Name: individual culturing of tigriopus copepods and quantitative analysis of their mate-guarding behavior
Uploaded: 2018-09-26T14:30:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior at JoVE.com

Ce travail est soutenu par des subventions de la Fondation Sumitomo, Japon (subvention pour des projets de recherche sciences fondamentales, numéro de licence : 150932) et l’Institut de recherche des invertébrés marins, Japon (subvention de recherche individuels de 2018) à STI RSB et une subvention des États-Unis National Science Foundation (DEB-1556466) RSB. Nous remercions Mme Kiana Michelle Woodward pour vos commentaires sur la méthode de culture et mise en scène.

1. préparation des animaux vierge pour l’Observation comportementale
<ol><li>Obtenir des oeufs fécondés et leur permettre d’éclore.<ol>
<li>Recueillir des femelles gravides transportant des oeufs orange clair (c.-à-d., fécondés et à un stade avancé de développement) (Figure 3) d’une culture de réserve avec une pipette Pasteur. Rincer les femelles en leur pipetage doucement en milieu de culture propre pour éviter le transfert d’autres animaux, comme des larves de nauplial qui peuvent ont éclos dans la culture. Nota : Dans le présent protocole, l’eau de mer artificielle avec une salinité de 35 % est utilisé comme milieu de culture. Utilisez le support différents (par exemple eau de mer artificielle avec une salinité plus élevée ou un soluté supplémentaire), selon le but d’une expérience. Remarque : Voir Barreto et coll. 201512 pour une méthode de mise en place des stocks de culture de laboratoire et Pereira et coll. 201613 pour obtenir des exemples de sites de collecte des populations naturelles de T. californicus. Peterson et al a aussi déclaré leurs sites de collecte de T. californicus, fulvus T.et T. japonicus avec la latitude et la longitude d’information9. Utiliser pipettes en plastique d’une capacité d’environ 30-50 mL pour recueillir des copépodes Tigriopus de piscines Rocheuses.</li>
		<li>Placer chaque femelle individuellement dans un puits d’une plaque de culture de cellules de 6 puits avec milieu de culture propre (Figure 4, gauche). Assurez-vous qu’aucun autre animal (y compris les larves nauplial) ne contamine les puits.</li>
		<li>Maintenir les plaques dans un incubateur fixé à 20 ° C, avec un cycle lumière-obscurité de 12 heures à la culture les femelles jusqu'à ce qu’ils libèrent les ovisacs. Cette étape prend généralement d’un à dix jours selon les espèces et stades de développement des embryons. Pendant ce temps, nourrir chaque femelle gravide deux fois par semaine avec deux grains de nourriture pour poissons finement au sol (environ < 0,5 mm de diamètre) (voir la Table des matières pour plus de détails). Remarque : Utilisez des températures différentes et des cycles de lumière selon le but d’une expérience. Des températures plus élevées peuvent faciliter un développement plus rapide des embryons. Remarque : Évitez de laisser l’excès de nourriture en décomposition dans les puits. Si les débris de nourriture commencent à se désintégrer, il Pipetter hors puits avec une pipette Pasteur.</li>
		<li>Après que ovisacs sont libérés, supprimer les femelles provenant des puits de culture avec une pipette Pasteur. Remarque : Les femelles inséminées sont capables de frai plusieurs griffes de progéniture2,3. Le cas échéant, transférer les femelles dans les autres puits pour recueillir les autres griffes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recueillir les copépodites de la culture individuelle.<ol>
<li>Garder les plaques avec des nauplies écloses dans l’incubateur et la culture les nauplies jusqu'à ce qu’ils développent au premier stade copépodite (CI) (Figure 4, milieu). Cette étape prend généralement d’une à deux semaines. Chacun avance bien avec quelques grains de la finement moulu nourriture pour poissons tout en cherchant des animaux CI une fois tous les deux jours. Ravitailler en eau d’élevage évaporée avec l’eau distillée. Remarque : Si des débris flottants fait obstacle à la vue, survolez avec un petit morceau de papier absorbant.</li>
		<li>Dès que les animaux CI commencent à émerger, collectionnent des puits avec une micropipette de P-10 avec son volume de pipetage fixé à environ 8 µL, sous un stéréomicroscope à 10 X à 40 X (Figure 4, droit). Lavez chaque animal CI par pipetage il doucement dans l’eau de mer propre et placez-le dans un puits de la plaque de culture cellulaire de 24 puits contenant de 2 à 3 mm de profondeur (environ 400-600 µL) d’eau de mer artificielle. Remarque : Évitez de transporter sur des exuvies nauplial ou d’autres animaux dans les puits pour culture individuelle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Suivre l’évolution des individus en comptant les exuvies muées.<ol>
<li>Examiner l’intérieur de chaque puits d’exuvies muées chaque deux ou trois jours (régler la fréquence si nécessaire) par l’observation des sous un éclairage de fond noir 10 X à 40 X. Exuvies de copépodites sont transparentes et reconnaissable avec les poils des jambes, une paire de rames caudales (c.-à-d., mince qui dépassent les structures à l’extrémité caudale), et/ou segmentation du prosome et urosome (Figure 5). Changer le focus et l’illumination pour détecter les exuvies à différentes profondeurs dans un puits (Figure 6 a). Remarque : Les exuvies muées sont plus petits que l’animal qui a mué eux. Entreprendre l’examen de plus faible grossissement un animal relativement récente exuvies et Maj d’à un grossissement supérieur pour plus âgés exuvies (c.-à-d., plus petit). Remarque : Si les exuvies dans un puits sont endommagés, éliminer le puits de plus amples développement suivi pour éviter l’erreur de jugement de stades de développement. Remarque : Si des débris flottants fait obstacle à la vue (Figure 6 b), lait écrémé avec un petit morceau de papier absorbant.</li>
		<li>Enregistrer un nombre total d’exuvies de copépodite dans chaque puits avec une marque de pointage sur le couvercle de la plaque (Figure 7). Ajoutez une ligne au trait comme un nouveau exuvies se trouve dans le puits. Remarque : S’il y a nauplial exuvies contaminés dans le puits, éliminer du comte.</li>
		<li>Nourrir chacun avec deux grains de la finement moulu nourriture pour poissons. Ravitailler en eau d’élevage évaporée avec l’eau distillée pour maintenir la salinité. Remarque : Nourrir les copépodites tous les deux ou trois jours pour les empêcher de consommer et d’endommager les exuvies muées, qui pourraient potentiellement influencer estimation du stade de développement (étape 1.3.4).</li>
		<li>Évaluer le stade de développement de l’animal selon le nombre des exuvies. S’il n’y a aucun exuvies, l’individu est estimé au stade de la CI. S’il y a des exuvies d’un à quatre, l’individu est estimé au CII aux stades de CV. S’il y a cinq exuvies, l’individu est estimé à un adulte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifier le sexe des adultes selon la morphologie.<ol>
<li>Sexe des animaux en examinant leur morphologie. Les mâles adultes de Tigriopus possèdent géniculés premières antennes avec crochet structures globulaires à l’extrémité distale (Figure 3 a). Les femelles adultes possèdent des antennes plus lisses et relativement mince premiers (Figure 3 b) que celles des mâles. Certaines femelles présentent également une couleur vert foncé de lipides gonadique dans leur corps (Figure 3 b, 3D).</li>
		<li>Marquer le sexe sur le couvercle du puits (Figure 7 b).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. comportement Test et l’enregistrement vidéo du comportement Mate-gardiennage
<ol><li>Une journée de test, sélectionnez animaux de scène désirée et le sexe pour un test comportemental.<ol>
<li>Nourrir les personnes choisies dans les puits de culture avec finement les aliments de poissons de fond et laissez-les manger pendant 30 minutes. Pendant ce temps, passer au point 2.1.2 pour préparer les chambres de tests.</li>
		<li>Préparer deux plaques de culture cellulaire fond plat 48-bien que le test des chambres ; une plaque (ci-après dénommée « plaque A ») est pour les hommes et l’autre (« plaque B ») pour cibles (par exemple copépodites, les femelles adultes, adultes de sexe masculin). Ajouter 400 µL d’eau de mer propre avec une salinité de 35 % dans les puits des plaques. Placer les plaques sur un tapis de lumière LED recouvert d’une planche acrylique translucide comme un diffuseur de lumière (Figure 8). Remarque : Utiliser un médium différent selon un but de l’expérience. Remarque : Pour éviter les excès de chaleur, n’utilisez pas de lampes incandescentes ou fluorescentes comme un rétro-éclairage.</li>
		<li>Après le temps d’alimentation 30 min décrit à la section 2.1.1, rincer chaque animal par pipetage doucement il en une succession de quatre puits d’une plaque de 24 puits rempli d’eau de mer propre artificielle (Figure 9) pour éviter le report des débris et des exuvies des puits de culture.</li>
		<li>Placer les individus rincés dans les puits de plaques A et B sur la rampe de lumière LED. Comptez 30 mn pour le réglage des animaux dans les puits.</li>
		<li>Définissez une caméra vidéo au-dessus de la plaque A au cours de la période d’ajustement (Figure 8). Utilisez un trépied ou un pied pour tenir la caméra.</li>
		<li>Concentrer la caméra sur les mâles à l’intérieur de la plaque A pour permettre une observation des antennes. Remarque : Pour réduire le scintillement de l’éclairage dans les films, définissez une cadence égale à ou la moitié d’une fréquence électrique et utiliser un plus long temps d’exposition. Aussi, gardez la touche lumière LED recouverte d’une planche acrylique translucide comme indiqué au point 2.1.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après la période d’ajustement décrite à l’étape 2.1.4, démarrer l’enregistrement vidéo et le test comportemental.<ol>
<li>Transférer les cibles de plaque B à plaque A avec une pipette Pasteur. Si l’expérience est sensible aux composants chimiques dans le milieu, changer des pipettes pour chaque paire d’essai. Remarque : Lors du pipetage un animal de la plaque B, ne pas chasser il dans l’eau avec une pipette Pasteur comme perturbation de l’eau peut stimuler l’animal et obtenir son mouvement excessif. Tenez une extrémité de la pipette légèrement au-dessus de la surface de l’eau et attendez que la personne à venir sous la pointe. Pipetez doucement vers le haut avec une petite quantité d’eau de mer artificielle et puis l’éjecter dans un puits sur la plaque d’a.</li>
		<li>Selon un plan d’expérience, permettent un mâle et une cible d’interagir dans chaque puits pour une période souhaitée du temps d’observation (par exemple 10 minutes) après le transfert.</li>
		<li>Arrêter l’enregistrement vidéo après l’heure de l’observation. Si nécessaire, télécharger les films enregistrés de l’appareil à un ordinateur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Manuel analyse des propriétés comportementales
<ol><li>Examiner le film pour le moment, quand chaque cible a été transféré dans le puits sur plaque d’a.</li>
	<li>Examiner l’initiation et le moment de la cessation des événements d’intérêt et de calculer la durée, temps de latence et la fréquence des événements.<ol>
<li>Définir début de tentative de garde par un mâle comme point de contact de l’antenne du mâle avec toute partie du corps de la cible (Figure 10, en haut à gauche). Le contact antennaire est souvent précédé d’une swift (< 0,5 s) courir ou bondir.</li>
		<li>Définir résiliation de tentative de garde comme un point lorsque les deux antennes du mâle se détachent du corps d’une cible (Figure 10, coin supérieur droit). Calculer la fréquence de se prémunir des tentatives comme : <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58378/58378eq1.jpg">
</li>
		<li>Initiation de la copulation pour définir une courbure dorsale d’un mâle qui est suivie d’une presse répétitive d’un urosome contre celui de la femelle (Figure 10, bas à droite). Fréquence de la push est plusieurs fois par seconde. Remarque : Un mâle garde rampe jusqu'à l’extrémité caudale du corps de la femelle avant la copulation (Figure 10, en bas à gauche).</li>
		<li>Define cessation de la copulation par détachement de l’urosomes après les événements décrits dans 3.2.4. Remarque : Copulation a généralement lieu pendant plusieurs minutes dans le cas de T. californicus et T. japonicus.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. deux dimensions suivi des individus et des couples
<ol><li>Générer un clip vidéo mettant en vedette un épisode d’intérêt (par exemple les 3 premiers s d’une tentative de garde) en taillant le film enregistré à l’étape 2 avec le logiciel de montage de film.</li>
	<li>Installer ImageJ14 à partir de : https://imagej.nih.gov/ij/download.html. Ensuite, téléchargez MTrackJ, un plugin de motion-tracking pour ImageJ15, en suivant les instructions sur : https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/.</li>
	<li>Ouvrez ImageJ et importer un film d’intérêt (par exemple, fichier > Importer > à l’aide de QuickTime ; choisissez « Convertir 8 bits en niveaux de gris » pour réduire la mémoire requise pour le traitement de l’image).</li>
	<li>Procéder au calage spatial et temporelle.<ol>
<li>Sélectionnez l’outil de sélection de ligne droite dans la fenêtre de ImageJ pour calibration spatiale.</li>
		<li>Tracer une ligne de sélection le long d’un objet avec une longueur connue (par exemple le diamètre d’un puits) dans la fenêtre film.</li>
		<li>Ouvrez le menu « Set Scale » (Analyze > échelle définie). Entrez la longueur connue dans la boîte de « Distance connue » et de son appareil (p. ex. mm) dans la boîte de « Unité de longueur ». Cochez la case « Global » pour utiliser l’échelle pour les autres clips vidéo.</li>
		<li>Ouvrez le menu « Propriétés » (Image > Propriétés) pour l’étalonnage de l’heure. Entrez intervalle de trame (inverse de la fréquence d’images) dans la zone « Intervalle de trame ».</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configurer le suivi avec MTrackJ.<ol>
<li>Ouvrez le plugin MTrackJ de Plugins > MtrackJ sur ImageJ. Cliquez sur le bouton « Tracking » dans la fenêtre de dialogue de MTrackJ pour ouvrir un suivi le menu de configuration.</li>
		<li>Définir un intervalle de suivi en cochant « Déplacer vers le prochain index de temps après l’ajout de point » et en entrant un nombre dans la zone « Temps étape taille » dans la fenêtre de dialogue de configuration. Pour effectuer le suivi de l’image par image, inscrivez « 1 » dans la zone « Taille d’étape de temps ».</li>
		<li>Cochez « Apply local cursor claquer lors du suivi » et choisissez « Centroïde sombre » comme un élément de composant logiciel enfichable. Cette option permet une détection automatique du centre de gravité d’un objet sombre (c'est-à-dire, une personne ou un couple) dans un carré de détection (« plage de composant logiciel enfichable ») autour d’un curseur. Choisissez une taille de la place pour couvrir un entier pair ou l’animal dans le film (par exemple 31 x 31 pixels).</li>
		<li>Cliquez sur « OK » pour appliquer les options choisies.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer le suivi des deux dimensions.<ol>
<li>Cliquez sur le bouton « Ajouter » dans la fenêtre de dialogue MTrackJ pour commencer le suivi.</li>
		<li>Placer un curseur (place de détection) pour couvrir une paire ou un individu à être l’objet d’un suivi. Cliquez ici pour détecter le centroïde sombre de l’objet dans le carré.</li>
		<li>Répétez l’étape 4.6.2 une quantité désirée de trames.</li>
		<li>Pour générer des tables de données, cliquez sur « Mesure » dans la fenêtre de dialogue de MTrackJ. Les données sont affichées dans deux fenêtres : fenêtre « MTrackJ : Tracks » présente un état récapitulatif de la trajectoire de deux dimensions sur chenilles et « MTrackJ : Points » présente des données détaillées pour chaque point dans le temps. Pour enregistrer chaque tableau, choisissez Fichier > Enregistrer sous... menu sur ImageJ. Remarque : Reportez-vous au manuel en ligne fourni par le développeur (https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/) pour obtenir une description de chaque colonne de données.</li>
		<li>Pour générer un film avec une trajectoire de chenilles dessinée comme une ligne colorée, cliquez sur le bouton « Movie » dans la fenêtre de dialogue de MTrackJ. Pour enregistrer le film généré, choisissez Fichier > Enregistrer sous... menu sur ImageJ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enregistrez le résultat complet. Cliquez sur le bouton « Enregistrer » dans la fenêtre de dialogue MTrackJ pour enregistrer les résultats, y compris les données (étape 4.6.4) et la trajectoire de deux dimensions sur chenilles (points 4.6.2 et 4.6.3).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chullasorn, S., Dahms, H. U., Klangsin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+species+of+Tigriopus+(Copepoda:+Harpacticoida:+Harpacticidae)+from+Thailand+with+a+key+to+the+species+of+the+genus.">A new species of Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida: Harpacticidae) from Thailand with a key to the species of the genus.</a> Journal of Natural History. 47 (5-12), 427-447 (2013).</li><li>Fraser, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occurrence,+ecology+and+life+history+of+Tigriopus+fulvus+(Fischer).">The occurrence, ecology and life history of Tigriopus fulvus (Fischer).</a> Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 20 (3), 523-536 (1936).</li><li>Burton, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+system+of+the+intertidal+copepod+Tigriopus+californicus.">Mating system of the intertidal copepod Tigriopus californicus.</a> Marine Biology. 86 (3), 247-252 (1985).</li><li>Lazzaretto, I., Salvato, B., Libertini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+chemical+signaling+in+Tigriopus+fulvus+(copepoda,+harpacticoida).">Evidence of chemical signaling in Tigriopus fulvus (copepoda, harpacticoida).</a> Crustaceana. 59 (2), 171-179 (1990).</li><li>Tsuboko-Ishii, S., Burton, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+abundance+and+population+flux+of+Tigriopus+californicus+(Copepoda+:+Harpacticoida)+in+Barkley+Sound,+British+Columbia.">Seasonal abundance and population flux of Tigriopus californicus (Copepoda : Harpacticoida) in Barkley Sound, British Columbia.</a> Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 78 (2), 467-481 (1998).</li><li>Lard, M., Backman, J., Yakovleva, M., Danielsson, B., Hansson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+small+with+the+smallest+-+Using+nanotechnology+in+tracking+zooplankton.">Tracking the small with the smallest - Using nanotechnology in tracking zooplankton.</a> PLoS ONE. 5 (10), e13516 (2010).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Culture individuelle et la détermination du stade et le sexe
Ici, nous avons décrit la méthode utilisée dans notre précédente étude5 pour préparer la Vierge Tigriopus animaux avec leur expérience de jumelage contrôlée tout en poursuivant leur développement (Figure 4 et Figure 7). Comme les espèces de Tigriopus sont utilisés comme animaux de modèle dans différents domaines biologiques comme la toxicologie16,18, physiologie écologique19,20,21et évolutifs génétique,13,22,23,24, cette méthode a un potentiel de fournir un moyen précieux pour évaluer l’influence de facteurs environnementaux et génétiques sur le cycle de vie de ces copépodes.
Pour réaliser une organisation réussie, la recherche régulière et collection de CI copépodites d’une culture de masse (étape 1.2) sont essentiel, car la collection à un stade ultérieur peut-être entraîner de mauvaise mise en scène des animaux. En outre, une recherche approfondie pour exuvies (étape 1.3) est également essentielle pour la mise en scène précise. Augmenter la fréquence de collecte et mise en scène si nécessaire, étant donné que l’intervalle entre les mues varie d’un à plusieurs jours selon l’espèce et à l’élevage condition2,25,26. Différences dans la morphologie des antennes entre les copépodites et les femelles adultes ne sont pas visiblement significatifs dans certaines espèces et populations de Tigriopus16,25. Mise en scène avant le sexage est donc utile de distinguer les femelles adultes de copépodites avancées des deux sexes.
Tests comportementaux et l’analyse manuelle des propriétés comportementales
En règle générale, une des parties plus critiques des études éthologiques est définition et description des événements d’intérêt. Les méthodes présentées dans cet article ont d’abord mis au point pour notre récente étude5 et complétée par la description de la copulation et les aides visuelles (Figure 10). En plus de cela, cohérence dans la gestion des animale joue également un rôle important dans les expériences comportementales. Par exemple, un rinçage de copépodes peut potentiellement faciliter certains aspects de leur comportement (la Figure 1) et est par conséquent souhaitable d’être interprété d’une manière cohérente entre les échantillons, tels que normalisé à l’étape 2.1.3. Nous prévoyons que la documentation fournie dans ce document aidera les études contrôlées et reproductibles sur le comportement de mate-gardiennage de Tigriopus, promotion de la reproduction et les études écologiques de cet habitant abondant des bassins de marée haute.
Une des limites possibles avec cette méthode est faible grossissement des images obtenues. Bien que les films enregistrés avec notre système de permettent l’identification de structures éminent organisme y compris urosomes et male premières antennes, un peut ne pas pouvoir observer plus subtile de structures telles que les jambes et les organes génitaux avec notre méthode, car il n’emploie pas grossissement microscopique pour l’enregistrement vidéo. Alors que Kelly et coll. ont signalé qu’ils étaient en mesure d’observer le spermatophore transférer des mâles aux femelles de T. japonicus sous une observation microscopique au grossissement X 100 (aucune vidéo enregistrée)7, nous n’avons pas été en mesure d’observer un spermatophore dans nos films, peut-être en raison de la limitation de la résolution de l’image.
Deux dimensions suivi de paires
Bien que cette méthode ne permet pas de suivi en trois dimensions des animaux, il permet l’analyse de la trajectoire bidimensionnelle du zooplancton sans étiquetage chimiquement animaux (cf. Saindoux et al. 201027) en utilisant des programmes distribués gratuitement. Si la taille d’un fichier de film est trop volumineuse pour être transformés en ImageJ, on peut réduire la résolution du fichier et le convertir en un film d’échelle de gris. Tandis que la méthode décrite a été initialement développée pour les couples d’adultes de T. californicus (Figure 12 et Figure 13), il est également disponible pour adultes-jeunes couples et célibataires (la Figure 1) comme ainsi que d’autres espèces de Tigriopus en principe. Nous attendons encore la méthode est l’analyse de la trajectoire applicables à court terme (à partir de la milliseconde pour les échelles de temps seconde) du zooplancton d’autres taxons les rajustements nécessaires.

Intertidales copépodes du genre Tigriopus sont largement distribués dans les piscines intertidaux rocheux hautes à travers plusieurs continents1. Ces copépodes présentent un comportement mate-gardiennage dans le cadre de leur reproduction, où un homme adulte capture un partenaire potentiel (juvénile ou adult) utilisant ses premières antennes accrochés avant la copulation (Figure 1 et Figure 2)2 ,3,4,5. Bien que ce phénomène a fait l’objet d’études éthologiques et biochimiques pendant des décennies2,3,6,7, des procédures détaillées pour l’étude de ce comportement, y compris culture individuelle des animaux vierge et critères d’événements comportements vus dans une tentative de mate-gardiennage, n’ont pas été bien décrite. Donc, ici nous établir des méthodes pour permettre des études du comportement sous un environnement expérimental contrôlé.
Culture individuelle et la mise en scène des animaux
Des études antérieures de reproduction de Tigriopus employé conventionnellement une paire de détacher la méthode pour préparer les jeunes (copépodites) et les femelles adultes de tests comportementaux et reproduction des expériences3,8,9 ,,10. Toutefois, cette méthode permet aux animaux aux paires de la forme et éventuellement à s’accoupler avant essais (voir Ito 198811), qui peuvent altérer les propriétés comportementales des animaux5. En outre, il y a également un potentiel de méconnaître des stades de développement de copépodes avec les protocoles classiques car elles dépendent de la taille apparente pour la mise en scène. Dans cet article, nous décrivons une méthode de culture individuelle utilisée dans notre étude récente avec Tigriopus californicus5, qui a été conçu pour traiter ces restrictions en contrôlant expérience appariement des animaux et suivi leur développement de copépodite au stade adulte.
Analyse quantitative du comportement mate-gardiennage
Le comportement de mate-gardiennage de Tigriopus espèces a été étudié non seulement dans le domaine de l’éthologie2,6 , mais aussi dans d’autres domaines tels que l’écotoxicologie et de la génétique évolutive3,4, 7 , 8 , 9 , 10. Cependant, les études précédentes ont expliqué au cours de ce comportement surtout en graphie sans les illustrations visuelles suffisantes pour décrire les méthodes de l’étudier et le comportement qui crée des obstacles techniques pour la réplication et l’avancement des études. Ici, nous fournissons des descriptions détaillées de certains des principaux événements dans le comportement de mate-gardiennage de copépodes Tigriopus soutenu par des supports visuels. Nous démontrons également les équipements et les méthodes d’analyse quantitative du comportement. Ces méthodes permettent d’évaluation des propriétés comportementales des animaux au cours de tentatives de mate-gardiennage précisément les expériences répliquées.
Avec ces méthodes, nous visons à fournir une base méthodologique des études contrôlées et reproductibles sur le comportement de mate-gardiennage du genre Tigriopus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Spectrum Brands. Inc.</td>
			<td>SS1-160P</td>
			<td>For preparation of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRO PlecoWafers</td>
			<td>Tetra</td>
			<td>16447</td>
			<td>Food for copepods (used after being ground in a mortar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid</td>
			<td>Corning Co., Ltd.</td>
			<td>353224</td>
			<td>Container for culture of gravid females and hatched nauplii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 24-well cell culture plate with lid</td>
			<td>Corning Co., Ltd.</td>
			<td>353226</td>
			<td>Container for individual culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 48-well cell culture plate with lid</td>
			<td>Nest Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>748001</td>
			<td>Behavioral observation chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light pad</td>
			<td>Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd.</td>
			<td>Litup LP4</td>
			<td>Backlight for behavioral observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Canon</td>
			<td>0591C003 (model: Rebel T6i)</td>
			<td>For recording of behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td>For transfer of copepods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 micropipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0735</td>
			<td>For transfer of C1 stage copepodids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.49t</td>
			<td>For semi-automatic analysis of movies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTrackJ</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.5.1</td>
			<td>ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

individual culturing of tigriopus copepods and quantitative analysis of their mate-guarding behavior

Copépodes du genre Tigriopus, qui sont commun zooplancton dans rocky marelles, montrent des comportement précopulatoire mate-gardiennage où un mâle fermoirs un partenaire potentiel pour former une paire. Alors que ce phénomène a suscité l’intérêt des chercheurs, méthodes pour son analyse n’ont pas été bien décrites. Nous décrivons ici les procédures pour : 1) individuelle mise en culture et mise en scène de Tigriopus juvéniles et adultes et analyse de leur comportement mate-gardiennage 2) sur le vidéo. La méthode de culture permet de contrôle expérimental d’éplucher l’expérience des animaux ainsi que la possibilité de suivre leur développement avant les tests comportementaux. La méthode d’analyse permet une évaluation quantitative de plusieurs aspects du comportement mate-gardiennage, y compris capturant les tentatives faites par les hommes et trajectoire de mate-gardiennage paires de natation. Bien que ces méthodes ont été créés initialement pour les études éthologiques sur Tigriopus, avec les adaptations appropriées qu’ils peuvent aussi être appliquées aux études d’autres zooplanctons dans différents domaines, comme la physiologie, toxicologie et écologique génétique.

La méthode de culture individuelle, décrite à l’étape 1 permet la préparation et mise en scène des animaux vierge sans expérience préalable de l’appariement.
Le test comportemental décrit à l’étape 2 permet d’enregistrement vidéo et l’observation du comportement des copépodes Tigriopus mate-gardiennage. L’examen suivant de la vidéo enregistrée avec les méthodes décrites aux étapes 3 et 4 permet l’analyse quantitative de certains aspects du comportement montré dans la Figure 1.
La figure 11 montre une différence dans la durée moyenne de se prémunir des tentatives entre paires de mâle-femelle et mâle-mâle paires de T. californicus. Une analyse manuelle démontré que les paires mâle relativement brèves d’appariement que les couples hommes-femmes.
Exemples de trajectoires suivies par la méthode d’analyse sont présentés dans la Figure 12 et un résultat représentatif de l’analyse de la vitesse est illustré à la Figure 13. Deux dimensions spatial suivi nouvellement formé garde paires de T. californicus a révélé que mâle paires tendent à montrer une vitesse plus élevée que les couples hommes-femmes dans les 3 premiers s de se prémunir des tentatives.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig1.jpg"> Figure 1 : Comportement de Mate-gardiennage dans Tigriopus. (A) un mâle adulte étreignant un mineur (copépodite) avec les premières antennes (indiqués par les flèches bleues). Bar = 1 mm. (B) un aperçu du comportement mate-gardiennage. Un homme tente de capturer un individu cible (à gauche) et forme une paire avec elle (au milieu). En mâle et quelques paires de mâle-femelle, une tentative de garde se termine sans copulation. De Tsuboko-Ishii et Burton 20175, ce chiffre a été modifié. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig2.jpg"> Figure 2 : Étapes du développement de Tigriopus. Tigriopus espèces subissent généralement six stades nauplius (à partir de NI à NVI), cinq stades copépodites (à partir de CI au CV) et un stade adulte (CVI)16. Les hommes font des efforts garde aux mineurs dès les premiers stades de copépodites (CI T. japonicus et T. fulvus6,17 ) et CII dans T. californicus3, ainsi qu’aux adultes des deux sexes5 . De Tsuboko-Ishii et Burton 20175, ce chiffre a été modifié. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig3.jpg"> Figure 3 : La morphologie des adultes (T. californicus). (A) adulte de sexe masculin. Femelle adulte (B) . (C) femelle gravide adulte avec un sac d’oeufs avec des oeufs fécondés et développés (orange clair). (D) adulte femelle gravide avec un sac d’oeufs non fécondés ou non aménagés (vert foncé) oeufs. Les flèches indiquent les ovisacs. Bar = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig4.jpg"> Figure 4 : schéma de préparation pour la culture individuelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig5.jpg"> Figure 5 : mué exuvies. (A) exuvies de CI aux étapes de CV d’un seul animal de T. californicus. Bar = 1 mm. B exuvies de CI au CV met en scène dans une culture individuelle bien. Des débris blancs sont les excréments d’un animal cultivé dans le puits (non montré dans l’image). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig6.jpg"> Figure 6 : recherche d’exuvies sous un stéréomicroscope. Barres = 1 mm. (A) changement de focale d’un stéréomicroscope pour la détection des exuvies à différentes profondeurs. Magenta flèches indiquent les exuvies ciblée et flèches grises indiquent des exuvies floues. Image du haut met l’accent sur les exuvies de gauche, qui est engloutie au fond du puits. Image de fond se concentre sur les exuvies de droite, qui est flottant sous la surface moyenne. (B) image du haut montre un exemple d’obstruction de l’examen de débris flottant à la surface moyenne. Une flèche verte indique une exuvies caché sous les débris. Image du bas montre un résultat de nettoyage avec un petit morceau de papier absorbant. Un exuvies (indiqué par une flèche verte) est visible après le nettoyage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig7.jpg"> Figure 7 : mise en scène et détermination du sexe des animaux. Exemples de la façon de marquer le nombre d’exuvies et le sexe des animaux sur un couvercle d’une plaque de culture. (A) un exemple pour un puits contenant cinq exuvies et un animal adulte. Le nombre des lignes de la marque de pointage sur le couvercle représente le nombre des exuvies retrouvé dans le puits. Lorsque le nombre des exuvies atteint cinq, le sexe de l’animal peut être déterminé basé sur la morphologie des antennes (voir aussi la Figure 3). (B) un exemple d’un couvercle marqué d’une plaque de culture. Premières lignes contiennent les animaux plus âgés (CIV à adulte) et lignes de fond contiennent plus jeunes (c.-à-d., nouvellement recueillies) animaux (CI à CIII). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig8.jpg"> Figure 8 : schéma provisoire de test comportemental. Programme d’installation pour l’enregistrement vidéo du comportement de mate-gardiennage (à gauche) et les grandes lignes du test comportemental (à droite). De Tsuboko-Ishii et Burton 20175, ce chiffre a été modifié. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig8large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig9.jpg"> Figure 9 : rinçage des animaux avant un test comportemental. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig9large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig10.jpg"> Figure 10 : définition des événements examinés dans l’analyse manuelle. Illustrations des événements observés en ce qui concerne la tentative de mate-gardiennage. Les noms des événements définis et analysés à l’étape 3 sont mises en évidence. Événements enfermés dans une ligne en pointillés ne sont pas observables dans quelques tentatives mate-gardiennage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig10large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig11.jpg"> Figure 11 : Différence en gardant la durée entre les paires de mâle-femelle et mâle-mâle paires de T. californicus. Chaque symbole triangle représente les données d’une paire de testé. Bars et moustaches représentent respectivement médianes et intervalle interquartile. Durée moyenne de capture était plus élevée chez les couples hommes-femmes (hommes et femmes (n = 22), mâle-mâle (n = 29) ; **p < 0,01 par test U de Mann-Whitney). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig11large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig12.jpg"> Figure 12 : trajectoires de couples dans les trois premières secondes de se prémunir des tentatives de. Exemples de chenilles trajectoires bidimensionnelles des paires mâle-femelle (à gauche) et les couples de mâle-mâle (à droite) de T. californicus. Les points sur les trajectoires représentent des points dans le temps (30 images par seconde). Barres de = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig12large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig13.jpg"> Figure 13 : Différence de vitesse moyenne après le début du gardiennage entre paires de mâle-femelle et mâle-mâle paires de T. californicus. Chaque symbole triangle représente les données d’une paire de testé. Bars et moustaches représentent respectivement médianes et intervalle interquartile. Moyenne de vitesse de la paire dans les 3 premiers s de se prémunir des tentatives était supérieure chez les couples de mâle-mâle (mâle-femelle (n = 13), mâle-mâle (n = 35). ***p < 0,001 par test U de Mann-Whitney). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig13large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Suppl Figure 1" src="/files/ftp_upload/58378/58378sfig1.jpg"> Supplemental Figure 1 : Effet du traitement de rinçage sur le comportement des Tigriopus. Chaque symbole de cercle ou triangle représente les données d’un individu testé ou paire. Bars et moustaches représentent respectivement médianes et intervalle interquartile. Individus en « rincé » et « pas rincé » groupes étaient traitées de la même façon, sauf que le groupe « pas rincé » n’ont pas subi le traitement de rinçage (étape 2.1.3) avant l’heure réglage de 30 minutes (étape 2.1.4). (A) la vitesse moyenne des mâles rincés ont tendance à être supérieure à celle des mâles non rincés (rincés (n = 6), non rincés (n = 6), n.s. : aucune différence significative n’a été détecté par U de Mann-Whitney tester). La vitesse a été mesurée pendant 30 s issu des vidéos enregistrées après le temps de réglage. (B) vitesse moyenne des femelles rincées ont tendance à être plus grande que celle des femelles non rincées (rincés (n = 6), non rincés (n = 6), n.s. : aucune différence significative n’a été détecté par U de Mann-Whitney tester). La vitesse a été mesurée pendant 30 s issu des vidéos enregistrées après le temps de réglage, après l’étape 4 (intervalle de suivi = 0,5 s). (C) la fréquence de se prémunir des tentatives était plus grande pour les paires d’individus rincés (rincés (n = 6), non rincés (n = 6). ** p < 0,01 par test U de Mann-Whitney). (D) durée de se prémunir des tentatives avaient tendance à être plus élevé pour les paires d’individus rincés (rincés (n = 6), non rincés (n = 6), n.s. : aucune différence significative n’a été détecté par U de Mann-Whitney tester). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378sfig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior

Culture individuelle de Tigriopus copépodes et analyse Quantitative de leur comportement Mate-gardiennage

Mate-gardiennage comportement joue un rôle important dans la reproduction des copépodes intertidales du genre Tigriopus. Cependant, les méthodes pour l’étude de ce comportement n’ont pas été bien décrites. Nous décrivons ici les méthodes pour : culture 1) individuelle des animaux de Tigriopus vierge et 2) l’analyse quantitative de leur comportement mate-gardiennage.

Copepods of the genus Tigriopus, which are common zooplankton in rocky tide pools, show precopulatory mate-guarding behavior where a male clasps a ...

Le principal avantage de cette technique de culture est que vous pouvez obtenir des copépodes vierges tout en contrôlant leur expérience d’appariement et en suivant leur développement. La méthode d’analyse du comportement suivante peut aider à des expériences contrôlées et reproductibles sur le comportement de garde du maté des copépodes Tigriopus qui sont des zooplanctons communs dans les bassins de marées rocheuses. Bien que ces méthodes puissent fournir un aperçu du comportement reproducteur de Tigriopus, elles peuvent également être utilisées pour examiner comment les facteurs génétiques et environnementaux influent sur la physiologie et le comportement de ces copépodes.Pour commencer, utilisez une pipette Pasteur pour recueillir des femelles gravid portant des œufs d’orange clairs de la culture des stocks. Rincer les femelles à l’aide d’un milieu de culture propre au moyen d’un tuyautage doux. Ensuite, placez chaque femelle dans un puits individuel d’une plaque de culture cellulaire à six puits avec un milieu de culture propre.Ensuite, placez la plaque dans un incubateur pour la culture des femelles jusqu’à ce qu’elles libèrent des sacs d’oeufs. Après la libération des sacs d’œufs, utiliser une pipette Pasteur pour retirer les femelles des puits de l’assiette. Dès que les animaux au premier stade copépodide ou CI commencent à émerger, utilisez une micropipette P-10 pour les recueillir.Tous les deux ou trois jours, surveillez les puits à la recherche d’exuviae en fusion. Après cela, le sexe des animaux en examinant leur morphologie antenne. Pour identifier correctement les femelles adultes, assurez-vous qu’elles ont déjà fondu cinq exuviae dans les puits de culture parce que les différences de forme des antennes entre les femelles adultes et les juvéniles ne sont pas visiblement significatives dans certaines populations.Après avoir sélectionné des animaux du stade approprié et du sexe, nourrissez les individus sélectionnés avec de la nourriture finement moulue pour les poissons. Pendant que les animaux mangent, préparez deux plaques de culture cellulaires plates de 48 puits comme chambres d’essai. Après 30 minutes, rincer chaque animal en le pipetting dans une succession de quatre puits d’une plaque de 24 puits rempli d’eau de mer artificielle propre.Placez ensuite les individus rincés dans les puits des plaques A et B sur le coussin lumineux LED. Laissez les animaux s’acclimater pendant 30 minutes, puis utilisez une pipette Pasteur pour transférer les cibles de la plaque B à la plaque A.Laissez un mâle et une cible interagir dans chaque puits pendant le temps d’observation désigné avant d’arrêter l’enregistrement vidéo. Tout d’abord, examinez la vidéo pour le moment où chaque cible a été transférée dans un puits sur la plaque A.Next, définissez l’initiation d’une tentative de garde par un mâle comme un contact de l’antenne du mâle avec n’importe quelle partie du corps de la cible.Définissez la fin de la tentative de garde par un mâle comme le point où l’antenne du mâle se détache du corps de la cible. Ensuite, définir l’initiation de la copulation par un pli du corps dorsal d’un mâle, suivie d’une presse répétitive de l’urosome contre celle de la femelle. Tout d’abord, générer un clip vidéo mettant en vedette l’épisode d’intérêt en coupant le film avec un logiciel de montage de films.Ensuite, ouvrez ImageJ et importez le clip vidéo. Sélectionnez l’option secrète à échelle grise 8 bits pour réduire la mémoire requise pour le traitement de l’image. Ensuite, sélectionnez l’outil de sélection en ligne droite pour l’étalonnage spacial et tracez une ligne de sélection le long du diamètre du puits.Ouvrez le menu de l’échelle définie et entrez la longueur connue dans la boîte de distance connue et l’unité dans l’unité de la boîte de longueur. Après cela, ouvrez le menu propriétés et entrez l’intervalle de trame dans la boîte d’intervalle d’image. Ouvrez le plugin MTrackJ en sélectionnant les plugins et MtrackJ.Ensuite, cliquez sur le bouton de suivi dans la fenêtre de dialogue pour ouvrir le menu de configuration de suivi. Vérifiez appliquer curseur local claquer pendant la piste et sélectionnez centroïde foncé comme une fonctionnalité snap. Ensuite, cliquez sur le bouton ajouter dans la fenêtre de dialogue MTrackJ pour commencer le suivi.Placez un curseur pour couvrir les personnes dans le clip vidéo à suivre. Ensuite, cliquez pour détecter le centroïde foncé de l’objet dans le carré. Pour générer la table de données, cliquez sur la table de mesure dans la fenêtre de dialogue MTrackJ, puis cliquez sur le bouton film pour générer un film avec la trajectoire suivie tracée comme une ligne colorée.Enfin, cliquez sur le bouton enregistrer dans la fenêtre de dialogue MTrackJ pour enregistrer les résultats, y compris les données dans la trajectoire bidimensionnelle suivie. Dans cette expérience, le comportement de mate-guarding des copépodes de Tigriopus a été enregistré et observé. L’analyse montre une différence dans la durée moyenne des tentatives de garde entre les couples hommes-femmes et les couples hommes-hommes de Tigriopus californicus où les mâles des couples hommes-hommes présentaient une durée relativement plus courte des tentatives que celles des couples hommes-femmes.Le suivi spatial en deux dimensions des paires de garde nouvellement formées de Tigriopus californicus a révélé que les couples mâles-mâles avaient tendance à montrer une vitesse plus élevée que les paires hommes-femmes dans les trois premières secondes des tentatives de garde. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans les domaines de l’éthologie, de la biochimie et de la génétique évolutive afin d’explorer le système d’accouplement unique de ce type de copépodes.

Research

JoVE Journal

Environment

Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior

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Recherche

Environnement

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There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a ...

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