Name: individual culturing of tigriopus copepods and quantitative analysis of their mate-guarding behavior
Uploaded: 2018-09-26T14:30:00
Duration: 6 min 24 s
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这项工作得到了来自日本住友基金会的资助 (基础科学研究项目赠款, 赠款编号: 150932) 和日本海洋无脊椎动物研究所 (2018 项个人研究补助金), RSB 和美国的赠款。国家科学基金会 (DEB-1556466) 到 RSB。我们感谢齐亚娜女士对培养和分期方法的反馈。

1. 为行为观察准备的原始动物
<ol><li>获得受精卵, 让他们孵化。<ol>
<li>收集妊娠女性携带透明橙 (即受精和在发展的先进阶段) 鸡蛋 (图 3C) 从股票文化与巴斯德吸管。在清洁培养基中轻轻吹打, 以避免其他动物的转移, 包括可能在文化中孵化的 nauplial 幼虫, 以此冲洗雌性。 注: 在本协议中, 以盐度为35% 的人工海水作为培养基。根据实验的目的, 使用不同的介质 (如具有较高盐度或附加溶质的人工海水)。 注: 见巴雷托et . 201512为建立实验室文化储备和californicus的方法 2016 13为自然人口的汇集站点的例子。彼得森等人还报告了他们的收集地点californicus, fulvus, 和日本的纬度和经度信息9。使用具有约30-50 毫升的塑料吸管从岩石池收集Tigriopus桡足。</li>
		<li>将每个雌性单独放置在一个6井细胞培养板的井中, 用干净的培养基 (图 4, 左)。确保没有其他动物 (包括 nauplial 幼虫) 污染油井。</li>
		<li>保持在20摄氏度的孵化器设置的板块, 12 小时的光黑暗周期, 以培养雌性, 直到他们释放卵囊。这一步骤通常需要十天, 取决于胚胎的种类和发育阶段。同时, 每个妊娠女性每周两次, 两粒细磨 (约 < 0.5 毫米直径) 鱼食品 (见资料表详细)。 注: 根据实验的目的使用不同的温度和光循环。更高的温度可以促进胚胎的快速发育。 注意: 避免过量的食物在水井中腐烂。如果食物碎片开始腐烂, 用巴斯德吸管将其从水井中取出。</li>
		<li>卵囊释放后, 用巴斯德吸管将雌性从培养井中取出。 注: 受精雌性能产卵2,3后代的多个离合器。如果需要, 将雌性转移到其他井中以收集进一步的离合器。</li>
	</ol>
</li>
	<li>收集 copepodids 的个人文化。<ol>
<li>保持板块与孵化幼体在孵化器和文化的幼体, 直到他们发展到第一 copepodid (CI) 阶段 (图 4, 中间)。这一步通常需要一到两个星期。每两天搜索 CI 动物一次, 用几粒细磨鱼的食物喂饱每个井。再用蒸馏水蒸发水。 注: 如果漂浮的碎片阻碍了视线, 用一小块纸巾略读。</li>
		<li>一旦 CI 动物开始出现, 收集他们从水井与 P-10 微其吹打卷设置约8µL, 在显微镜10X 到40X 放大 (图 4, 右)。在清洁人工海水中轻轻吹打, 将其洗净, 并将其放入24井细胞培养板中, 含2-3 毫米深度 (约400-600 µL) 人工海水。 注意: 避免将 nauplial 蜕皮或其他动物带入水井中, 用于个体文化。</li>
	</ol>
</li>
	<li>通过计数蜕皮蜕皮来跟踪个人的发展。<ol>
<li>蜕皮蜕皮每三天 (如果需要调整频率) 在每个井内部检查, stereomicroscopic 在暗场照明下, 10X 到40X 放大。蜕皮的 copepodids 是透明的和可辨认的毛腿, 一对尾拉米 (即,在尾端薄凸出结构) 和/或分割 prosome 和 urosome (图 5)。更改焦点和光照以检测井中不同深度的蜕皮 (图 6A)。 注意: 蜕皮蜕皮比蜕皮它们的动物小。开始检查从更低的放大倍数为动物和它相对地最近蜕皮并且转移到更高的放大率为更旧的 (即,更小的) 蜕皮。 注: 如果井中蜕皮损坏, 从进一步的发展跟踪中消除井, 避免发育阶段的误判。 注: 如果漂浮的碎片阻碍了视图 (图 6B), 用一小块纸巾略读。</li>
		<li>在每个井中记录 copepodid 蜕皮的总数量, 并在板盖上加上一个计数标记 (图 7)。在井中找到新的蜕皮, 将线条添加到标记中。 注: 如果有 nauplial 蜕皮污染的井, 消除他们从计数。</li>
		<li>用两粒细磨的鱼粮喂养每一个人。再用蒸馏水将水蒸发, 以维持盐度。 注: 饲料 copepodids 每三天, 以防止他们消费和损害蜕皮蜕皮, 这可能会影响发展阶段的估计 (步骤 1.3.4)。</li>
		<li>根据蜕皮的数量估计动物的发育阶段。如果没有蜕皮, 个人估计是在 CI 阶段。如果有一个到四蜕皮, 个人估计是在 CII 到 CV 阶段。如果有五蜕皮, 个人估计是成人。</li>
	</ol>
</li>
	<li>根据形态学识别成人性别。<ol>
<li>性动物通过检查他们的形态学。成人Tigriopus男性拥有膝上的第一触角与钩状和球状结构在远端 (图 3A)。成年女性的第一触角比雄性更平滑, 相对较薄 (图 3B)。一些女性也表现出深绿色的性腺脂在他们的身体 (图 3B, 3D)。</li>
		<li>在井盖上标明性别 (图 7B)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 护身行为的行为测试和录像记录
<ol><li>在测试日, 选择需要阶段和性别的动物进行行为测试。<ol>
<li>用精致的地面鱼食品喂饱养殖井中选定的个体, 让他们吃30分钟。同时, 进行步骤2.1.2 准备测试室。</li>
		<li>准备两个48井平底细胞培养板作为试验室;一个盘子 (以下称 "板材 A") 是为男性和另一个 ("板材 B") 是为目标 (例如copepodids, 成年女性, 成年男性)。添加400µL 的清洁人工海水, 盐度为35% 的板材井。将盘子放在一个 LED 灯垫上, 盖上半透明的丙烯酸板作为光扩散器 (图 8)。 注: 根据实验目的使用不同的介质。 注: 为避免过热, 请勿使用白炽灯或荧光灯作背光。</li>
		<li>在2.1.1 中描述的30分钟喂养时间后, 将每只动物轻轻地吹打成连续的24井板, 装满了干净的人工海水 (图 9), 以防止从养殖井中搬运碎片和蜕皮。</li>
		<li>把冲洗过的人放在盘子 A 和 B 的井里, 放在 LED 灯垫上。允许30分钟调整动物的水井。</li>
		<li>在调整期间, 在 a 板上设置一个摄像机 (图 8)。用三脚架或支架来握住相机。</li>
		<li>将相机对准平板 A 内的雄性, 以便观察触角。 注意: 为了减少电影中背光的闪烁, 请设置一个相当于或一半的电子频率的帧速率, 并使用较长的曝光时间。此外, 保持 LED 灯垫覆盖一个半透明的丙烯酸板, 如步骤2.1.2 所述。</li>
	</ol>
</li>
	<li>在步骤2.1.4 中描述的调整周期后, 开始视频录制和行为测试。<ol>
<li>将目标从板块 B 转移到板块 a 与巴斯德吸管。如果实验对介质中的化学成分敏感, 则对每一个测试对进行更改吸管。 注: 当吹打的动物从 B 板块, 不要追逐它在水中与巴斯德吸管, 水干扰可以刺激动物和引发其过剩的运动。将吸管的尖端稍放在水面上方, 等待个人进入尖端。用少量人工海水轻轻地将其吸干, 然后将其喷射到 a 板上的井中。</li>
		<li>根据一项实验计划, 允许男性和目标在每个井中相互作用, 达到预期的观察时间 (例如10 分钟) 转移后。</li>
		<li>在观察时间结束后停止视频录制。如有必要, 将录制的电影从照相机下载到计算机。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 行为特性的人工分析
<ol><li>检查影片的时间, 当每个目标被转移到 A 板块井。</li>
	<li>检查感兴趣事件的启动和终止时间, 并计算事件的持续时间、滞后时间和频率。<ol>
<li>定义启动的保护尝试由男性作为一个接触的男性的天线与任何身体部分的目标 (图 10, 左上)。触角的接触通常在前面有一个 swift (< 0.5 s) 追逐或突袭。</li>
		<li>当两个雄性的触角从目标体中分离出来时, 将守护尝试的终止定义为一个点 (图 10, 右上角)。计算守卫尝试的频率, 如: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58378/58378eq1.jpg">
</li>
		<li>定义交配的开始, 由一个男性的背部身体弯曲, 后面是一个 urosome 的重复按下的女性 (图 10, 右下)。推的频率每秒数次。 注意: 在交配前, 一个守卫的雄性爬行到雌性身体的尾端 (图 10, 左下)。</li>
		<li>在3.2.4 中描述的事件后, 定义 urosomes 的终止交配。 注意: 在californicus和日本的情况下, 交配通常发生数分钟。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 对个人和对的二维跟踪
<ol><li>通过修剪在步骤2中录制的影片, 并使用电影编辑软件, 生成一个带有兴趣集 (例如, 前3秒的守护尝试) 的视频剪辑。</li>
	<li>安装 ImageJ14从: https://imagej.nih.gov/ij/download.html。然后下载 MTrackJ, 一个运动跟踪插件为 ImageJ15, 通过以下说明: https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/。</li>
	<li>打开 ImageJ 并导入感兴趣的电影 (例如,文件 > 导入 > 使用 QuickTime; 选择 "转换8位灰度" 以减少图像处理所需的内存)。</li>
	<li>执行空间和时间校准。<ol>
<li>在 ImageJ 窗口中选择直线选择工具以进行空间校准。</li>
		<li>在影片窗口中, 沿已知长度 (如井径) 的对象绘制选区线。</li>
		<li>打开 "设置比例" 菜单 (分析 > 设置比例)。在 "长度单位" 框中输入 "已知距离" 框及其单位 (例如mm) 中已知的长度。单击 "全局" 复选框可使用其他视频剪辑的刻度。</li>
		<li>打开 "属性" 菜单 (图像 > 属性) 进行时间校准。在 "帧间隔" 框中输入帧间隔 (帧速率的倒数)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用 MTrackJ 配置跟踪。<ol>
<li>在 ImageJ 上打开插件 > MTrackJ 的 MTrackJ 插件。单击 "MTrackJ" 对话框窗口中的 "跟踪" 按钮, 打开 "跟踪配置" 菜单。</li>
		<li>通过检查 "添加点后移到下一次索引", 然后在 "配置" 对话框窗口中输入 "时间步长" 方框中的数字, 设置跟踪间隔。要执行帧间跟踪, 请在 "时间步长" 框中输入 "1"。</li>
		<li>选中 "在跟踪过程中应用本地游标捕捉", 然后选择 "暗质心" 作为快照功能。此选项允许在游标周围的检测方块 ("捕捉范围") 内自动检测暗物体 (即单个或一对) 的质心。选择正方形的大小以覆盖影片中的整对或动物 (例如31 x 31 像素)。</li>
		<li>单击 "确定" 以应用所选选项。</li>
	</ol>
</li>
	<li>执行二维跟踪。<ol>
<li>单击 "MTrackJ" 对话框窗口中的 "添加" 按钮开始跟踪。</li>
		<li>放置游标 (检测方) 以覆盖一对或要跟踪的个人。单击以检测正方形内对象的暗质心。</li>
		<li>对所需的帧数重复步骤4.6.2。</li>
		<li>要生成数据表, 请在 "MTrackJ" 对话框窗口中单击 "度量" 按钮。数据显示在两个窗口中: "MTrackJ: 曲目" 窗口显示跟踪的二维轨迹的摘要和 "MTrackJ: 点" 显示每个时间点的详细数据。要保存每个表, 请在 ImageJ 上选择 "文件" > "另存为..." 菜单。 注: 请参阅开发人员 (https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/) 提供的联机手册, 以说明每个数据列的描述。</li>
		<li>要生成以彩色线条绘制的跟踪轨迹的影片, 请单击 "MTrackJ" 对话框窗口中的 "影片" 按钮。要保存生成的影片, 请在 ImageJ 上选择 "文件" > "另存为..." 菜单。</li>
	</ol>
</li>
	<li>保存整个结果。单击 "MTrackJ" 对话框窗口中的 "保存" 按钮以保存结果, 包括数据 (步骤 4.6.4) 和跟踪的二维轨迹 (步骤4.6.2 和 4.6.3)。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chullasorn, S., Dahms, H. U., Klangsin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+species+of+Tigriopus+(Copepoda:+Harpacticoida:+Harpacticidae)+from+Thailand+with+a+key+to+the+species+of+the+genus.">A new species of Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida: Harpacticidae) from Thailand with a key to the species of the genus.</a> Journal of Natural History. 47 (5-12), 427-447 (2013).</li><li>Fraser, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occurrence,+ecology+and+life+history+of+Tigriopus+fulvus+(Fischer).">The occurrence, ecology and life history of Tigriopus fulvus (Fischer).</a> Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 20 (3), 523-536 (1936).</li><li>Burton, R. 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作者没有什么可透露的。

个体培养与阶段与性别的确定
在这里, 我们描述了在我们以前的研究5中使用的方法, 以准备处女Tigriopus动物的配对经验控制, 同时跟踪他们的发展 (图 4和图 7)。由于Tigriopus物种被用作动物在各种生物领域, 如毒理学16,18, 生态生理学19,20,21和进化遗传学13,22,23,24, 这种方法有可能提供一个宝贵的方法来评估环境和遗传因素对这些桡足的生命周期的影响。
为了获得成功的分期, 定期搜索和收集的 CI copepodids 从大众文化 (步骤 1.2) 是至关重要的, 因为收集在以后阶段可能导致错误的动物分期。此外, 彻底搜索蜕皮 (步骤 1.3) 对于准确的分期也是必不可少的。增加收集和分期的频率, 如有必要, 因为 molts 之间的间隔根据物种和养育条件2,25,26不等。在Tigriopus16、25的某些物种和种群中, copepodids 和成年雌性的触角形态差异并不明显。因此, 性行为前分期有助于区分成年女性与高级 copepodids 的任何性别。
行为行为测试与动作属性的人工分析
一般而言, 动物行为学研究最关键的部分之一是对感兴趣事件的定义和描述。本文介绍的方法首先为我们最近的研究开发了5 , 并补充了交配和视觉辅助的描述 (图 10)。此外, 动物处理的一致性在行为实验中也起着重要的作用。例如, 对桡足类的冲洗可能会促进其行为的某些方面 (补充图 1), 因此, 最好在样本之间以一致的方式进行, 例如在步骤2.1.3 中标准化。我们期望本文提供的材料将有助于对Tigriopus的交配行为进行控制和重现性研究, 促进这一丰富的潮汐池居民的生殖和生态研究。
这种方法的一个可能的限制是获得的图像的放大率较低。虽然我们的系统记录的电影允许识别突出的身体结构, 包括 urosomes 和男性第一触角, 你可能无法观察到更微妙的结构, 如腿部和生殖器与我们的方法, 因为它不使用视频录制的显微放大倍数。凯利等人报告说, 他们能够观察到精荚从雄性向雌性的转移在显微镜下观察100X 放大 (没有视频记录)7, 我们没有能够观察到一个精荚在我们的电影中, 也许是由于图像分辨率的限制。
对的二维跟踪
虽然这种方法不允许对动物进行三维跟踪, 但它能够对浮游动物进行二维弹道分析, 而没有化学标记动物 (cf。猪油等201027) 利用免费分发的程序。如果影片文件的大小太大而无法在 ImageJ 中处理, 则可以减少文件的分辨率并将其转换为灰度级影片。虽然所描述的方法最初是为成人对californicus (图 12 和图 13) 开发的, 但它也可用于成人-少年对和单个个体 (补充图 1) 作为以及其他Tigriopus物种的原理。我们进一步期望该方法适用于短期 (从毫秒到第二次尺度) 的弹道分析的其他分类群浮游动物适当的调整。

Tigriopus属的潮间性桡足, 广泛分布在1多个大洲的岩石高潮之间。这些桡足类显示交配保护行为作为他们的再生产的一部分, 在那里成年男性捕获一个潜在的配偶 (少年或成人) 利用其钩第一触角在交配前 (图 1 和图 2)2 ,3,4,5。尽管这一现象一直是2、3、6、7的动物行为学和生物化学研究的一个主题, 但对这一行为的研究的详细程序包括原始动物的个体文化和行为事件的标准被看见在一个交配的企图, 没有被描述得很好。因此, 我们在这里建立方法, 使研究的行为在受控实验环境下。
动物的个体培养和分期
以往对Tigriopus生殖的研究传统上采用了一对分离法, 准备青少年 (copepodids) 和成年女性进行行为测试和育种实验3,8,9 ,10。然而, 这种方法允许动物形成对和潜在的交配之前的测试 (在 Ito 198811), 这可能会改变动物的行为属性5。此外, 也有可能误判的发展阶段的桡足与常规的协议, 因为它们依赖于明显的身体大小分期。本文用Tigriopus californicus5的方法, 描述了我们最近研究中使用的个体培养法, 旨在通过控制动物配对经验和跟踪它们的发育来解决这些局限性。从 copepodid 到成人阶段。
同伴保护行为的定量分析
在动物行为学2、6 、生态和进化遗传学3、4等领域, 研究了Tigriopus物种的交配保护行为,7,8,9,10. 然而, 以前的研究主要以书面形式解释了这种行为的过程, 没有足够的可视插图来概述研究这一行为的方式和方法, 这就造成了技术障碍, 为研究的复制和推进。在这里, 我们提供了一些关键事件的详细描述, 在Tigriopus桡足支的交配行为的视觉材料支持。我们还展示了定量分析行为的设备和方法。这些方法允许在精确复制实验中对动物的行为特性进行评估。
通过这些方法, 我们的目的是为Tigriopus属的交配保护行为的控制和重现性研究提供一种方法学基础。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Spectrum Brands. Inc.</td>
			<td>SS1-160P</td>
			<td>For preparation of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRO PlecoWafers</td>
			<td>Tetra</td>
			<td>16447</td>
			<td>Food for copepods (used after being ground in a mortar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid</td>
			<td>Corning Co., Ltd.</td>
			<td>353224</td>
			<td>Container for culture of gravid females and hatched nauplii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 24-well cell culture plate with lid</td>
			<td>Corning Co., Ltd.</td>
			<td>353226</td>
			<td>Container for individual culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 48-well cell culture plate with lid</td>
			<td>Nest Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>748001</td>
			<td>Behavioral observation chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light pad</td>
			<td>Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd.</td>
			<td>Litup LP4</td>
			<td>Backlight for behavioral observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Canon</td>
			<td>0591C003 (model: Rebel T6i)</td>
			<td>For recording of behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td>For transfer of copepods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 micropipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0735</td>
			<td>For transfer of C1 stage copepodids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.49t</td>
			<td>For semi-automatic analysis of movies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTrackJ</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.5.1</td>
			<td>ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

individual culturing of tigriopus copepods and quantitative analysis of their mate-guarding behavior

Tigriopus属的桡足类, 是岩石潮汐池中常见的浮游动物, 它显示了 precopulatory 交配的行为, 在那里雄性会扣下一个潜在的伴侣形成一对。虽然这一现象引起了研究者的兴趣, 但其分析方法还没有得到很好的描述。这里我们描述的程序: 1) 个体培养和分期的Tigriopus青少年和成人, 和 2) 基于视频的分析他们的交配行为。这种培养方法能够对动物的削皮经验进行实验控制, 并能在行为测试前跟踪它们的发育。该分析方法可以定量地评价同伴保护行为的几个方面, 包括雄性的捕获尝试和配对的游泳轨迹。尽管这些方法最初是为Tigriopus的动物行为学研究而建立的, 但经过适当的修改, 它们也可以应用于不同研究领域的其他浮游动物的研究, 如生理学、毒理学和生态遗传学。

在步骤1中描述的个体培养方法允许准备和分期的原始动物没有配对的经验。
步骤2中描述的行为测试允许视频记录和观察Tigriopus桡足的交配行为。下面对录制的视频进行了以下检查: 步骤3和4中描述的方法可以对图 1中显示的行为的几个方面进行定量分析。
图 11显示了男性-女性对和男性-男性对californicus的平均保护时间的不同。人工分析表明, 雄-雄对比男-女对表现出相对较短的配对时间。
图 12给出了用分析方法跟踪的轨迹示例,图 13显示了速度分析的一个代表性结果。对californicus新形成的保护副进行二维空间跟踪, 发现在前3秒的保护尝试中, 雄-雄对的速度比男-女对高。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig1.jpg"> 图 1: Tigriopus中的交配防护行为.(A)成年男性抱着幼年 (copepodid) 与第一触角 (由蓝色箭头表示)。酒吧 = 1 毫米(B) 护甲行为概述。雄性试图捕捉目标个体 (左) 并与之形成一对 (中间)。在男性-男性对和一些男性女性对, 守卫企图终止, 不用交配。这一数字已从 Tsuboko-石井和伯顿 20175修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig1large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig2.jpg"> 图 2: Tigriopus的发育阶段.Tigriopus种类一般经历六无节幼体阶段 (从 NI 到 NVI), 五 copepodid 阶段 (从 CI 到 CV), 和成人阶段 (CVI)16。雄性从早期的 copepodids ( fulvus6,17和 CII 在t californicu3) 中对幼仔进行保护, 以及对男女成人 5.这一数字已从 Tsuboko-石井和伯顿 20175修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig2large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig3.jpg"> 图 3: 成年人的形态学 (californicus).成年男性。(B)成年女性。(C)妊娠成年女性, 其卵囊带有受精和发育 (透明橙) 卵。(D)妊娠成年女性, 卵囊中有未受精或未发育的 (深绿色) 卵。箭指的是卵囊。酒吧 = 1 毫米.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig4.jpg"> 图 4: 个人文化的准备大纲.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig4large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig5.jpg"> 图 5: 蜕皮蜕皮.(a)蜕皮从 CI 到californicus的单一动物的 CV 阶段。酒吧 = 1 毫米(B)蜕皮从 CI 到个人文化的 CV 阶段。白色碎片是在井中培养的动物的粪便 (图像中没有显示)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig5large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig6.jpg"> 图 6: 在显微镜下搜索蜕皮.条形 = 1 毫米(a)在不同深度检测蜕皮的显微镜的焦距变化。洋红色箭头表示聚焦的蜕皮和灰色箭头表示未聚焦的蜕皮。顶部的图像集中在左蜕皮, 这是沉没在底部的井。底部的图像聚焦在右蜕皮, 它是浮动在中等表面之下。(B)顶部图像显示了在介质表面漂浮的碎片阻碍检查的例子。绿色箭头表示隐藏在碎片下的蜕皮。底部图像显示的结果, 表面清洗与一小块纸巾。蜕皮 (由绿色箭头指示) 在清洗后可见。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig6large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig7.jpg"> 图 7: 动物的分期和性别.如何标记在一个文化板块的盖子上的动物蜕皮和性别的数量的例子。(a)一个包含五蜕皮和一只成年动物的井的例子。盖子上的计数标记中的行数代表了井中发现的蜕皮的数目。当蜕皮的数量达到五, 动物的性别可以根据触角的形态学来确定 (参见图 3)。(B)一个文化板块有标记的盖子的例子。顶端的行包含较旧的 (文明到成人) 动物和底部的行包含年轻 (即新收集的) 动物 (CI 到 CIII)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig7large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig8.jpg"> 图 8: 行为测试方案.设置的视频记录的队友守卫行为 (左) 和行为测试大纲 (右)。这一数字已从 Tsuboko-石井和伯顿 20175修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig8large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig9.jpg"> 图 9: 在行为测试之前冲洗动物.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig9large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig10.jpg"> 图 10: 手动分析中检查的事件的定义.与护卫企图有关的事件的插图。突出显示步骤3中定义和分析的事件的名称。在一些队友守卫的尝试中, 可能不会观察到虚线中所包含的事件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig10large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig11.jpg"> 图 11: 男性-女性对与男性-男性对californicus的护期差异。每个三角形符号表示来自一个测试对的数据。条形和胡须分别代表中线和四分位范围。男性女性对 (男性-女性 (n=22), 男性男性 (n=29) 的平均捕获时间更大; **p < 0.01 由曼-惠特尼 U 测试)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig11large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig12.jpg"> 图 12: 在守卫尝试的前三秒中对的轨迹.californicus的男性-女性对 (左) 和雄-雄对 (右) 的跟踪二维轨迹的例子。轨迹上的点表示时间点 (每秒30帧)。酒吧 = 10 毫米.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig12large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的大版本.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig13.jpg"> 图 13: 雄-雌对与雄-雄对californicus后平均速度的差异。每个三角形符号表示来自一个测试对的数据。条形和胡须分别代表中线和四分位范围。对男性男性对 (男性女性 (n=13), 男性男性 (n=35), 在前 3 s 的保护尝试的平均速度是更大的. **p < 0.001 由曼-惠特尼 U 测试)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig13large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Suppl Figure 1" src="/files/ftp_upload/58378/58378sfig1.jpg"> 补充图 1: 漂洗处理对Tigriopus行为的影响.每个圆圈或三角形符号表示来自一个已测试的单个或一对的数据。条形和胡须分别代表中线和四分位范围。"冲洗" 和 "未冲洗" 组的个人处理方式相同, 但 "未冲洗" 组在30分钟调整时间之前 (步骤 2.1.4) 未经历冲洗处理 (步骤 2.1.3)。(A)经冲洗的雄性平均速度往往大于未冲洗的雄性 (冲洗 (n=6), 不冲洗 (n=6), 生理盐水: 曼-惠特尼 U 试验未发现显著差异。根据调整时间后录制的视频, 测量了三十年代的速度。(B)经冲洗的雌性平均速度往往大于未冲洗的雌性 (冲洗 (n=6), 未冲洗 (n=6), 生理盐水: 曼-惠特尼 U 试验未发现显著差异。根据在调整时间后录制的视频, 在步骤 4 (跟踪间隔 = 0.5 秒) 的基础上测量了三十年代的速度。(C)对冲洗过的个人 (冲洗 (n=6), 不冲洗 (n=6) 的防护次数更大. ** < 0.01 由曼-惠特尼 U 测试)。(D)对冲洗过的个人 (冲洗 (n=6)、未冲洗 (n=6)、生理盐水: 在曼-惠特尼 U 试验中没有发现显著差异的情况下, 防护企图的持续时间往往更大。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378sfig1large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>

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Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior

Tigriopus桡足的个体培养及其交配行为的定量分析

交配行为在Tigriopus属潮间型桡足的繁殖中起着重要的作用。然而, 研究这种行为的方法还没有得到很好的描述。这里我们描述的方法为: 1) 处女Tigriopus动物的个体文化, 和 2) 他们的交配行为的定量分析。

Copepods of the genus Tigriopus, which are common zooplankton in rocky tide pools, show precopulatory mate-guarding behavior where a male clasps a ...

这种栽培技术的主要优点是，你可以获得处女的科普，同时控制他们的配对经验，并跟踪他们的发展。以下行为分析方法有助于对岩石潮汐池中常见的浮游动物的Tigriopus动物的配合保护行为进行控制和可重复的实验。虽然这些方法可以提供对Tigriopus的生殖行为的洞察，它们也可以用来研究遗传和环境因素如何影响这些动物的生理和行为。首先，使用巴斯德移液器收集携带透明橙色鸡蛋的麦格雌性从股票培养。通过温和的移液用干净的培养介质冲洗女性。接下来，将每个女性放入具有清洁培养的六井细胞培养板的单个井中。然后把盘子放在孵化器里培养雌性，直到它们释放卵囊。卵囊释放后，使用巴斯德移液器将雌性从盘子的井中去除。一旦动物在第一个动物阶段或CI开始出现，使用P-10微管收集它们。每两到三天，监测井中有被剥去的口水。在此之后，通过检查它们的天线形态对动物进行性攻击。要正确识别成年女性，请确保她们已经在培养井中脱了五口，因为成年女性和青少年之间的天线形状差异在某些人群中并不明显显著。选择适当阶段和性别的动物后，用细磨鱼食喂养选定的个体。当动物吃的时候，准备两个48孔的平底细胞培养板作为测试室。30分钟后，通过移液冲洗每个动物，将四口井连续打入一个装满清洁人工海水的24孔板。然后将冲洗过的个体放在 LED 灯垫上的板 A 和 B 的孔中。让动物适应30分钟，然后使用巴斯德移液器将目标从B板转移到A板。首先，检查视频中每个目标被转移到板 A 上的井的时间。Next，定义男性的守卫尝试的开始，作为男性天线与目标任何身体部位的接触。将雄性天线与目标身体分离时，男性的护身尝试的终止定义为点。然后，定义由男性的后体弯曲开始交配，然后重复按一个对女性的尿样。首先，使用电影编辑软件修剪影片，生成以感兴趣的情节为特色的视频剪辑。然后，打开 ImageJ 并导入视频剪辑。选择隐蔽的 8 位灰度选项以减少图像处理所需的内存。接下来，选择用于空间校准的直线选择工具，然后沿井的直径绘制一条选择线。打开设置比例菜单，并在已知距离框中输入已知长度，并在长度单位框中输入单位。在此之后，打开属性菜单并在帧间隔框中输入帧间隔。通过选择插件和 MtrackJ 打开 MtrackJ 插件。然后，单击对话框窗口中的跟踪按钮以打开跟踪配置菜单。检查在跟踪过程中应用局部光标捕捉，并选择深色质心作为捕捉功能。接下来，单击 MTrackJ 对话框窗口中的添加按钮开始跟踪。放置光标以覆盖要跟踪的视频剪辑中的个人。然后，单击以检测方块内对象的暗质质。若要生成数据表，请单击 MTrackJ 对话框窗口中的度量表，然后单击影片按钮以生成以彩色线条绘制的跟踪轨迹的影片。最后，单击 MTrackJ 对话框窗口中的保存按钮以保存结果，包括跟踪的二维轨迹中的数据。在这个实验中，记录和观察了Tigriopus的配偶保护行为。分析表明，在男女对和男、女对中，男女对和男、女对的平均守卫尝试时间不同，男、女对的男对男女对的穿防尝试时间比男、女对的男女对的男女对平均穿防尝试时间短。对新形成的Tigriopus卡利夫诺尼斯的两维空间跟踪显示，在守卫尝试前三秒，雄对和雄对往往比雄女对显示更高的速度。这项技术开发后，为伦理学、生物化学和进化遗传学领域的研究人员探索这类动物的独特交配系统铺平了道路。

Research

JoVE Journal

Environment

Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior

Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae

脂肪酸组分和含量微藻分析

A method to determine the content and composition of total fatty acids present in microalgae is described. Fatty acids are a major constituent of ...

科研

环境科学

Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies

从个人污秽苍蝇检测食源性细菌病原体

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a ...

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

使用摇蚊科（双翅目）的表面浮蛹蜕为快速生物议定书水体

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

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藤壶Balanus improvisus作为海洋模型的培养和基因表达

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...