Name: individual culturing of tigriopus copepods and quantitative analysis of their mate-guarding behavior
Uploaded: 2018-09-26T14:30:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior at JoVE.com

Questo lavoro è sostenuto da sovvenzioni dalla Sumitomo Foundation, Giappone (grant Grant per progetti di ricerca di base scienza, numero: 150932) e Istituto di ricerca di invertebrati marini, Giappone (assegno di ricerca individuali 2018) a STI RSB e una concessione dagli Stati Uniti National Science Foundation (DEB-1556466) di RSB. Ringraziamo la signora Kiana Michelle Woodward per feedback sul metodo di coltura e gestione temporanea.

1. preparazione degli animali vergini per l'osservazione del comportamento
<ol><li>Ottenere le uova fecondate e permettere loro a covare.<ol>
<li>Raccogliere le femmine gravide che trasportano le uova arancione chiaro (cioè, fecondato e in fase avanzata di sviluppo) (Figura 3) da una cultura d'archivio con una pipetta Pasteur. Sciacquare le femmine pipettando delicatamente nel terreno di coltura pulito per evitare il trasferimento di altri animali, tra cui nauplial larve che possono hanno covato nella cultura. Nota: In questo protocollo, acqua di mare artificiale con una salinità del 35% è usato come terreno di coltura. Utilizzare diverso media (ad es. acqua marina artificiale con una salinità superiore o un'ulteriore soluto) a seconda dello scopo di un esperimento. Nota: Vedere Barreto et al 201512 per un metodo per la costituzione delle scorte di laboratorio cultura e Pereira et al 201613 per esempi di siti di raccolta delle popolazioni naturali di T. californicus. Peterson et al ha anche segnalato i loro siti di raccolta di T. californicus, fulvus T.e T. japonicus con latitudine e Longitudine informazioni9. Utilizzare pipette di plastica con una capacità di circa 30-50 mL per raccogliere Tigriopus copepodi da piscine di roccia.</li>
		<li>Posizionare ogni donna individualmente in un pozzetto di una piastra di coltura delle cellule 6-pozzetti con terreno di coltura pulita (Figura 4, sinistra). Assicurarsi che nessun altro animale (tra cui nauplial della larva) è contaminando il pozzo.</li>
		<li>Mantenere le piastre in un'incubatrice impostata a 20 ° C con un ciclo luce-buio di 12 ore alla cultura le femmine fino a quando rilasciano sacche di uova. Questo passaggio richiede generalmente da uno a dieci giorni a seconda della specie e stadi di sviluppo degli embrioni. Nel frattempo, nutrire ogni femmina gravid due volte a settimana con due grani di cibo per pesci finemente terra (circa < 0,5 millimetri di diametro) (Vedi Tabella materiali per dettagli). Nota: Utilizzare diverse temperature e cicli di luce a seconda dello scopo di un esperimento. Temperature più elevate possono facilitare più rapido sviluppo degli embrioni. Nota: Evitare di lasciare cibo in eccesso in decomposizione a wells. Se i residui di cibo comincia a decadere, pipettare fuori pozzi con una pipetta Pasteur.</li>
		<li>Dopo il rilascio di sacche di uova, è possibile rimuovere le femmine dei pozzi di cultura con una pipetta Pasteur. Nota: Inseminate femmine sono in grado di deposizione delle uova frizioni multiple di prole2,3. Se necessario, è possibile trasferire le femmine in altri pozzi per raccogliere ulteriori frizioni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccogliere copepodids per cultura individuale.<ol>
<li>Tenere le piastre con dei nauplii nell'incubatrice e cultura i naupli di Artemia, fino a quando non si sviluppano al primo stadio copepodid (CI) (Figura 4, medio). Questo passaggio richiede generalmente da una a due settimane. Ogni alimentazione bene con parecchi grani di macinato finemente pesce cibo durante la ricerca per gli animali CI una volta ogni due giorni. Riempire di acqua evaporata allevamento con acqua distillata. Nota: Se detriti galleggianti ostruiscono la vista, Rasante con un piccolo pezzo di carta assorbente.</li>
		<li>Non appena CI animali iniziano ad emergere, raccoglierli dai pozzetti con una micropipetta di P-10 con il relativo volume di pipettaggio fissato a circa 8 µ l, sotto un microscopio stereoscopico a 10x di ingrandimento 40x (Figura 4, destra). Lavare ogni animale CI pipettando delicatamente in acqua di mare pulita artificiale e posizionarlo in un pozzetto della piastra di coltura cellulare 24 pozzetti contenenti 2-3 mm di profondità (circa 400-600 µ l) di acqua di mare artificiale. Nota: Evitare di trasportare più di esuvie nauplial o altri animali nei pozzetti per cultura individuale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Traccia lo sviluppo degli individui contando molted esuvie.<ol>
<li>Esaminare all'interno di ciascun pozzetto per standard esuvie ogni due o tre giorni (se necessario, regolare la frequenza) di stereomicroscopia osservazione sotto un'illuminazione del campo scuro a 10x di ingrandimento 40x. Esuvie di copepodids sono trasparenti e riconoscibile con setole gambe, un paio di rami caudale (cioè, sottile sporgenti strutture verso l'estremità caudale), e/o segmentazione del Prosoma e urosome (Figura 5). Cambiare messa a fuoco e illuminazione per rilevare esuvie a diverse profondità in un pozzo (Figura 6A). Nota: Standard esuvie sono più piccoli dell'animale che ha molted li. Inizio esame dall'ingrandimento minore per un animale relativamente recente esuvie e MAIUSC a maggiore ingrandimento per anziani esuvie (cioè, più piccolo). Nota: Se sono danneggiati esuvie in un pozzo, eliminare il pozzo ulteriore follow-up inerente allo sviluppo per evitare l'errore di valutazione delle fasi di sviluppo. Nota: Se detriti galleggianti ostruiscono la vista (Figura 6B), Rasante con un piccolo pezzo di carta assorbente.</li>
		<li>Registrare un numero totale di esuvie copepodid in ciascun pozzetto con un marchio tally sul coperchio piastra (Figura 7). Aggiungere una riga al contrassegno come un nuovo esuvie è trovato nel pozzo. Nota: Se ci sono nauplial esuvie contaminato nel pozzo, eliminarli dal conteggio.</li>
		<li>Alimentare di ogni individuo con due grani di macinato finemente cibo per pesci. Riempire di acqua evaporata allevamento con acqua distillata per mantenere la salinità. Nota: Feed copepodids ogni due o tre giorni per impedire loro di consumare e danneggiando esuvie standard, che potrebbe potenzialmente influenzare la stima della fase inerente allo sviluppo (punto 1.3.4).</li>
		<li>Stimare la fase dello sviluppo dell'animale dipenda dal numero delle esuvie. Se non c'è nessun esuvie, l'individuo è stimata in fase di CI. Se ci sono da uno a quattro esuvie, l'individuo è stimato a CII alle fasi di CV. Se ci sono cinque esuvie, l'individuo è stimata in un adulto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identificare il sesso degli adulti sulla base della morfologia.<ol>
<li>Sesso animali esaminando la loro morfologia. I maschi adulti di Tigriopus possiedono antenne genicolate prime con strutture uncinate e globulare all'estremità distale (Figura 3A). Le femmine adulte possiedono antenne più liscia e relativamente più sottile prime (Figura 3B) rispetto a quelli dei maschi. Alcune femmine esibiscono anche di colore verde scuro da gonadica lipidica nei loro corpi (Figura 3B, 3D).</li>
		<li>Contrassegnare il sesso sul coperchio del pozzo (figura 7B).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. comportamentali Test e registrazione Video del comportamento Mate-guardia
<ol><li>Una giornata di test, selezionare animali di sesso per un test comportamento e fase desiderata.<ol>
<li>Nutrire gli individui selezionati nei pozzi di cultura con finemente terra pesce cibo e consentire loro di mangiare per 30 minuti. Nel frattempo, passare al punto 2.1.2 per preparare test chambers.</li>
		<li>Preparare due piastre per colture cellulari fondo piatto 48 pozzetti come test chambers; una piastra (di seguito denominata "piastra A") è per i maschi e l'altra ("piastra B") è per obiettivi (ad es. copepodids, le femmine adulte, i maschi adulti). Aggiungere 400 µ l di acqua di mare pulita artificiale con una salinità del 35% nei pozzetti delle piastre. Posizionare le piastre su un rilievo di luce LED coperto con un bordo acrilico traslucido come un diffusore di luce (Figura 8). Nota: Utilizzare supporto diverso a seconda di uno scopo di un esperimento. Nota: Per evitare il calore in eccesso, non utilizzare lampade ad incandescenza o fluorescenza come una retroilluminazione.</li>
		<li>Dopo il tempo di alimentazione 30-min descritto al punto 2.1.1, sciacquare ogni animale pipettando delicatamente in una successione di quattro pozzetti di una piastra a 24 pozzetti con acqua di mare pulita artificiale (Figura 9) per evitare il riporto dei detriti ed esuvie dai pozzi di cultura.</li>
		<li>Posizionare gli individui risciacquati in pozzetti di piastre A e B sul pad di luce LED. Attendere 30 minuti per la regolazione degli animali ai pozzetti.</li>
		<li>Impostare una videocamera sopra la piastra A durante il periodo di regolazione (Figura 8). Utilizzare un treppiede o un supporto per tenere la fotocamera.</li>
		<li>Mettere a fuoco la fotocamera sui maschi all'interno della piastra A per permettere un'osservazione delle antenne. Nota: Per ridurre lo sfarfallio della retroilluminazione in film, impostare una frequenza fotogrammi pari a o la metà di una frequenza elettrica e utilizzare un tempo di esposizione. Inoltre, mantenere il tampone di luce LED coperto con un bordo acrilico traslucido come descritto al punto 2.1.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo il periodo di adattamento al punto 2.1.4, avviare la registrazione video e test comportamentali.<ol>
<li>Trasferire gli obiettivi dalla piastra B alla piastra A con una pipetta Pasteur. Se l'esperimento è sensibile ai componenti chimici in mezzo, cambiare pipette per ogni coppia di test. Nota: Quando si pipetta un animale dalla piastra B, non inseguono in acqua con una pipetta Pasteur come dispersione di acqua può stimolare l'animale e suscitare il suo movimento in eccesso. Tenere un puntale della pipetta leggermente di sopra della superficie dell'acqua e attendere che l'individuo a venire sotto la punta. Delicatamente Pipettare fino con una piccola quantità di acqua di mare artificiale e poi espellerla in un pozzo sulla piastra A.</li>
		<li>Secondo un piano sperimentale, consentire un maschio e una destinazione di interagire in ogni pozzetto per un periodo di tempo di osservazione (ad es. 10 minuti) desiderato dopo il trasferimento.</li>
		<li>Interrompere la registrazione video dopo il tempo di osservazione. Se necessario, è possibile scaricare i filmati registrati dalla fotocamera a un computer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. manuale analisi delle proprietà comportamentali
<ol><li>Esaminare il film per i tempi quando ogni destinazione è stato trasferito nel pozzo sulla piastra A.</li>
	<li>Esaminare l'inizio e la tempistica di terminazione di eventi di interesse e calcolare la durata, la latenza e la frequenza degli eventi.<ol>
<li>Definire l'inizio della guardia tentativo da parte di un uomo come un contatto di antenna del maschio con qualsiasi parte del corpo del bersaglio (Figura 10, in alto a sinistra). Il contatto antennale è spesso preceduto da un swift (< 0,5 s) chase o balzare.</li>
		<li>Definisce la terminazione del tentativo di guardia come un punto quando entrambe le antenne del maschio staccano dal corpo di un bersaglio (Figura 10, in alto a destra). Calcolare la frequenza di guardia tentativi come: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58378/58378eq1.jpg">
</li>
		<li>Definire l'inizio della copulazione di una curvatura dorsale del corpo di un uomo che è seguita da una pressa ripetitiva di un urosome contro quello della femmina (Figura 10, in basso a destra). Frequenza del push è diverse volte al secondo. Nota: Un uomo di guardia striscia verso l'estremità caudale del corpo di una femmina prima dell'accoppiamento (Figura 10, in basso a sinistra).</li>
		<li>Definire terminazione della copulazione di distacco della urosomes dopo gli eventi descritti in 3.2.4. Nota: Copulazione avviene generalmente per diversi minuti in caso di californicus di T. e T. japonicus.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. bidimensionale rilevamento degli individui e coppie
<ol><li>Generare un video clip con un episodio di interesse (ad es. i primi 3 s di un tentativo di guardia) tagliando il filmato registrato nel passaggio 2 con software di editing.</li>
	<li>Installare ImageJ14 da: https://imagej.nih.gov/ij/download.html. Quindi download MTrackJ, un plugin di tracciamento del movimento per ImageJ15, da seguendo le istruzioni su: https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/.</li>
	<li>Aprire ImageJ e importare un filmato di interesse (ad esempio, File > Importa > utilizzando QuickTime; scegliere "Convert 8-bit scala di grigi" per ridurre la memoria necessaria per elaborazione di immagini).</li>
	<li>Eseguire la calibrazione spaziale e tempo.<ol>
<li>Selezionate lo strumento selezione linea retto nella finestra ImageJ per calibrazione spaziale.</li>
		<li>Disegnare una linea di selezione lungo un oggetto con una lunghezza conosciuta (ad es. un pozzo di diametro) nella finestra del filmato.</li>
		<li>Aprire il menu "Imposta scala" (analisi > Imposta scala). Immettere la lunghezza nota nella casella "Nota distanza" e la sua unità (es. mm) nella casella "Unità di lunghezza". Fare clic sulla casella "Global" per utilizzare la scala per altre clip video.</li>
		<li>Aprire il menu "Proprietà" (immagine > Proprietà) per la calibrazione del tempo. Inserisci intervallo di fotogrammi (reciproco della frequenza fotogrammi) nella casella "Intervallo di fotogrammi".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configurare il rilevamento con MTrackJ.<ol>
<li>Aprire il plugin MTrackJ plug-in > MtrackJ su ImageJ. Fare clic sul pulsante "Tracking" nella finestra di dialogo MTrackJ per aprire un rilevamento menu di configurazione.</li>
		<li>Impostare un intervallo di rilevamento controllando "Passare a prossima volta indice dopo l'aggiunta di punto" e immettendo un numero nella casella "Tempo passo dimensioni" nella finestra di dialogo di configurazione. Per eseguire la verifica dei frame-by-frame, immettere "1" nella casella "Dimensione del passaggio di tempo".</li>
		<li>"Applica il cursore locale rompersi durante il tracciamento" e scegli "Centroide scuro" come una funzionalità di scatto. Questa opzione consente una rilevazione automatica del centroide di un oggetto scuro (cioè, un individuo o una coppia) all'interno di un quadrato di rilevamento ("intervallo di snap") intorno a un cursore. Scegli una dimensione della piazza per coprire un intero coppia o animale nel film (es. 31 x 31 pixel).</li>
		<li>Fare clic su "OK" per applicare le opzioni selezionate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire il rilevamento bidimensionale.<ol>
<li>Fare clic sul pulsante "Aggiungi" nella finestra di dialogo MTrackJ di avviare il rilevamento.</li>
		<li>Posizionare il cursore (Piazza di rilevazione) per coprire una coppia o un individuo deve essere rilevata. Fare clic per rilevare il centroide scuro dell'oggetto all'interno della piazza.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 4.6.2 per un numero di fotogrammi desiderati.</li>
		<li>Per generare tabelle di dati, fare clic sul pulsante di "Misura" nella finestra di dialogo MTrackJ. I dati vengono visualizzati in due finestre: finestra "MTrackJ: tracce" Mostra un riepilogo della traiettoria bidimensionale cingolato e "MTrackJ: punti" dati dettagliati per ogni punto di tempo. Per salvare ogni tabella, scegliete File > Salva con nome dal menu su ImageJ. Nota: Consultare il manuale online fornito dallo sviluppatore su (https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/) per le descrizioni di ogni colonna di dati.</li>
		<li>Per generare un filmato con una traiettoria cingolata disegnata come una linea colorata, fare clic sul pulsante "Movie" nella finestra di dialogo MTrackJ. Per salvare il filmato generato, scegliete File > Salva con nome dal menu su ImageJ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Salvare il risultato intero. Fare clic sul pulsante "Salva" nella finestra di dialogo MTrackJ per salvare i risultati, inclusi i dati (passaggio 4.6.4) e la traiettoria bidimensionale cingolata (passaggi 4.6.2 e 4.6.3).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chullasorn, S., Dahms, H. U., Klangsin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+species+of+Tigriopus+(Copepoda:+Harpacticoida:+Harpacticidae)+from+Thailand+with+a+key+to+the+species+of+the+genus.">A new species of Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida: Harpacticidae) from Thailand with a key to the species of the genus.</a> Journal of Natural History. 47 (5-12), 427-447 (2013).</li><li>Fraser, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occurrence,+ecology+and+life+history+of+Tigriopus+fulvus+(Fischer).">The occurrence, ecology and life history of Tigriopus fulvus (Fischer).</a> Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 20 (3), 523-536 (1936).</li><li>Burton, R. 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E., Leong, W., Edmands, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postzygotic+isolation+involves+strong+mitochondrial+and+sex-specific+effects+in+Tigriopus+californicus,+a+species+lacking+heteromorphic+sex+chromosomes.">Postzygotic isolation involves strong mitochondrial and sex-specific effects in Tigriopus californicus, a species lacking heteromorphic sex chromosomes.</a> Heredity. 111 (5), 391-401 (2013).</li><li>Koga, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Life+History+of+Tigriopus+japonicus+Mori+(Copepoda).">On the Life History of Tigriopus japonicus Mori (Copepoda).</a> Journal of Oceanography. 26 (1), 11-21 (1970).</li><li>Powlik, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+abundance+and+population+flux+of+Tigriopus+californicus+(Copepoda+:+Harpacticoida)+in+Barkley+Sound,+British+Columbia.">Seasonal abundance and population flux of Tigriopus californicus (Copepoda : Harpacticoida) in Barkley Sound, British Columbia.</a> Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 78 (2), 467-481 (1998).</li><li>Lard, M., Backman, J., Yakovleva, M., Danielsson, B., Hansson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+small+with+the+smallest+-+Using+nanotechnology+in+tracking+zooplankton.">Tracking the small with the smallest - Using nanotechnology in tracking zooplankton.</a> PLoS ONE. 5 (10), e13516 (2010).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Coltura individuale e la determinazione della fase e del sesso
Qui abbiamo descritto il metodo utilizzato nel nostro precedente studio5 per preparare gli animali Tigriopus vergini con la loro esperienza di accoppiamento controllato mentre si tracciano il loro sviluppo (Figura 4 e Figura 7). Come Tigriopus specie sono utilizzate come modelli animali nei vari campi biologici quali tossicologia16,18, fisiologia ecologica19,20,21ed evolutiva genetica13,22,23,24, questo metodo ha un potenziale per fornire un mezzo prezioso per valutare l'influenza di fattori ambientali e genetici sul ciclo di vita di questi copepodi.
Per ottenere successo, regolari di ricerca e raccolta di CI copepodids da una cultura di massa (punto 1.2) è fondamentale, insieme alle fasi successive può causare mis-messa in scena degli animali. Inoltre, una ricerca approfondita per esuvie (punto 1.3) è anche essenziale per un'accurata stadiazione. Aumentare la frequenza di raccolta e gestione temporanea se necessario, come l'intervallo tra le mute varia da uno a più giorni a seconda della specie e nell'allevamento di condizione2,25,26. Differenze nella morfologia di antenne tra copepodids e le femmine adulte non sono visibilmente significative in alcune specie e popolazioni di Tigriopus16,25. Quindi, messa in scena prima della determinazione del sesso è utile per distinguere le femmine adulte da avanzate copepodids di entrambi i sessi.
Test comportamentali e analisi manuale delle proprietà comportamentali
In generale, una delle parti più critiche di studi etologici è la definizione e la descrizione di eventi di interesse. I metodi introdotti in questa carta sono stati sviluppati per il nostro recente studio5 e completati con la descrizione della copulazione e gli strumenti visivi (Figura 10). In aggiunta a ciò, coerenza nella gestione degli animali svolge anche un ruolo importante negli esperimenti comportamentali. Ad esempio, risciacquo di copepodi potenzialmente può facilitare alcuni aspetti del loro comportamento (Supplemental figura 1) e pertanto è opportuno essere eseguite in modo coerente tra i campioni, come standardizzato nel punto 2.1.3. Ci aspettiamo che il materiale fornito in questo articolo verranno assisterà studi controllati e riproducibili sul comportamento mate-guardia di Tigriopus, promuovendo studi riproduttivi ed ecologici di questo abitante abbondante di alta marea piscine.
Una possibile limitazione con questo metodo è basso ingrandimento delle immagini ottenute. Anche se i filmati registrati con il nostro sistema consentono identificazione prominente delle strutture del corpo tra cui urosomes e antenne prime maschile, uno può non essere in grado di osservare strutture più sottili come gambe e genitali con il nostro metodo, poiché esso non impiegare ingrandimento al microscopio per la registrazione video. Mentre Kelly et al ha segnalato che erano in grado di osservare spermatoforo transfer da maschi per le femmine di T. japonicus sotto un'osservazione al microscopio a 100 ingrandimenti (nessun video registrato)7, non siamo stati in grado di osservare un spermatoforo nei nostri film, forse a causa della limitazione la risoluzione dell'immagine.
Tracking bidimensionale delle coppie
Anche se questo metodo non consente di rilevamento tridimensionale degli animali, consente analisi bidimensionale traiettoria di zooplancton senza etichettatura chimicamente animali (cf. Strutto et al. 201027) utilizzando programmi distribuiti gratuitamente. Se la dimensione di un file filmato è troppo grande per essere elaborato in ImageJ, uno può ridurre la risoluzione del file e convertirlo in un filmato di scala di grigi. Mentre il metodo descritto è stato originariamente sviluppato per coppie adulte di T. californicus (Figura 12 e Figura 13), è anche disponibile per adulto-giovanile coppie e singoli individui (Supplemental figura 1) come così come altre specie di Tigriopus in linea di principio. Ci aspettiamo inoltre il metodo per essere applicabili a breve termine (al millisecondo per il secondo scale temporali) traiettoria analisi dello zooplancton di altri taxa con opportuni adeguamenti.

Intertidale copepodi del genere Tigriopus sono ampiamente distribuiti nelle piscine intertidale alte rocciose attraverso diversi continenti1. Questi copepodi presentano comportamento mate-guardia come parte della loro riproduzione, dove un maschio adulto acquisisce un potenziale compagno (giovanile o adulto) che utilizzano le antenne prime agganciate prima della copula (Figura 1 e Figura 2)2 ,3,4,5. Anche se questo fenomeno è stato oggetto di studi etologici e biochimici per decenni2,3,6,7, procedure dettagliate per gli studi di questo comportamento, tra cui cultura individuale degli animali vergini e criteri degli eventi comportamentali osservati in un tentativo di mate-guardia, non sono state descritte bene. Così, qui noi stabilire metodi per attivare studi del comportamento in un ambiente sperimentale controllato.
Individuale di coltura e messa in scena di animali
Precedenti studi di riproduzione del Tigriopus impiegate convenzionalmente una coppia lo scollegamento metodo per preparare i giovani (copepodids) e le femmine adulte per test comportamentali e allevamento esperimenti3,8,9 ,10. Tuttavia, questo metodo consente agli animali di formare coppie e potenzialmente ad accoppiarsi prima del test (discusso nel 1988 Ito11), che possono alterare le proprietà di comportamento di animali5. Inoltre, c'è anche un potenziale per giudicar malee fasi inerenti allo sviluppo di copepodi con i protocolli convenzionali come fanno affidamento sulla dimensione corporea apparente per la stadiazione. In questo articolo, descriviamo un singolo metodo di coltura utilizzato nel nostro recente studio con Tigriopus californicus5, che è stato progettato per affrontare queste limitazioni di esperienza di accoppiamento degli animali di controllo e monitoraggio del loro sviluppo da copepodid a stadi adulti.
Analisi quantitativa di comportamento mate-guardia
Il comportamento delle specie Tigriopus mate-guardia è stato studiato non solo nel campo dell'etologia2,6 , ma anche in altri campi come ecotossicologia e genetica evolutiva3,4, 7 , 8 , 9 , 10. Tuttavia, gli studi precedenti hanno spiegato il corso di questo comportamento principalmente in scritti forme senza illustrazioni visive sufficienti a delineare sia il comportamento e i metodi per lo studio, che crea ostacoli tecnici per la replica e l'avanzamento degli studi. Qui, forniamo dettagliate descrizioni di alcuni degli eventi chiave del comportamento di mate-guardia di copepodi Tigriopus supportate da materiali visivi. Inoltre dimostriamo attrezzature e metodi per l'analisi quantitativa del comportamento. Questi metodi consentono la valutazione delle proprietà del comportamento degli animali durante i tentativi di mate-guardia in precisamente replicati esperimenti.
Con questi metodi miriamo a fornire una base metodologica degli studi controllati e riproducibile sul comportamento mate-guardia del genere Tigriopus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Spectrum Brands. Inc.</td>
			<td>SS1-160P</td>
			<td>For preparation of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRO PlecoWafers</td>
			<td>Tetra</td>
			<td>16447</td>
			<td>Food for copepods (used after being ground in a mortar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid</td>
			<td>Corning Co., Ltd.</td>
			<td>353224</td>
			<td>Container for culture of gravid females and hatched nauplii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 24-well cell culture plate with lid</td>
			<td>Corning Co., Ltd.</td>
			<td>353226</td>
			<td>Container for individual culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 48-well cell culture plate with lid</td>
			<td>Nest Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>748001</td>
			<td>Behavioral observation chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light pad</td>
			<td>Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd.</td>
			<td>Litup LP4</td>
			<td>Backlight for behavioral observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Canon</td>
			<td>0591C003 (model: Rebel T6i)</td>
			<td>For recording of behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td>For transfer of copepods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 micropipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0735</td>
			<td>For transfer of C1 stage copepodids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.49t</td>
			<td>For semi-automatic analysis of movies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTrackJ</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.5.1</td>
			<td>ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

individual culturing of tigriopus copepods and quantitative analysis of their mate-guarding behavior

Copepodi del genere Tigriopus, che sono comuni zooplancton nelle pozze di marea rocciosa, mostrano il comportamento di mate-guardia precopulatory dove un uomo stringe un potenziale compagno per formare una coppia. Mentre questo fenomeno ha attirato l'interesse dei ricercatori, metodi per la sua analisi non sono state descritte bene. Qui descriviamo le procedure per: 1) i singoli coltura e messa in scena di Tigriopus giovani e adulti e 2) video basati su analisi del loro comportamento mate-guardia. Il metodo di coltura consente controllo sperimentale dell'esperienza di animali, nonché la possibilità di monitorare il loro sviluppo prima dei test comportamentali per sbucciare. Il metodo di analisi permette la valutazione quantitativa dei diversi aspetti del comportamento mate-guardia, tra cui catturare tentativi da maschi e nuoto traiettoria di coppie mate-guardia. Sebbene questi metodi siano stati originariamente stabiliti per gli studi etologici su Tigriopus, con opportune modifiche possono anche applicarsi agli studi di altri zooplancton in diversi campi di ricerca, quali fisiologia, tossicologia ed ecologico genetica.

Il metodo di coltura individuo descritto nel passaggio 1 consente di preparazione e messa in scena di animali vergini con alcuna esperienza precedente di accoppiamento.
Registrazione video e l'osservazione del comportamento mate-guardia di copepodi Tigriopus permette il test del comportamento descritto nel passaggio 2. Il seguente esame del video registrato con i metodi descritti nei passaggi 3 e 4 consente analisi quantitativa dei diversi aspetti del comportamento illustrato nella Figura 1.
Figura 11 Mostra una differenza nella durata media di tentativi tra coppie maschio-femmina e maschio-maschio di T. californicusdi guardia. Un'analisi manuale ha dimostrato che coppie maschio-maschio ha mostrato relativamente più breve durata della coppia di coppie maschio-femmina.
Esempi delle traiettorie rilevate con il metodo di analisi sono presentati nella Figura 12 e un risultato rappresentativo dell'analisi velocità è illustrato nella Figura 13. Monitoraggio spaziale bidimensionale della neonata guardia paia di T. californicus ha rivelato che coppie maschio-maschio tendevano a mostrare una maggiore velocità rispetto a coppie uomo-donna nelle prime 3 s di custodire tentativi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig1.jpg"> Figura 1: Comportamento di Mate-guardia in Tigriopus. (A) un maschio adulto clasping minorenne (copepodid) con le prime antenne (indicate dalle frecce blu). Bar = 1 mm. (B) uno schema di comportamento mate-guardia. Un uomo cerca di catturare un individuo di destinazione (a sinistra) e forma una coppia con esso (al centro). In coppia maschio-maschio e alcune coppie uomo-donna, un tentativo di guardia termina senza copulazione. Questa figura è stata modificata da Tsuboko-Ishii e Burton 20175. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig2.jpg"> Figura 2: Fasi di sviluppo della Tigriopus. Tigriopus specie in genere sottoposti a sei fasi di Nauplio (da NI a NVI), cinque copepodid fasi (da CI CV) e una fase adulta (CVI)16. I maschi fanno guardia tentativi larve da una fase iniziale di copepodids (CI japonicus T. e T. fulvus6,17 ) e CII s, californicu T.3, così come agli adulti di entrambi i sessi5 . Questa figura è stata modificata da Tsuboko-Ishii e Burton 20175. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig3.jpg"> Figura 3: Morfologia degli adulti (T. californicus). Maschio adulto (A) . Femmina adulta (B) . (C) Gravid femmina adulta con un sac dell'uovo con le uova (arancione chiaro) fertilizzate e sviluppati. (D) Gravid femmina adulta con un sac dell'uovo con non fecondate o non sviluppate (verde scuro) uova. Le frecce indicano sacche di uova. Bar = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig3large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig4.jpg"> Figura 4: struttura di preparazione alla cultura individuale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig5.jpg"> Figura 5: Molted esuvie. (A) esuvie da CI alle fasi di CV di un singolo animale di T. californicus. Bar = 1 mm. (B) esuvie da CI CV fasi ben in una cultura individuale. Detriti bianco sono escremento di un animale coltivato nel pozzo (non mostrato nell'immagine). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig6.jpg"> Figura 6: ricerca di esuvie sotto uno stereomicroscopio. Bar = 1 mm. cambio di focale (A) di uno stereomicroscopio per il rilevamento di esuvie a diverse profondità. Magenta frecce indicano esuvie concentrato e frecce grigie indicano esuvie unfocused. Immagine in alto si concentra sulla sinistra esuvie, che è incassata nella parte inferiore del pozzo. Parte inferiore dell'immagine si concentra sulla destra esuvie, che sta galleggiando sotto la superficie media. (B) immagine in alto mostra un esempio di ostruzione dell'esame di detriti galleggianti sulla superficie media. Una freccia verde indica un esuvie nascosto sotto le macerie. Immagine in basso mostra un risultato di pulizia di superficie con un piccolo pezzo di carta assorbente. Un esuvie (indicato da una freccia verde) è visibile dopo la pulizia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig7.jpg"> Figura 7: gestione temporanea e sessaggio degli animali. Esempi di come contrassegnare il numero di esuvie e sesso degli animali su un coperchio di una piastra di coltura. (A) un esempio per un pozzo contenente cinque esuvie e un animale adulto. Il numero delle linee a marchio tally sul coperchio rappresenta il numero di esuvie trovato nel pozzo. Quando il numero di esuvie raggiunge cinque, il sesso dell'animale può essere determinato sulla base della morfologia di antenne (Vedi anche Figura 3). (B) un esempio di un coperchio marcato di una piastra di coltura. Prime righe contengono gli animali più anziani (CIV per adulto) e fondo righe contengono più giovani (cioè, appena raccolti) animali (CI di CIII). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig8.jpg"> Figura 8: schema di test comportamentali. Installazione per registrazione video del compagno-guardia comportamento (a sinistra) e un contorno di test comportamentali (a destra). Questa figura è stata modificata da Tsuboko-Ishii e Burton 20175. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig9.jpg"> Figura 9: risciacquo degli animali prima di un test comportamentali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig10.jpg"> Figura 10: definizione degli eventi esaminati nell'analisi manuale. Illustrazioni degli eventi osservati in relazione al tentativo di mate-guardia. Vengono evidenziati i nomi degli eventi definiti e analizzati nel passaggio 3. Eventi racchiusi in una linea tratteggiata non possono essere osservati in alcuni tentativi di mate-guardia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig10large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig11.jpg"> Figura 11: La differenza di durata tra coppie maschio-femmina e maschio-maschio di T. californicusa guardia. Ogni simbolo di triangolo rappresenta i dati da una coppia di testate. Bar e baffi rappresentano rispettivamente mediane e intervallo interquartile. Durata media di cattura è stato maggiore per coppie maschio-femmina (maschio-femmina (n = 22), maschio-maschio (n = 29); * *p < 0.01 di test U di Mann-Whitney). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig11large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig12.jpg"> Figura 12: traiettorie delle coppie nei primi tre secondi di guardia tentativi. Esempi di traiettorie cingolati bidimensionale di coppie maschio-femmina (a sinistra) e coppie maschio-maschio (a destra) di T. californicus. I punti sulle traiettorie rappresentano intervalli di tempo (30 fotogrammi al secondo). Bar = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig12large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig13.jpg"> Figura 13: La differenza di velocità media dopo l'inizio della guardia tra coppie maschio-femmina e maschio-maschio di T. californicus. Ogni simbolo di triangolo rappresenta i dati da una coppia di testate. Bar e baffi rappresentano rispettivamente mediane e intervallo interquartile. Media velocità della coppia nelle prime 3 s di custodire tentativi era maggior per coppie maschio-maschio (maschio-femmina (n = 13), maschio-maschio (n = 35). * * *p < 0,001 di test U di Mann-Whitney). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig13large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Suppl Figure 1" src="/files/ftp_upload/58378/58378sfig1.jpg"> Supplemental figura 1: Effetto di risciacquo trattamento sul comportamento di Tigriopus. Ogni simbolo cerchio o triangolo rappresenta i dati da una testata individuo o coppia. Bar e baffi rappresentano rispettivamente mediane e intervallo interquartile. Gli individui in "risciacquo" e "non risciacquato" gruppi erano gestiti allo stesso modo, tranne per il fatto che il gruppo "non risciacquato" non ha avvertito il risciacquo trattamento (punto 2.1.3) prima che il tempo di registrazione di 30 minuti (punto 2.1.4). (A) velocità media dei maschi risciacquati tendeva ad essere maggiore di quello dei maschi non risciacquati (sciacquati (n = 6), non risciacquato (n = 6), n.s.: nessuna differenza significativa è stata rilevata da Mann-Whitney U test). La velocità è stata misurata per 30 s basato su video registrato dopo il tempo di regolazione. (B) velocità media delle femmine risciacquate tendeva ad essere maggiore di quello delle femmine non risciacquate (sciacquati (n = 6), non risciacquato (n = 6), n.s.: nessuna differenza significativa è stata rilevata da Mann-Whitney U test). La velocità è stata misurata per 30 s basato su video registrato dopo il tempo di regolazione, seguendo passo 4 (intervallo di rilevamento = 0,5 s). (C) frequenza di tentativi di guardia era maggiore per coppie di individui risciacquati (sciacquati (n = 6), non risciacquato (n = 6). * * p < 0.01 di test U di Mann-Whitney). (D) durata della guardia tentativi tendeva ad essere maggiore per le coppie di individui risciacquati (sciacquati (n = 6), non risciacquato (n = 6), n.s.: nessuna differenza significativa è stata rilevata da Mann-Whitney U test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378sfig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior

Coltura individuali di copepodi Tigriopus e analisi quantitativa del loro comportamento Mate-guardia

Comportamento di Mate-guardia svolge un ruolo importante nella riproduzione di intercotidale copepodi del genere Tigriopus. Tuttavia, metodi per lo studio di questo comportamento non sono state descritte bene. Qui descriviamo i metodi per: 1) singola cultura del vergine Tigriopus animali, 2) analisi quantitativa del loro comportamento mate-guardia.

Copepods of the genus Tigriopus, which are common zooplankton in rocky tide pools, show precopulatory mate-guarding behavior where a male clasps a ...

Il vantaggio principale di questa tecnica di coltivazione è che è possibile ottenere copepodi vergini controllando la loro esperienza di accoppiamento e monitorandone lo sviluppo. Il seguente metodo di analisi del comportamento può aiutare esperimenti controllati e riproducibili sul comportamento di protezione del mate dei copepodi Tigriopus che sono comuni zooplancton nelle pozze di marea rocciose. Sebbene questi metodi possano fornire informazioni sul comportamento riproduttivo del Tigriopus, possono anche essere usati per esaminare come i fattori genetici e ambientali influenzano la fisiologia e il comportamento di questi copepodi.Per iniziare, usa una pipetta Pasteur per raccogliere femmine gravide che trasportano uova d'arancia chiare dalla coltura stock. Risciacquare le femmine con un mezzo di coltura pulito tramite pipettazione delicata. Quindi, posizionare ogni femmina in un pozzo individuale di una piastra di coltura cellulare a sei pozzi con mezzo di coltura pulito.Quindi posizionare il piatto in un'incubatrice per coltura delle femmine fino a quando non rilasciano sacche di uova. Dopo che le sacche di uova sono state rilasciate, utilizzare una pipetta Pasteur per rimuovere le femmine dai pozzi del piatto. Non appena gli animali nella prima fase copepodide o CI iniziano ad emergere, utilizzare una micropipetta P-10 per raccoglierli.Ogni due o tre giorni, monitora i pozzi per le exuviae fuse. Dopo questo, sesso con gli animali esaminando la loro morfologia dell'antenna. Per identificare correttamente le femmine adulte, assicurarsi che abbiano già fuso cinque esuviae nei pozzi di coltura perché le differenze nella forma delle antenne tra femmine adulte e giovani non sono visibilmente significative in alcune popolazioni.Dopo aver selezionato gli animali della fase e del sesso appropriati, nutrire gli individui selezionati con cibo per pesci finemente macinato. Mentre gli animali mangiano, prepara due piastre di coltura cellulare a fondo piatto da 48 po 'come camere di prova. Dopo 30 minuti, sciacquare ogni animale in un susseguirsi di quattro pozzi di una piastra di 24 po 'piena di acqua di mare artificiale pulita.Quindi posizionare gli individui risciacquati nei pozzi delle piastre A e B sul light pad a LED. Lasciare che gli animali si acclimatino per 30 minuti, quindi utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire i bersagli dalla piastra B alla piastra A.Consentire a un maschio e a un bersaglio di interagire in ogni pozzo per il tempo di osservazione designato prima di interrompere la registrazione video. In primo luogo, esaminare il video per la tempistica in cui ogni bersaglio è stato trasferito in un pozzo sulla piastra A.Next, definire l'inizio di un tentativo di guardia da parte di un maschio come un contatto dell'antenna del maschio con qualsiasi parte del corpo del bersaglio.Definire la fine del tentativo di guardia da parte di un maschio come punto in cui entrambe le antenne del maschio si staccano dal corpo del bersaglio. Quindi, definire l'inizio della copulazione da una curva del corpo dorsale di un maschio, seguita da una pressa ripetitiva dell'urosoma contro quella della femmina. Per prima cosa, genera un video clip con l'episodio di interesse tagliando il film con il software di editing cinematografico.Quindi, apri ImageJ e importa il video clip. Selezionare l'opzione di scala di grigi covert a 8 bit per ridurre la memoria necessaria per l'elaborazione delle immagini. Selezionare quindi lo strumento di selezione della linea retta per la calibrazione ziale e disegnare una linea di selezione lungo il diametro del pozzo.Aprite il menu imposta scala (Set Scale) e immettete la lunghezza nota nella casella di distanza nota e l'unità nella casella unità di lunghezza. Successivamente, aprite il menu delle proprietà e immettete l'intervallo di fotogrammi nella casella intervallo fotogrammi. Aprire il plug-in MTrackJ selezionando plugin e MtrackJ.Quindi, fare clic sul pulsante di rilevamento nella finestra di dialogo per aprire il menu di configurazione del rilevamento. Selezionare Applica aggancio cursore locale durante la traccia e selezionare il baricentro scuro come feature di aggancio. Fare quindi clic sul pulsante Aggiungi nella finestra di dialogo MTrackJ per avviare il rilevamento.Posizionare un cursore per coprire le persone nel video clip da tenere traccia. Quindi, fare clic per rilevare il baricentro scuro dell'oggetto all'interno del quadrato. Per generare una tabella dati, fate clic sulla tabella di misura nella finestra di dialogo MTrackJ, quindi fate clic sul pulsante filmato per generare un filmato con la traiettoria tracciata disegnata come linea colorata.Infine, fate clic sul pulsante Salva (Save) nella finestra di dialogo MTrackJ per salvare i risultati, inclusi i dati nella traiettoria bidimensionale tracciata. In questo esperimento, è stato registrato e osservato un comportamento di protezione del compagno dei copepodi tigrini. L'analisi mostra una differenza nella durata media dei tentativi di guardia tra coppie maschio-femmina e coppie maschio-maschio del Tigriopus californicus dove i maschi nelle coppie maschio-maschio mostravano una durata dei tentativi relativamente più breve rispetto a quelli delle coppie maschio-femmina.Il tracciamento spaziale a due dimensioni di coppie di guardia appena formate di Tigriopus californicus ha rivelato che le coppie maschio-maschi tendevano a mostrare una velocità più elevata rispetto alle coppie maschio-femmina nei primi tre secondi di tentativi di guardia. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nei campi dell'etologia, biochimica e genetica evolutiva per esplorare il sistema di accoppiamento unico di questo tipo di copepodi.

Research

JoVE Journal

Environment

Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior

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Ricerca

Ambiente

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