Name: individual culturing of tigriopus copepods and quantitative analysis of their mate-guarding behavior
Uploaded: 2018-09-26T14:30:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior at JoVE.com

Эта работа поддерживается за счет субсидий Фонда, Япония Sumitomo (Грант для основных научно-исследовательских проектов, номер гранта: 150932) и исследовательский институт морских беспозвоночных, Япония (2018 Индивидуальный исследовательский грант) ИППП и RSB и Грант из США Национальный научный фонд (DEB-1556466) к РСБ. Мы благодарим г-жа Киана Мишель Woodward для обратной связи на метод культивирования и промежуточной.

<ol>
	<li>Chullasorn, S., Dahms, H. U., Klangsin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+species+of+Tigriopus+(Copepoda:+Harpacticoida:+Harpacticidae)+from+Thailand+with+a+key+to+the+species+of+the+genus.">A new species of Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida: Harpacticidae) from Thailand with a key to the species of the genus.</a> Journal of Natural History. 47 (5-12), 427-447 (2013).</li><li>Fraser, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occurrence,+ecology+and+life+history+of+Tigriopus+fulvus+(Fischer).">The occurrence, ecology and life history of Tigriopus fulvus (Fischer).</a> Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 20 (3), 523-536 (1936).</li><li>Burton, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+system+of+the+intertidal+copepod+Tigriopus+californicus.">Mating system of the intertidal copepod Tigriopus californicus.</a> Marine Biology. 86 (3), 247-252 (1985).</li><li>Lazzaretto, I., Salvato, B., Libertini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+chemical+signaling+in+Tigriopus+fulvus+(copepoda,+harpacticoida).">Evidence of chemical signaling in Tigriopus fulvus (copepoda, harpacticoida).</a> Crustaceana. 59 (2), 171-179 (1990).</li><li>Tsuboko-Ishii, S., Burton, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+rejection+in+mate-guarding+pair+formation+in+the+intertidal+copepod,+Tigriopus+californicus.">Sex-specific rejection in mate-guarding pair formation in the intertidal copepod, Tigriopus californicus.</a> PLoS ONE. 12 (8), e0183758 (2017).</li><li>Ito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+a+harpacticoid+copepod,+Tigriopus+japonicus+Mori.">The biology of a harpacticoid copepod, Tigriopus japonicus Mori.</a> Journal of the Faculty of Science, Hokkaido University, Series 4, Zoology. 17 (3), 474-500 (1970).</li><li>Kelly, L. S., Snell, T. W., Lonsdale, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+communication+during+mating+of+the+harpacticoid+Tigriopus+japonicus.">Chemical communication during mating of the harpacticoid Tigriopus japonicus.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 353 (1369), 737-744 (1998).</li><li>Kelly, L. S., Snell, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+surface+glycoproteins+in+mate-guarding+of+the+marine+harpacticoid+Tigriopus+japonicus.">Role of surface glycoproteins in mate-guarding of the marine harpacticoid Tigriopus japonicus.</a> Marine Biology. 130 (4), 605-612 (1998).</li><li>Peterson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+and+phylogenetic+divergence+of+tidepool+copepod+populations+across+a+narrow+geographical+boundary+in+Baja+California.">Reproductive and phylogenetic divergence of tidepool copepod populations across a narrow geographical boundary in Baja California.</a> Journal of Biogeography. 40 (9), 1664-1675 (2013).</li><li>Palmer, C. A., Edmands, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mate+choice+in+the+face+of+both+inbreeding+and+outbreeding+depression+in+the+intertidal+copepod+Tigriopus+californicus.">Mate choice in the face of both inbreeding and outbreeding depression in the intertidal copepod Tigriopus californicus.</a> Marine Biology. 136 (4), 693-698 (2000).</li><li>Ito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+within+the+genus+Tigriopus+(Copepoda:+Harpacticoida)+from+Japan,+with+reference+to+the+relationship+between+Tigriopus+japonicus+and+T.+californicus.">Taxonomy within the genus Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida) from Japan, with reference to the relationship between Tigriopus japonicus and T. californicus.</a> Annual report of the Seto Marine Biological Laboratory. 2, 28-35 (1988).</li><li>Barreto, F. S., Schoville, S. D., Burton, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics+in+the+tide+pool:+Knock-down+of+target+gene+expression+via+RNA+interference+in+the+copepod+Tigriopus+californicus.">Reverse genetics in the tide pool: Knock-down of target gene expression via RNA interference in the copepod Tigriopus californicus.</a> Molecular Ecology Resources. 15 (4), 868-879 (2015).</li><li>Pereira, R. J., Barreto, F. S., Pierce, N. T., Carneiro, M., Burton, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+patterns+of+divergence+during+allopatric+evolution.">Transcriptome-wide patterns of divergence during allopatric evolution.</a> Molecular Ecology. 25 (7), 1478-1493 (2016).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+cell+and+particle+tracking.">Methods for cell and particle tracking.</a> Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).</li><li>Raisuddin, S., Kwok, K. W., Leung, K. M., Schlenk, D., Lee, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+copepod+Tigriopus:+a+promising+marine+model+organism+for+ecotoxicology+and+environmental+genomics.">The copepod Tigriopus: a promising marine model organism for ecotoxicology and environmental genomics.</a> Aquatic Toxicology. 83 (3), 161-173 (2007).</li><li>Lazzaretto, I., Franco, F., Battaglia, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+behaviour+in+the+harpacticoid+copepod+Tigriopus+fulvus.">Reproductive behaviour in the harpacticoid copepod Tigriopus fulvus.</a> Hydrobiologia. 292, 229-234 (1994).</li><li>Medina, M. H., Morandi, B., Correa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+effects+in+the+copepod+Tigriopus+angulatus+Lang.">Copper effects in the copepod Tigriopus angulatus Lang.</a> Marine and Freshwater Research. 59 (12), 1061-1066 (1933).</li><li>McDonough, P. M., Stiffler, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+regulation+in+the+tidepool+copepod+Tigriopus+californicus.">Sodium regulation in the tidepool copepod Tigriopus californicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 69 (2), 273-277 (1981).</li><li>Hagiwara, A., Lee, C. -. S., Shiraishi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+reproductive+characteristics+of+the+broods+of+the+harpacticoid+copepod+Tigriopus+japonicus+cultured+in+different+salinities.">Some reproductive characteristics of the broods of the harpacticoid copepod Tigriopus japonicus cultured in different salinities.</a> Fisheries Science. 61 (4), 618-622 (1995).</li><li>Pereira, R. J., Sasaki, M. C., Burton, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+a+latitudinal+thermal+gradient+within+a+widespread+copepod+species:+the+contributions+of+genetic+divergence+and+phenotypic+plasticity.">Adaptation to a latitudinal thermal gradient within a widespread copepod species: the contributions of genetic divergence and phenotypic plasticity.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 284 (1853), 20170236 (2017).</li><li>Barreto, F. S., Pereira, R. J., Burton, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+dysfunction+and+physiological+compensation+in+gene+expression.">Hybrid dysfunction and physiological compensation in gene expression.</a> Molecular Biology and Evolution. 32 (3), 613-622 (2015).</li><li>Alexander, H. J., Richardson, J. M., Edmands, S., Anholt, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+without+sex+chromosomes:+genetic+architecture+of+multiple+loci+independently+segregating+to+determine+sex+ratios+in+the+copepod+Tigriopus+californicus.">Sex without sex chromosomes: genetic architecture of multiple loci independently segregating to determine sex ratios in the copepod Tigriopus californicus.</a> Journal of Evolutionary Biology. 28 (12), 2196-2207 (2015).</li><li>Foley, B. R., Rose, C. G., Rundle, D. E., Leong, W., Edmands, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postzygotic+isolation+involves+strong+mitochondrial+and+sex-specific+effects+in+Tigriopus+californicus,+a+species+lacking+heteromorphic+sex+chromosomes.">Postzygotic isolation involves strong mitochondrial and sex-specific effects in Tigriopus californicus, a species lacking heteromorphic sex chromosomes.</a> Heredity. 111 (5), 391-401 (2013).</li><li>Koga, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Life+History+of+Tigriopus+japonicus+Mori+(Copepoda).">On the Life History of Tigriopus japonicus Mori (Copepoda).</a> Journal of Oceanography. 26 (1), 11-21 (1970).</li><li>Powlik, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+abundance+and+population+flux+of+Tigriopus+californicus+(Copepoda+:+Harpacticoida)+in+Barkley+Sound,+British+Columbia.">Seasonal abundance and population flux of Tigriopus californicus (Copepoda : Harpacticoida) in Barkley Sound, British Columbia.</a> Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 78 (2), 467-481 (1998).</li><li>Lard, M., Backman, J., Yakovleva, M., Danielsson, B., Hansson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+small+with+the+smallest+-+Using+nanotechnology+in+tracking+zooplankton.">Tracking the small with the smallest - Using nanotechnology in tracking zooplankton.</a> PLoS ONE. 5 (10), e13516 (2010).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Индивидуальные культивирования и определение стадии и секс
Здесь мы описал метод, используемый в наших предыдущих исследований5 подготовить девственной Tigriopus животных с их спаривания опыт, контролируемых отслеживая их развития (рис. 4 и рис. 7). Как Tigriopus видов используются как модель животных в различных областях биологических например токсикологии16,18, экологическая физиология19,20,21и эволюционный Генетика13,,2223,24, этот метод имеет возможность предоставлять ценные средства для оценки воздействия экологических и генетических факторов на жизненный цикл этих рачков.
Для достижения успешной постановки, обычный поиск и сбор CI copepodids от массовой культуры (шаг 1.2) имеет решающее значение, как коллекции на более поздних этапах может привести к неправильной постановке животных. Кроме того тщательный поиск exuviae (шаг 1.3) также имеет важное значение для точной постановки. Увеличьте частоту сбора и проведение по мере необходимости, как интервал между линяет варьируется от одного до нескольких дней в зависимости от видов и воспитания условие2,25,26. Различия в морфологии антенн copepodids и взрослых самок не заметно значительное в некоторых видов и популяций Tigriopus16,25. Следовательно постановка перед sexing полезно различать взрослых самок от передовых copepodids обоего пола.
Поведенческие тесты и ручной анализ поведенческих свойств
В целом одним из наиболее важных частей этологическая исследований является определение и описание событий, представляющих интерес. Методы, представленные в настоящем документе были впервые разработаны для нашего недавнего исследования5 и дополнено описанием совокупление и наглядных пособий (Рисунок 10). В дополнение к этому последовательность в животных обработки также играет важную роль в поведенческих экспериментов. Например промывки копепод потенциально может облегчить некоторые аспекты их поведения (дополнительная цифра 1) и поэтому желательно, чтобы выполняться последовательным образом среди образцов, таких, как стандартизированные в шаге 2.1.3. Мы ожидаем, что материалы, представленные в настоящем документе будет помогать контролируемых и воспроизводимости исследований на Мате охрана поведение Tigriopus, поощрение репродуктивного и экологические исследования этот богатый житель прилива бассейны.
Одно из возможных ограничений с помощью этого метода является малое увеличение полученных изображений. Хотя фильмы, записанные с нашей системой позволяют идентифицировать выдающихся тела структур, включая urosomes и мужской первый антенн, одно не сможет наблюдать более тонкие структуры, такие как ноги и гениталии с нашим методом, так как он не использовать микроскопические увеличение для записи видео. Хотя Келли et al. сообщили, что они были в состоянии соблюдать сперматофоры передачи от мужчины женщины т. japonicus под микроскопические наблюдения на 100 крат (не видео)7, мы не смогли наблюдать сперматофор в наших фильмов, возможно из-за ограничения разрешения изображения.
Двумерные отслеживания пар
Хотя этот метод не позволяет трехмерного отслеживания животных, он позволяет анализ двумерных траектории зоопланктона без химически маркировки животных (cf. Сало et al. 201027), используя программы распространяется бесплатно. Если размер файла фильма является слишком большим, чтобы быть обработаны в ImageJ, можно уменьшить разрешение файла и преобразовать его в фильм серой шкалы. В то время как описан метод первоначально был разработан для взрослых пар т. californicus (рис. 12 и рис. 13), также доступна для взрослых несовершеннолетних пар и отдельных лиц (дополнительная цифра 1) как а также других видов Tigriopus , в принципе. Мы ожидаем дальнейшего метод, чтобы быть применимым к краткосрочной (от миллисекунд до второй шкалы времени) траектории анализ зоопланктона других таксонов с соответствующими изменениями.

Дезовые приливные копепод рода Tigriopus широко распространены в скалистых высоких приливных бассейнов через несколько континентов1. Эти копепод демонстрируют поведение, мате охрана в рамках их размножения, когда взрослый мужчина захватывает потенциального партнера (несовершеннолетних или взрослых) используя его подключили первые антенн до совокупления (рис.1 и рис.2)2 ,3,4,5. Хотя это явление является предметом этологии и биохимических исследований для десятилетий2,3,6,7, подробные процедуры для исследования этого поведения, в том числе Индивидуальные культуры девственной животных и критерии поведения событий видели в Мате охрана попытки, не были хорошо описаны. Таким образом здесь мы разработать методы, позволяющие исследования поведения под контролируемой экспериментальной среде.
Индивидуальные культивирования и постановка животных
Предыдущие исследования размножения Tigriopus условно заняты пару отсоединение метод для подготовки несовершеннолетних (copepodids) и взрослых самок поведенческие тесты и разведение эксперименты3,8,9 ,10. Однако этот метод позволяет животных форма пар и потенциально совокупляться до испытаний (обсуждается в 1988 году Ито11), которые могут изменить поведенческие свойства животных5. Кроме того есть потенциал, чтобы недооценивать этапы развития копепод с обычными протоколами, как они полагаются на размер очевидной тела для постановки. В настоящем документе мы описываем индивидуальный метод культивирования в нашем недавнем исследовании с Tigriopus californicus5, который был разработан для устранения этих недостатков, управляя спаривания опыт животных и отслеживание их развития от copepodid до стадии взрослого.
Количественный анализ поведения, мате охрана
Исследовано поведение Мате охрана видов Tigriopus не только в области этологии2,6 , но и в других областях, таких как экотоксикология и эволюционной генетики3,4, 7 , 8 , 9 , 10. Однако, предыдущие исследования объяснили курс этого поведения в основном письменные формы без достаточного визуальных иллюстраций изложить как поведение, так и методы для его изучения, которые создает технических препятствий для Репликация и продвижение исследований. Здесь мы предоставляем подробные описания некоторых из ключевых событий в Мате охрана поведение Tigriopus копепод, поддерживаемых визуальные материалы. Мы также продемонстрировать оборудование и методы для количественного анализа поведения. Эти методы позволяют оценки поведенческих свойств животных во время попытки Мате охрана в точно реплицированных экспериментов.
С помощью этих методов мы стремимся предоставить методологические основы исследования контролируемого и воспроизводимые на Мате охрана поведение род Tigriopus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Spectrum Brands. Inc.</td>
			<td>SS1-160P</td>
			<td>For preparation of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRO PlecoWafers</td>
			<td>Tetra</td>
			<td>16447</td>
			<td>Food for copepods (used after being ground in a mortar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid</td>
			<td>Corning Co., Ltd.</td>
			<td>353224</td>
			<td>Container for culture of gravid females and hatched nauplii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 24-well cell culture plate with lid</td>
			<td>Corning Co., Ltd.</td>
			<td>353226</td>
			<td>Container for individual culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 48-well cell culture plate with lid</td>
			<td>Nest Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>748001</td>
			<td>Behavioral observation chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light pad</td>
			<td>Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd.</td>
			<td>Litup LP4</td>
			<td>Backlight for behavioral observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Canon</td>
			<td>0591C003 (model: Rebel T6i)</td>
			<td>For recording of behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td>For transfer of copepods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 micropipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0735</td>
			<td>For transfer of C1 stage copepodids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.49t</td>
			<td>For semi-automatic analysis of movies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTrackJ</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.5.1</td>
			<td>ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

individual culturing of tigriopus copepods and quantitative analysis of their mate-guarding behavior

Копепод род Tigriopus, которые являются общей зоопланктона в скалистых прилива бассейны, показать precopulatory Мате охрана поведение, где мужчина замочки потенциального партнера сформировать пару. Хотя это явление вызвало интерес исследователей, методы для его анализа не были хорошо описаны. Здесь мы описываем процедуры: 1) индивидуальных культивирования и постановка Tigriopus несовершеннолетних и взрослых и 2) видео на основе анализа их поведения, мате охрана. Метод культивирования позволяет экспериментальный контроль кожура опыт животных, а также возможность отслеживать их развития до поведенческие тесты. Метод анализа позволяет дать количественную оценку некоторых аспектов поведения Мате охрана, включая захват попытки мужчины и плавание траектории Мате охрана пар. Хотя эти методы были первоначально созданы для этологии исследования на Tigriopus, с надлежащей модификации они могут также применяться для исследования других зоопланктона в различных исследовательских областях, таких как физиологии, токсикологии и экологические генетика.

Индивидуальный культивирования методом, описанным в шаг 1 позволяет подготовку и постановку девственной животных без предварительного опыта спаривания.
Поведенческие испытания, описанного в шаге 2 позволяет запись видео и наблюдения за поведением Мате охрана копепод Tigriopus . Следующие проверки записанного видео с методами, описанными в шагах 3 и 4 позволяет количественный анализ некоторых аспектов поведения, показанный на рисунке 1.
На рисунке 11 показана разница в средней продолжительности охраны попытки между парами мужчина женщина и мужчина мужчина пар т. californicus. Ручной анализ показал, что пар НР НР показали относительно краткосрочных спаривания чем пары мужчин и женщин.
На рисунке 12 представлены примеры траекторий, отслеживаются с помощью метода анализа и представитель результат анализа скорости показан на рисунке 13. Двумерные пространственные отслеживания новообразованной охранные пар т. californicus показал, что НР НР пар, как правило, показывают более высокие скорости чем пары мужчин и женщин в первые 3 s охранного попыток.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig1.jpg"> Рисунок 1: Мате охрана поведение в Tigriopus. (A) Взрослый самец, сжимая несовершеннолетнего (copepodid) с первым антенн (обозначается синие стрелки). Бар = 1 мм. контуром Мате охрана поведения (B) . Мужчина пытается захватить цель индивидуальных (слева) и образует пару с ним (в середине). НР НР пар и некоторые пары мужчин и женщин охрана попытка завершается без совокупления. Этот рисунок был изменен с Tsuboko-Ишии и Бертон 20175. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig2.jpg"> Рисунок 2: Этапы развития Tigriopus. Tigriopus видов обычно проходят шесть этапов nauplius (от NI НВИ), пять этапов copepodid (от ди-CV) и взрослой стадии (CVI)16. Мужчины делают охранные попытки несовершеннолетних от ранней стадии copepodids (CI в japonicus т. и т. fulvus6,17 ) и ИСИ в s т. californicu3, а также взрослых обоих полов5 . Этот рисунок был изменен с Tsuboko-Ишии и Бертон 20175. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig3.jpg"> Рисунок 3: Морфология взрослых (T. californicus). (A) взрослого самца. (B) взрослая самка. (C) беременных взрослой самки с яйца мешка с яйца оплодотворенные и развитых (снимите оранжевый). (D) беременных взрослой самки с яйца мешка с неоплодотворенные или неразвитых (тёмно-зелёный) яйца. Стрелки указывают яйцо мешки. Бар = 1 мм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig3large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig4.jpg"> Рисунок 4: план подготовки для отдельных культуры. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig5.jpg"> Рисунок 5: расплавленная exuviae. (A) Exuviae от CI CV этапов одного животного т. californicus. Бар = 1 mm. (B) Exuviae от CI для CV этапов в отдельные культуры хорошо. Белый мусор это экскремент животного культивировали в колодец (не показано на рисунке). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig6.jpg"> Рисунок 6: Поиск для exuviae под стереомикроскопом. Бары = 1 мм. координационные (A) изменение стереомикроскопом для обнаружения exuviae на разных глубинах. Малиновая стрелки указывают сосредоточены exuviae и серые стрелки указывают нецеленаправленных exuviae. Верхнее изображение фокусируется на левой exuviae, который является затонувшее в нижней части скважины. Нижнее изображение фокусируется на правой exuviae, который располагается под поверхностью средних. (B) верхнем изображении показан пример непроходимости экспертизы мусор, плавающей на поверхности среднего. Зеленая стрелка указывает exuviae, скрытые под обломками. Изображение внизу показывает результат очистки с небольшой кусочек бумаги полотенце. Exuviae (обозначается зеленой стрелкой) видна после очистки. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig7.jpg"> Рисунок 7: определение пола животных и промежуточной. Примеры того, как отметить количество exuviae и секс животных на крышку плиты культуры. (A) пример для колодца, содержащий пять exuviae и взрослого животного. Количество линий в Талли Марк на крышке представляет количество exuviae в колодец. Когда количество exuviae достигает пяти, Пол животного может быть определена на основании Морфология усиков (см. также рис. 3). (B) пример заметное крышка плиты культуры. Верхние строки содержат старых животных (CIV для взрослых) и нижней строки содержат младший (т.е., недавно собранных) животные (CI CIII). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig7large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig8.jpg"> Рисунок 8: схема поведенческой тест. Установка для записи видео Мате охрана поведения (слева) и наброски поведенческих теста (справа). Этот рисунок был изменен с Tsuboko-Ишии и Бертон 20175. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig8large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig9.jpg"> Рисунок 9: полоскание животных до поведенческих test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig9large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig10.jpg"> Рисунок 10: определение событий в ручной анализ. Иллюстрации событий наблюдается по отношению к Мате охрана попытки. Выделяются имена событий определены и проанализированы в шаге 3. События, заключенный в пунктирной линии не могут наблюдаться в некоторых попыток Мате охрана. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig10large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig11.jpg"> Рисунок 11: Разница в охране продолжительность между парами мужчина женщина и мужчина мужчина пар т. californicus. Каждый символ треугольника представляет данные из одной пары испытания. Бары и усы представляют, соответственно, медианы и межквартильный диапазон. Средняя продолжительность записи была больше для пары мужчин и женщин (мужчины женщины (n = 22), мужчина мужчина (n = 29); **p < 0.01 проверкой U Манна-Уитни). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig11large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig12.jpg"> Рисунок 12: траекторий пар в течение первых трех секунд охранного попытки. Примеры отслеживаемых двумерных траекторий мужской женский пар (слева) и мужчинами пар (справа) т. californicus. Точки на траектории представляют моменты времени (30 кадров в секунду). Бары = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig12large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig13.jpg"> Рисунок 13: Разница в средней скорости после начала охранного между парами мужчина женщина и мужчина мужчина пар т. californicus. Каждый символ треугольника представляет данные из одной пары испытания. Бары и усы представляют, соответственно, медианы и межквартильный диапазон. Средняя скорость пары в первые 3 s охранного попыток была больше для НР НР пар (мужчины женщины (n = 13), мужчина мужчина (n = 35). ***p < 0,001 проверкой U Манна-Уитни). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig13large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Suppl Figure 1" src="/files/ftp_upload/58378/58378sfig1.jpg"> Дополнительные рисунок 1: Эффект полоскания лечения на поведение Tigriopus. Каждый круг или треугольник символ представляет данные из одного испытания отдельных или пары. Бары и усы представляют, соответственно, медианы и межквартильный диапазон. Люди в «промыть» и «не промыть» группы были обработаны таким же образом, за исключением того, что группе «не промывать» не испытывали ополаскивания лечения (шаг 2.1.3) до 30-минутный регулировки времени (шаг 2.1.4). (A) средняя скорость промыть мужчины, как правило, быть больше, чем у мужчины не промыть (промыть (n = 6), не промыть (n = 6), н.с.: было обнаружено статистически значимого различия по U Манна-Уитни тест). Скорость измерялась для 30 s, основанный на видео записанный после регулировки времени. (B) средняя скорость промыть самки, как правило, быть больше, чем у самок не промыть (промыть (n = 6), не промыть (n = 6), н.с.: было обнаружено статистически значимого различия по U Манна-Уитни тест). Скорость измерялась для 30 s, основанный на видео записанный после регулировки времени, следующий шаг 4 (отслеживание интервал = 0.5 s). (C) частота охранного попыток была больше для пар промыть лиц (промыть (n = 6), не промыть (n = 6). ** p < 0.01 проверкой U Манна-Уитни). (D) срок охраны попытки, как правило, быть больше для пар промыть лиц (промыть (n = 6), не промыть (n = 6), н.с.: было обнаружено статистически значимого различия по U Манна-Уитни тест). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378sfig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior at JoVE.com

Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior

Индивидуальные культивирования копепод Tigriopus и количественного анализа их поведения, мате охрана

Мате охрана поведение играет важную роль в воспроизводстве приливной копепод рода Tigriopus. Однако не были хорошо описаны методы для изучения этого поведения. Здесь мы описываем методы: 1) отдельные культуры девственной Tigriopus животных, и 2) количественный анализ их поведения, мате охрана.

Copepods of the genus Tigriopus, which are common zooplankton in rocky tide pools, show precopulatory mate-guarding behavior where a male clasps a ...

Основным преимуществом этой культовой техники является то, что вы можете получить девственные copepods, контролируя их опыт сопряжения и отслеживания их развития. Следующий метод анализа поведения может помочь контролируемых и воспроизводимых экспериментов на мат-охраны поведение Tigriopus copepods, которые являются общими зоопланктона в скалистых бассейнов прилива. Хотя эти методы могут дать представление о репродуктивном поведении Tigriopus, они также могут быть использованы, чтобы посмотреть, как генетические и экологические факторы влияют на физиологию и поведение этих copepods.Для начала используйте пипетку Pasteur для сбора гравидных самок, несущих чистые оранжевые яйца из фондовой культуры. Промыть самок с чистой среде культуры через нежный пипетки. Далее поместите каждую самку в индивидуальный колодец из шести хорошо пластины клеточной культуры с чистой среде культуры.Затем поместите тарелку в инкубатор, чтобы культуры женщин, пока они не выпустят яичные мешки. После того, как яичные мешки будут освобождены, используйте пипетку Pasteur, чтобы удалить самок из колодцев пластины. Как только животные на первой стадии copepodid или CI начинают появляться, использовать P-10 micropipette для их сбора.Каждые два-три дня, контролировать скважины для расплавленных exuviae. После этого, секс животных, изучая их антенной морфологии. Чтобы правильно идентифицировать взрослых самок, убедитесь, что они уже расплавили пять exuviae в культуре колодцы, потому что различия в форме антенн между взрослыми женщинами и несовершеннолетними не являются заметно значительными в некоторых популяциях.Выбрав животных соответствующей стадии и пола, кормите отобранных особей мелко молотой рыбной пищей. Пока животные едят, подготовьте 2 плиты культуры нижних клеток 48-наилучшим образом как камеры испытания. После 30 минут прошло, промыть каждое животное путем трубопроводов его в последовательности из четырех скважин 24-хорошо пластины заполнены чистой искусственной морской воды.Затем поместите промытые особи в колодцы пластин А и В на светодиодную световую площадку. Разрешить животным акклиматизироваться в течение 30 минут, а затем использовать пастер пипетку для передачи целей от пластины B к пластине A.Allow мужчины и цели взаимодействовать в каждой хорошо в течение назначенного времени наблюдения перед остановкой видеозаписи. Во-первых, изучить видео для времени, когда каждая цель была передана в колодец на пластине A.Next, определить начало защиты попытка мужчины, как контакт антенны мужчины с любой части тела цели.Определите прекращение попытки охраны самцом как точку, когда обе антенны самца отделяются от тела цели. Затем определите начало совокупления спинным изгибом тела самца, а затем повторяющимся прессом уросом против женского. Во-первых, создать видеоклип с участием эпизод интереса путем обрезки фильма с программным обеспечением для редактирования фильмов.Затем откройте ImageJ и импортируем видеоклип. Выберите скрытый 8-битный параметр серой шкалы, чтобы уменьшить память, необходимую для обработки изображений. Далее выберите инструмент выбора прямой линии для калибровки спациальных отношений и нарисуйте линию отбора по диаметру колодеца.Откройте меню сет-шкалы и введите известную длину в известную коробку расстояния и устройство в блоке длины коробки. После этого откройте меню свойств и введите интервал кадра в интервальную коробку кадра. Откройте плагин MTrackJ, выбрав плагины и MtrackJ.Затем нажмите кнопку отслеживания в окне диалога, чтобы открыть меню конфигурации отслеживания. Проверьте применить локальный курсор привязки во время трека и выберите темный центроид в качестве оснастки функции. Затем нажмите кнопку добавления в диалоговое окно MTrackJ, чтобы начать отслеживание.Распоистите курсор для покрытия лиц в видеоклипе, который будет отслеживаться. Затем нажмите, чтобы обнаружить темную центроиду объекта в квадрате. Чтобы создать таблицу данных, нажмите таблицу мер в окне диалога MTrackJ, а затем нажмите кнопку фильма, чтобы создать фильм с отслеживаемой траекторией, нарисованной в виде цветной линии.Наконец, нажмите кнопку сохранения в диалоговом окне MTrackJ, чтобы сохранить результаты, включая данные в отслеживаемой двумерной траектории. В этом эксперименте было зафиксировано и наблюдаемо поведение tigriopus copepods. Анализ показывает разницу в средней продолжительности попыток охраны между мужскими и женскими парами и мужскими парами Tigriopus californicus, где самцы в мужских и мужских парах проявляли относительно более короткую продолжительность попыток, чем в мужских и женских парах.Два измерения пространственного отслеживания вновь сформированных охраняющих пар Tigriopus californicus показали, что пары мужчин и мужчин, как правило, показывают более высокую скорость, чем пары мужчин и женщин в первые три секунды попыток охраны. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области этиологии, биохимии и эволюционной генетики, чтобы исследовать уникальную систему спаривания этих типов copepods.

Research

JoVE Journal

Environment

Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior

Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae

Анализ жирных кислот содержание и состав микроводорослей

A method to determine the content and composition of total fatty acids present in microalgae is described. Fatty acids are a major constituent of ...

Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies

Обнаружение пищевых бактериальных патогенов из отдельных Filth мух

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a ...

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Использование хирономид (Diptera), поверхностно-Плавающие куколки экзувии как Bioassessment протокола Rapid для водоемов

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

Зрительные гепардов: определение физических лиц на их следы

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Watershed Planning within a Quantitative Scenario Analysis Framework

Водораздел Планирование в рамках структурного анализа количественного сценария

There is a critical need for tools and methodologies capable of managing aquatic systems within heavily impacted watersheds. Current efforts often fall ...

Modification and Application of a Leaf Blower-vac for Field Sampling of Arthropods

Модификация и применение листа Blower-Vac для отбора проб на местах членистоногих

Rice fields host a large diversity of arthropods, but investigating their population dynamics and interactions is challenging. Here we describe the ...

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

Оценка Влияние окружающей среды химических веществ на Honey Bee развития от личности до уровня колонии

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Сбор и извлечения образцов профессиональных воздуха для анализа ДНК, грибковых

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Методы доставки двуцепочечной РНК Оральный побудить РНК-интерференции в флоэма и членистохоботные насекомых, растений sap питание

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Белощекая балянусы improvisus как модель морской - выращивание и экспрессии генов

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...