vara i fokus för denna metod. Fullt utvecklad larval CNS är anatomiskt enkel med bröst- och bukhåla segment som är smält och bildar den ventrala ganglion, som representerar en rad upprepade och nästan identiska neuromeric enheter21,22. Fallande motoriska nerver härstammar från kaudala slutet av subesophageal ganglier och nedstiga för att innerverar kroppen väggen muskler och viscerala organ av larverna. Figur 1 beskriver det larval Drosophila CNS gross anatomi.
På Drosophila blod - hjärnbarriären (BBB) utvecklar i slutet av embryogenes och bildas av subperineurial gliaceller (SPG)21. SPG cellerna bildar talrika filopodia-liknande processer utspridda för att upprätta en sammanhängande, väldigt platt, endotel-liknande blad som täcker den hela Drosophila CNS23. Den Drosophila BBB har likheter med ryggradsdjur BBB, vilket inkluderar bevara homeostas av de neurala närmiljön genom att kontrollera näringsämnen och xenobiotika inträde i CNS21. Detta är en förutsättning för tillförlitlig neurala överföring och funktion, ännu skydd av CNS av BBB begränsar genomträngning av syntetiska droger, de flesta peptider och andra xenobiotika24,25, som introducerar potential problem när kännetecknar potencies av småmolekylär modulatorer. Metoden använder en enkel transection att störa denna barriär och ge redo farmakologiska tillgång till de centrala synapserna. Den största styrkan av metoden som beskrivs är enkelhet, reproducerbarhet och relativt hög genomströmning kapacitet inneboende till detta system. Protokollet är relativt lätt att bemästra, installationen kräver lite utrymme, och endast en inledande finansiella ingång är nödvändigt som reduceras till reagenser och förbrukningsvaror. Den beskrivna metoden är dessutom helt Parkeringsleverantörer att registrera nervaktiviteten för centrala för fallande av huset flyga, Musca domestica26.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster (strain OR)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Kinetic Systems</td>
			<td>9200 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday Cage</td>
			<td>Kinetic Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope on a Boom</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800N</td>
			<td>Multiple scopes can be used; boom stand is critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/DC differential amplifier</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>AM3000H</td>
			<td>The model 1700 can be used instead of the model 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>audio monitor</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>AM3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hum Bug Noise Eliminator</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>726300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition System (PowerLab)</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>PL3504</td>
			<td>Multiple PowerLab models can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Chart Pro Software</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>N/A - Online Download</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Lights</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>89-740</td>
			<td>Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holder</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH715</td>
			<td>Different models are acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC cables</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>multiple based on size</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PG52151-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Also can use Narashige PC-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Wax</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>974228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-coated insect pins, size #2</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1208S2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fince Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recording of the central nervous system activity of third-instar drosophila melanogaster

Majoriteten av de för närvarande tillgängliga insektsmedel rikta nervsystemet och genetiska mutationer av ryggradslösa neurala proteiner ger ofta skadliga konsekvenser, men den nuvarande metoder för registrering av en enskild aktivitet i nervsystemet djuret är kostsamt och arbetskrävande. Detta sug elektrod beredning av tredje-instar larval centrala nervsystemet av Drosophila melanogaster, är ett fogligt system för provning av fysiologiska effekter av neuroactive ombud, fastställande fysiologiska roll olika neurala vägar till CNS verksamhet, liksom påverkan av genetiska mutationer till neurala funktion. Detta ex vivo -preparat kräver endast måttlig dissekera skicklighet och elektrofysiologiska expertis att generera reproducerbara inspelningar av insekt neuronal aktivitet. En mängd olika kemiska modulatorer, inklusive peptider, kan sedan appliceras direkt på nervsystemet i lösning med de fysiologisk koksaltlösning att mäta påverkan på CNS aktiviteten. Ytterligare, genetiska tekniker, såsom GAL4/UAS system kan användas självständigt eller tillsammans med farmakologiska medel att bestämma rollen av specifika jonkanaler, transportörer eller receptorer till leddjur CNS-funktion. I detta sammanhang är de analyser som beskrivs häri av betydande intresse för insektsmedel toxikologer, insekt fysiologer och utvecklingsmässiga biologer som D. melanogaster är en etablerad modellorganism. Målet med detta protokoll är att beskriva en Elektrofysiologisk metod för att möjliggöra mätning av electrogenesis av det centrala nervsystemet i modell insekt, Drosophila melanogaster, vilket är användbart för att testa en mångfald av vetenskapliga hypoteser.

Spontan aktivitet av fallande perifera nerver som härrör från Drosophila centrala nervsystemet kan registreras med extracellulära sug elektroder med konsekvent reproducerbarhet. Spontan aktivitet av den exciderad och transected Drosophila CNS producerar ett cykliskt mönster av spricker med 1-2 s av bränning med cirka 1 s av nära quiescent aktivitet. Till exempel CNS är nära quiescent (1-2 Hz) för 0,5-1 s, följt av en explosion (100-400 Hz) för cirka 1 s, och ...

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

Det här protokollet beskriver en metod för att registrera Drosophila melanogaster centrala nervsystemet möjliggör kostnadseffektiv och bekväm testning av farmakologiska agenter, genetiska mutationer av neurala proteiner, fallande elektriska aktivitet och/eller rollen av outforskade fysiologiska vägar.

Elektrofysiologiska inspelning av den centrala nervsystem aktiviteten av tredje-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Denna metod kan hjälpa till att svara på viktiga frågor inom områdena insektstoxikologi och insektsfysiologi genom att mäta elektrogenesen i Drosophila melanogaster centrala nervsystemet. Detta gör det möjligt för en att testa ett brett spektrum av vetenskapliga hypoteser och stöd i upptäckten av nya insektsmedel verkningssätt. Den största fördelen med denna teknik är att det ger en enkel, reproducerbara, och relativt hög genomströmning system med minimal finansiell input för att studera nervsystemet av Drosophila.Starta genom att öppna programvaran för förvärv/analys. Klicka på Installationsprogrammet i huvudverktygsfältet och välj Kanalinställningar, som kommer att öppna en dialogruta. Minska antalet totala kanaler till tre.Kanal ett kommer att spela in den råa signalen från förstärkaren med en räckvidd på 100 millivolt. Kanal två kommer att användas för att räkna antalet händelser från kanal ett som ligger över en given tröskel. För detta, klicka på fliken Beräkning för att öppna en rullgardinsmeny för kanal två.Välj Cykliska mått, som kommer att öppna en andra dialogruta. Välj kanal ett som källa. Välj sedan Enhetspik vid händelser på den nedrullningsgardins mätning.Slutligen, i området för identifieringsinställningar, från den nedrullningsgardet menyn, väljer enkel tröskel. Tröskelnivån är indata på detekteringsjusteringsfönstret som ska ställas in över bakgrundsljud. För att omvandla den elektriska aktiviteten till en kurstomt uttryckt i hertz väljer du Aritmetik på den tredje kanalen.På det nya fönstret, ingång 1000 gånger smoothsec, parenteser kanal två kommatecken två. Välj sedan på enheterna rullgardinsmenyn frekvensenheten hertz. Stäng dialogrutorna för att återgå till huvudskärmen.Y-axeln i kanal tre ska uttryckas i hertz och x-axeln i tid. Dissekera larven Drosophila CNS genom att först identifiera och extrahera en vandrande tredje-instar Drosophila melanogaster från odlingsflaskan och placera den i 200 mikroliter saltlösning. Sedan, ta tag i mun krokarna med ett par fina tlyckor, och ta tag i buken av maggot med ett andra par tlyckor, med lätt tryck, för att undvika att riva den tunna cuticular lagret.Dra försiktigt munhakarna och buken i olika riktningar för att separera den caudal änden av maggot från huvudet regionen och exponera inälvorna av maggot. CNS kommer att vara sammanflätade med luftstrupen och mag-tarmkanalen. Reta CNS ur matsmältningskanalen och luftstrupen med tärnor.Dissekering av Drosophila centrala nervsystemet från maggot är ett kritiskt steg för framgång. De dissekerade ganglierna måste vara intakta, utan någon nämnvärd skada på de fallande motoriska nerverna. Ett större antal motoriska nerver knutna till ganglierna kommer att öka baslinjen bränning frekvenser.Om det behövs, störa blod - hjärnbarriären genom att manuellt transecting CNS posterior till hjärnloberna med Vannas vårsax. Transection bör göras baserat på de fysiokemiska egenskaperna hos den kemikalie som används. Den röda linjen är den föreslagna transection punkt och transected CNS med intakt fallande perifera nerver stammar visas här.Till att börja, först dra glaspipettelektroden från borosilikatglas kapillärer till ett motstånd på fem till 15 megaohms. För in den transected CNS i en vaxkammare som innehåller 200 mikroliter av koksaltlösning. Kläm fast en obestruken insektstapp med en alligatorklämma som löds till jordledningen och sätt in stiftet i koksaltlösningen för att slutföra kretsen.Med hjälp av mikromanipulatorerna orientera du elektroden till den transected CNS-änden av caudal. Eliminera bakgrundsljud genom att justera tröskelnivån i förvärvs-/analysprogramvaran innan de perifera nervstammarna ansluts. Applicera lätt undertryck på sprutan för att dra in perifera nerver i sugelektroden.Starta registreringen på datainsamlingsprogramvaran och baslinjens avfyrningshastighet för att balansera i fem minuter innan du samlar in uppgifter om avskjutningshastighet vid baslinjen. Efter fem minuter, tillsätt 200 mikroliter av saltlösning och fordon för att få den totala volymen av kammaren till 400 mikroliter för att börja registrera kontroll bränning priser. Kassera preparatet och inspelningen om mönstret för avfyrning av kontrollbehandling inte liknar det exempel som visas här.När baslinjen har fastställts efter tre till fem minuter av inspelningen, dra tillbaka 200 mikroliter av saltlösning och tillsätt 200 mikroliter av den experimentella agenten solubilized i saltlösning. Märk denna tidpunkt av läkemedelsansökan i förvärv / analys programvara genom att inkludera en kommentar som inkluderar läkemedlet och den slutliga koncentrationen. Visas här är en representativ nerv ansvarsfrihet spår före och efter exponering för DMSO.Pilen anger tidpunkten för tillämpningen. Ett begränsat svar på DMSO ses. Ökande doser av propoxur förstärks spike ansvarsfrihet frekvensen av transected Drosophila CNS i en koncentration-beroende sätt, medan den neurodepressiva GABA minskat spike ansvarsfrihet frekvensen i en koncentration-beroende sätt.Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att det är ett ex vivo experiment, och därför villkoren för saltlösning, såsom pH och temperatur, är avgörande för långvarig aktivitet i det centrala nervsystemet beredningen. Likase det bristande främmande elektrisk aktivitet, en effektiv Faraday bur, och en minskning av 60-hertz buller är kritiska för framgång av denna analys. De data som samlas in genom denna analys kan hjälpa till att identifiera insekticids specifika verkningssätt.Efterföljande validering av dessa data genom andra metoder såsom spänning-clamp elektrofysiologi, biokemiska analyser och ytterligare farmakologiska analyser kan utföras.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualisering av embryonala nervsystemet i hela-fäste Drosophila Embryon

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Multimodal Imaging av stamceller implanteras i centrala nervsystemet hos möss

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Produktion av Lentiviral vektorer för att omvandla Celler från det centrala nervsystemet

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Märkning av enstaka celler i det centrala nervsystemet hos<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

En skada Paradigm att undersöka centrala nervsystemet Repair i<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Direkt Intraventrikulär tillförsel av läkemedel till Gnagare Centrala nervsystemet

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

Elektrofysiologiska inspelning Från<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Taste sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Bestämning av spontan rörelseaktivitet i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetic Stimulering av gnagare centrala nervsystemet

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Optisk Clearing av Mouse centrala nervsystemet med passiv CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...