Name: genetic incorporation of biosynthesized l-dihydroxyphenylalanine (dopa) and its application to protein conjugation
Uploaded: 2018-08-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine DOPA and Its Application to Protein Conjugation at JoVE.com

Это исследование было поддержано глобальной программы исследований границы (СР 2015M3A6A8065833), и основные программы исследований науки (2018R1A6A1A03024940) через Национальный фонд исследований Кореи (NRF) финансируется правительством Кореи.

1. плазмида строительство
<ol><li>Построить выражение плазмида (pBAD двойной ТПЛ-GFP-WT), который выражает ТПЛ ген от Citrobacter freundii под контролем промотора учредительных и Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) гена с его6-тег под контролем araBAD промоутер. Для pBAD двойной ТПЛ-GFP-E90TAG замените Д...

<ol>
	<li>Nagatsu, T., Levitt, M., Udenfriend, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+hydroxylase:+The+initial+step+in+norepinephrine+biosynthesis.">Tyrosine hydroxylase: The initial step in norepinephrine biosynthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 239, 2910-2917 (1964).</li><li>Pinder, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+dopamine+derivatives+capable+of+crossing+the+blood-brain+barrier+in+relation+to+parkinsonism.">Possible dopamine derivatives capable of crossing the blood-brain barrier in relation to parkinsonism.</a> Nature. 228 (5269), 358 (1970).</li><li>Waite, J. H., Tanzer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphenolic+substance+of+mytilus+edulis:+novel+adhesive+containing+L-DOPA+and+hydroxyproline.">Polyphenolic substance of mytilus edulis: novel adhesive containing L-DOPA and hydroxyproline.</a> Science. 212 (4498), 1038-1040 (1981).</li><li>Lee, H., Scherer, N. F., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+mechanics+of+mussel+adhesion.">Single-molecule mechanics of mussel adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 12999-13003 (2006).</li><li>Papov, V. V., Diamond, T. V., Biemann, K., Waite, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyarginine-containing+polyphenolic+proteins+in+the+adhesive+plaques+of+the+marine+mussel+Mytilus+edulis.">Hydroxyarginine-containing polyphenolic proteins in the adhesive plaques of the marine mussel Mytilus edulis.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (34), 20183-20192 (1995).</li><li>Waite, J. H., Qin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphoprotein+from+the+adhesive+pads+of+Mytilus+edulis.">Polyphosphoprotein from the adhesive pads of Mytilus edulis.</a> Biochemistry. 40 (9), 2887-2893 (2001).</li><li>Nicklisch, S. C., Waite, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+The+role+of+redox+in+DOPA-mediated+marine+adhesion.">Mini-review: The role of redox in DOPA-mediated marine adhesion.</a> Biofouling. 28 (8), 865-877 (2012).</li><li>Silverman, H. G., Roberto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+marine+mussel+adhesion.">Understanding marine mussel adhesion.</a> Marine Biotechnology. 9 (6), 661-681 (2007).</li><li>Lee, B. P., Messersmith, P. B., Israelachvili, J. N., Waite, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mussel-inspired+adhesives+and+coatings.">Mussel-inspired adhesives and coatings.</a> Annual Review of Materials Research. 41, 99-132 (2011).</li><li>Umeda, A., Thibodeux, G. N., Zhu, J., Lee, Y., Zhang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+protein+cross-linking+with+genetically+incorporated+3,4-dihydroxy-L-phenylalanine.">Site-specific protein cross-linking with genetically incorporated 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine.</a> ChemBioChem. 10 (8), 1302-1304 (2009).</li><li>Umeda, A., Thibodeux, G. N., Moncivais, K., Jiang, F., Zhang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+approach+to+transform+low-affinity+peptides+into+protein+probes+with+cotranslationally+expressed+chemical+cross-linker.">A versatile approach to transform low-affinity peptides into protein probes with cotranslationally expressed chemical cross-linker.</a> Analytical Biochemistry. 405 (1), 82-88 (2010).</li><li>Xu, J., Tack, D., Hughes, R. A., Ellington, A. D., Gray, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+non-canonical+amino+acid+design+to+covalently+crosslink+an+antibody-antigen+complex.">Structure-based non-canonical amino acid design to covalently crosslink an antibody-antigen complex.</a> Journal of Structural Biology. 185 (2), 215-222 (2014).</li><li>Burdine, L., Gillette, T. G., Lin, H. J., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodate-triggered+cross-linking+of+DOPA-containing+peptide-protein+complexes.">Periodate-triggered cross-linking of DOPA-containing peptide-protein complexes.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (37), 11442-11443 (2004).</li><li>Borrmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-promoted+oxidation-controlled+cyclooctyne-1,2-quinone+cycloaddition+(SPOCQ)+for+fast+and+activatable+protein+conjugation.">Strain-promoted oxidation-controlled cyclooctyne-1,2-quinone cycloaddition (SPOCQ) for fast and activatable protein conjugation.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 257-261 (2015).</li><li>Ayyadurai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+selective,+sensitive,+and+reversible+biosensor+by+the+genetic+incorporation+of+a+metal-binding+site+into+green+fluorescent+protein.">Development of a selective, sensitive, and reversible biosensor by the genetic incorporation of a metal-binding site into green fluorescent protein.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (29), 6534-6537 (2011).</li><li>Kim, B. J., Cheong, H., Hwang, B. H., Cha, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mussel-inspired+protein+nanoparticles+containing+iron(III)-DOPA+complexes+for+pH-responsive+drug+delivery.">Mussel-inspired protein nanoparticles containing iron(III)-DOPA complexes for pH-responsive drug delivery.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (25), 7318-7322 (2015).</li><li>Alfonta, L., Zhang, Z., Uryu, S., Loo, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+incorporation+of+a+redox-active+amino+acid+into+proteins.">Site-specific incorporation of a redox-active amino acid into proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14662-14663 (2003).</li><li>Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+incorporation+of+L-dihydroxyphenylalanine+(DOPA)+biosynthesized+by+a+tyrosine+phenol-lyase.">Genetic incorporation of L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase.</a> Chemical Communications. 54 (24), 3002-3005 (2018).</li><li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli.">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures.">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Jang, S., Sachin, K., Lee, H. J., Kim, D. W., Lee, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simple+method+for+protein+conjugation+by+copper-free+click+reaction+and+its+application+to+antibody-free+Western+blot+analysis.">Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2256-2261 (2012).</li><li>Gobom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic+acid+affinity+sample+preparation.+A+protocol+for+MALDI-MS+peptide+analysis+in+proteomics.">Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid affinity sample preparation. A protocol for MALDI-MS peptide analysis in proteomics.</a> Analytical Chemistry. 73 (3), 434-438 (2001).</li><li>Mukai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+reproductive+Escherichia+coli+cells+with+no+specific+assignment+to+the+UAG+codon.">Highly reproductive Escherichia coli cells with no specific assignment to the UAG codon.</a> Scientific Reports. 5, 9699 (2015).</li><li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomically+recoded+organisms+expand+biological+functions.">Genomically recoded organisms expand biological functions.</a> Science. 342 (6156), 357-360 (2013).</li><li>Bryson, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+directed+evolution+of+aminoacyl-tRNA+synthetases.">Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases.</a> Nature Chemical Biology. 13 (12), 1253-1260 (2017).</li><li>Guo, J., Melancon, C. E., Lee, H. S., Groff, D., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+amber+suppressor+tRNAs+for+efficient+bacterial+production+of+proteins+containing+nonnatural+amino+acids.">Evolution of amber suppressor tRNAs for efficient bacterial production of proteins containing nonnatural amino acids.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (48), 9148-9151 (2009).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+facile+strategy+for+selective+phosphoserine+incorporation+in+histones.">A facile strategy for selective phosphoserine incorporation in histones.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (22), 5771-5775 (2013).</li><li>Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+multiple+unnatural+amino+acids+via+evolution+of+a+quadruplet-decoding+ribosome.">Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome.</a> Nature. 464 (7287), 441-444 (2010).</li><li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+reactions+for+labeling+proteins.">Bioorthogonal reactions for labeling proteins.</a> ACS Chemical Biology. 9 (1), 16-20 (2014).</li><li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Incorporation+of+unnatural+amino+acids+and+bioorthogonal+labeling+of+proteins.">Cellular Incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins.</a> Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).</li><li>Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+copper-free+click+chemistry.">Genetically encoded copper-free click chemistry.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (17), 3878-3881 (2011).</li><li>Seitchik, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+tetrazine+amino+acid+directs+rapid+site-specific+in+vivo+bioorthogonal+ligation+with+trans-cyclooctenes.">Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (6), 2898-2901 (2012).</li></ol>

В этом протоколе биосинтез и прямое включение ДОПЫ описаны. Бактериальные клетки, используемые в этом методе можно синтезировать дополнительные аминокислоты и использовать его как неестественный строительный блок для синтеза белка. Генетическая включение неестественные аминокисло?...

ДОПЫ это аминокислота участвует в биосинтезе катехоламинов в животных и растений. Эта аминокислота от Tyr синтезируется гидроксилазы тирозин и молекулярного кислорода (O2)1. Потому что ДОПЫ прекурсор допамина и может проникать blood - brain барьер, он был использован в лечении болезни Паркинсона-2. ДОПЫ встречается также в мидий адгезии белков (карты), которые отвечают за адгезионные свойства мидии в влажных условиях3,4,5,6,7. Tyr сначала кодируется в позициях, где ДОПЫ находится в карты и затем преобразуется в ДОПЫ tyrosinases8,9. Из-за его интересные биохимические свойства ДОПЫ был использован в различных приложениях. Dihydroxyl группы ДОПЫ химически подвержен окислению, и аминокислоты легко превращается в L-допаквинон, предшественник Меланины. Благодаря своей высокой electrophilicity L-допаквинон и его производные, были использованы для сшивки и конъюгации с тиолами и амины10,11,12,13. 1,2-хиноны также может функционировать как диеновых для реакции циклоприсоединения и были использованы для bioconjugation штамм способствует окислению контролируется cyclooctyne-1,2-хиноны (SPOCQ) циклоприсоединения14. Кроме того группа dihydroxyl может хелатной ионов металлов Fe3 + и Cu2 +, и белки, содержащие ДОПЫ были использованы для доставки лекарств и Ион металла, зондирования15,16.
ДОПЫ генетически включены в белки с использованием ортогональных аминоацил тРНК (aa тРНК) и аминоацил тРНК синтетазы (Орсе) пары17 и используется для белка спряжение и сшивки10,11, 12,13. В настоящем докладе описаны результаты экспериментов и протоколы для генетических включение ДОПЫ biosynthesized от дешевых исходных материалов и ее применения для bioconjugation. ДОПЫ-biosynthesized с помощью ТПЛ и начиная от катехол, пируват и аммиака в Escherichia coli. Biosynthesized ДОПЫ непосредственно включены в белки, выразив развивались пару aa тРНК и Орсе для ДОПЫ. Кроме того белок biosynthesized, содержащие ДОПЫ site-specifically конъюгированных с флуоресцентного зонда и высокоструктурированные производить белок олигомеров. Этот протокол будет полезным для белка ученых, biosynthesize мутантных белков, содержащих ДОПЫ и конъюгат белки с биохимическими зондов или препаратов для фармацевтической и промышленных приложений.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1235px;" width="1234">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">1. Plasmid Construction</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:596px;">Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td>optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Plasmid pEvol-DHPRS2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td>1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">DH10&#946;</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:133px;">C6400-03</td>
			<td>Expression Host</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Plasmid Mini-prep kit</td>
			<td style="width:167px;">Nucleogen</td>
			<td style="width:133px;">5112</td>
			<td>200/pack</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Agarose</td>
			<td style="width:167px;">Intron biotechnology</td>
			<td style="width:133px;">32034</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:167px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:133px;">L07482</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">LB Broth</td>
			<td style="width:167px;">BD Difco</td>
			<td style="width:133px;">244620</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:596px;">2. Culture preparation</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:596px;">2.1) Electroporation</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Micro pulser&#160;</td>
			<td style="width:167px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:133px;">165-2100</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Micro pulser cuvette</td>
			<td style="width:167px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:133px;">165-2089</td>
			<td style="width:339px;">0.1 cm electrode gap, pkg. of 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Ampicillin Sodium</td>
			<td style="width:167px;">Wako</td>
			<td style="width:133px;">018-10372</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:167px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:133px;">B20841</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Agar</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">214230</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:596px;">SOC medium</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">S1797</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:596px;">3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:596px;">3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L(+)-Arabinose, 99%</td>
			<td style="width:167px;">Acros</td>
			<td style="width:133px;">104981000</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Pyrocatechol, 99%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">P1387</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Ammonium sulfate, 99%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">A0943</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">pyruvic acid, 98%</td>
			<td style="width:167px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:133px;">A13875</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:596px;">Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">S0891</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Potassium phophate, monobasic, 99%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">P1127</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Magnesium sulfate, anhydrous, 99%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">M0146</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">D(+)-Glucose, anhydrous, 99%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">D0092</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Glycerol, 99%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">G0269</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Trace metal mix a5 with co</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">92949</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-Proline, 99%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">P1257</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-Phenylalanine, 98.5%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">P1982</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-Tryptophane</td>
			<td style="width:167px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:133px;">49550-0310</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:596px;">L-Arginine, 98%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">A1149</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-Glutamine, 98%</td>
			<td style="width:167px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:133px;">27340-0310</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-Asparagine monohydrate, 99%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">A1198</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:167px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:133px;">73190-0410</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:596px;">L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">H0604</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-Threonine, 99%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">T2938</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:167px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:133px;">87070-0310</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Glycine, 99%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">G0286</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-Glutamic acid, 99%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">G0233</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-Alanine, 99%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">A1543</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-Isoleucine, 99%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">I1049</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-Valine, 99%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">V0088</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-Serine</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">S2447</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-Aspartic acid</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">A1205</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-Lysine monohydrochloride, 99%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">L0592</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">3.2 Cell lysis</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Imidazole, 99%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">I0578</td>
			<td>1kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Sodium phosphate monobasic, 98%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">S0919</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Sodium Chloride, 99%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">S2907</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:596px;">Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 milliliters</td>
			<td style="width:167px;">SONIC &#38; MATERIALS</td>
			<td style="width:133px;">VCX130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Ni-NTA resin</td>
			<td style="width:167px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:133px;">30210</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:596px;">Polypropylene column</td>
			<td style="width:167px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:133px;">34924</td>
			<td>50/pack, 1 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:596px;">4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:596px;">Sodium periodate, 99.8&#38;</td>
			<td style="width:167px;">Acros</td>
			<td style="width:133px;">419610050</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:596px;">5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne&#8211;1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ)&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:596px;">Cy5.5-ADIBO&#160;</td>
			<td style="width:167px;">FutureChem</td>
			<td style="width:133px;">FC-6119</td>
			<td>1mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">6. Purification of Labeled GFP</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:596px;">Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters</td>
			<td style="width:167px;">MILLIPORE</td>
			<td style="width:133px;">UFC500396</td>
			<td>96/pack, 500ul capacity</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:596px;">7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 %</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">10708984001</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X</td>
			<td style="width:167px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:133px;">NP0007</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">MES running buffer</td>
			<td style="width:167px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:133px;">NP0002</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels</td>
			<td style="width:167px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:133px;">NO0321</td>
			<td>12 well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td style="width:167px;">Wako</td>
			<td style="width:133px;">031-17922</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:596px;">G:BOX Chemi Fluorescent &#38; Chemiluminescent Imaging System</td>
			<td style="width:167px;">Syngene</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td>G BOX Chemi XT4</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:596px;">8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:596px;">8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">T1351</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Hydrochloric acid, 35~37%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">H0256</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Dodecyl sulfate sodium salt, 85%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">D1070</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">I6125</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:596px;">Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td style="width:167px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:133px;">90057</td>
			<td>5 x 20 &#181;g/pack</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">C-18 spin columns</td>
			<td style="width:167px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:133px;">89870</td>
			<td>25/pack, 200 &#181;L capacity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:596px;">8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Acetonitirile, 99.5%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">A0125</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">C2020</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Trifluoroacetic acid, 99%</td>
			<td style="width:167px;">SAMCHUN</td>
			<td style="width:133px;">T1666</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">MTP 384 target plate ground steel BC targets</td>
			<td style="width:167px;">Bruker</td>
			<td style="width:133px;">8280784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer</td>
			<td style="width:167px;">Bruker</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic incorporation of biosynthesized l-dihydroxyphenylalanine (dopa) and its application to protein conjugation

L-Диоксифенилаланин (ДОПЫ) это аминокислота, в биосинтезе катехоламинов в животных и растений. Из-за его особую биохимические свойства аминокислота имеет несколько использует в биохимических приложений. Этот доклад описывает протокол для генетических включение biosynthesized ДОПЫ и его применение к белка спряжение. ДОПЫ biosynthesized, тирозин фенол лиазы (TPL) от катехол, пируват и аммиака, аминокислота является непосредственно включена и белков методом генетической включения с использованием и развивались аминоацил тРНК аминоацил тРНК синтетазы пара. Это прямое включение системы эффективно включает ДОПЫ с маленькой включение других природных аминокислот и лучше белок доходность, чем предыдущие системы генетических включения для ДОПЫ. Белка конъюгации с ДОПЫ содержащих белков является эффективным и конкретным участкам и показывает свою полезность для различных приложений. Этот протокол обеспечивает белка ученых с подробные процедуры для осуществления эффективного биосинтеза мутантных белков, содержащих ДОПЫ на желаемых сайты и их сопряжения для промышленности и фармацевтической.

Выражение системы для прямого включения ДОПЫ biosynthesized от ТПЛ показан на рисунке 1. Гены для пары развивались aa тРНК и Орсе находятся в плазмиды, и гена GFP (GFP-E90TAG), содержащий янтаря кодон в позиции 90 расположен в другом плазмида оценить включение ДОПЫ GFP фл?...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine DOPA and Its Application to Protein Conjugation at JoVE.com

Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine DOPA and Its Application to Protein Conjugation

Генетическая включение Biosynthesized L-Диоксифенилаланин (ДОПЫ) и ее применение для белка спряжение

Здесь мы представляем протокол для генетических включение L-Диоксифенилаланин biosynthesized от простых исходных материалов и его применение к белка спряжение.

L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) is an amino acid found in the biosynthesis of catecholamines in animals and plants. Because of its particular biochemical ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Белок, Способ получения для высокой пропускной способности идентификации белков, взаимодействующих с ядерной кофактора Используя LC-MS / MS Analysis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Подготовка гидролизат кератина от куриные перья и его применение в косметике

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Применение биослойной интерферометрии (BLI) для изучения белково-белковых взаимодействий в транскрипции

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

Pepti'uick, одноступенчатая инкорпорация мембранных белков в биотинилатированные пептидиски для оптимизированных белковых связывающих анализов

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Создание высокоспецифических химически индуцированных систем димеризации белка по шагу Phage Выбор комбинаторных однодоменных антител библиотеки

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

JUMPn: A Streamlined Application for Protein Co-Expression Clustering and Network Analysis in Proteomics

JUMPn: оптимизированное приложение для кластеризации коэкспрессии белка и сетевого анализа в протеомике

With recent advances in mass spectrometry-based proteomics technologies, deep profiling of hundreds of proteomes has become increasingly feasible. ...

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Изучение биомолекулярного взаимодействия между молекулярным шапероном Hsp90 и его клиентской протеинкиназой Cdc37 с использованием технологии полевого биозондирования

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Анализ вытягивания в сочетании с коэкспрессией в клетках бактерий как эффективный по времени инструмент для тестирования сложных белково-белковых взаимодействий

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...