Name: measuring liver mitochondrial oxygen consumption and proton leak kinetics to estimate mitochondrial respiration in holstein dairy cattle
Uploaded: 2018-11-30T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle at JoVE.com

وأيد هذا البحث الأموال اللتيتش وتظليل وزارة الزراعة من خلال المركز "الصحة الحيوانية الأغذية" في جامعة كاليفورنيا ديفيس مدرسة الطب البيطري.

جميع الأساليب والبروتوكول والدراسات الموضحة هنا بموافقة "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة كاليفورنيا في ديفيز.
1-الحصول على عينة من كبد من بقرة هولشتاين الألبان
ملاحظة: ينبغي إجراء خزعة كبد بطبيب بيطري مرخص. يمكن إجراء خزعات الكبد على ?...

<ol>
	<li>Brand, M. D., Divakaruni, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology. 26, 192-205 (2011).</li><li>Stephenson, E. J., Hawley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+in+metabolic+health:+A+genetic+and+environmental+tug+of+war.">Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).</li><li>Bartlett, K., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+B+oxidation.">Mitochondrial B oxidation.</a> European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).</li><li>Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+Consumption,+Respiratory+Control+Ratio+(RCR)+and+Mitochondrial+Proton+Leak+of+broilers+with+and+without+growth+enhancing+levels+of+minerals+supplementation+challenged+with+Eimeria+maxima+(Ei).">Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei).</a> Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).</li><li>Wallace, D. C., Fan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics,+epigenetics,+mitochondrial+genetics.">Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics.</a> Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).</li><li>Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+mitochondrial+bioenergetics+and+cardiolipin+in+aging.">Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging.</a> Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).</li><li>Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+mitochondrial+oxygen+consumption+and+efficiency+of+milk+production+in+lactating+Holstein+cows+supplemented+with+Copper,+Manganese+and+Zinc.">Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc.</a> Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).</li><li>Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+metabolism+and+performance+of+cattle.">Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle.</a> Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).</li><li>Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+mitochondrial+function+and+residual+feed+intake+in+Angus+steers.">The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers.</a> Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).</li><li>Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+residual+feed+intake+and+hepatic+mitochondrial+function+in+growing+beef+cattle.">Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle.</a> Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).</li><li>Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+liver+mitochondrial+respiration+and+proton+leak+kinetics+in+low+and+high+RFI+steers+from+two+lineages+of+RFI+Angus+bulls.">Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls.</a> ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).</li><li>Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+oxidants+in+biological+systems:+The+superoxide+theory+of+oxygen+toxicity.">Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity.</a> Free Radicals in Biology and Medicine. , 186-187 (1989).</li><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nutrient Requirements of Dairy Cattle. , (2001).</li><li>Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+energy+intake,+energy+expenditure,+and+aging.">Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging.</a> Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).</li><li>Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+control+of+immunity:+beyond+ATP.">Mitochondrial control of immunity: beyond ATP.</a> Nature. 17, 608-620 (2017).</li><li>Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+assays+of+respiratory+chain+complex+activity.">Biochemical assays of respiratory chain complex activity.</a> Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).</li><li>Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milk+yield+differences+between+1x+and+4x+milking+are+associated+with+changes+in+mammary+mitochondrial+number+and+milk+protein+gene+expression,+but+not+mammary+cell+apoptosis+or+SOCS+gene+expression.">Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression.</a> Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).</li><li>Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+high-fat+feeding+on+metabolic+efficiency+and+mitochondrial+oxidative+capacity+in+adult+rats.">Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats.</a> British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).</li><li>Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SirT1+regulates+energy+metabolism+and+response+to+caloric+restriction+in+mice.">SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice.</a> PloS One. 3 (3), e1759 (2008).</li><li>Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+dietary+lipid+composition+on+liver+mitochondria+from+mice+following+1+month+of+calorie+restriction.">The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction.</a> Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).</li><li>Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bioenergetic+health+index:+a+new+concept+in+mitochondrial+translational+research.">The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research.</a> Clinical Science. 127, 367-373 (2014).</li></ol>

معظم النقطة الحرجة في البروتوكول هو الحصول على عينة تمثيلية من أنسجة كبد وبداية عزلة الميتوكوندريا، في أقرب وقت ممكن بعد خزعة. التباين في قياسات التنفس المنخفض (الجدول 1) بسبب وقت نقل قصيرة من البقرة إلى مختبر. لتقليل وقت النقل، أنشئ مختبر صغير في المكتب لمنتجات الألبان، وطردوا كب...

الميتوكوندريا حساسة للغاية للتأكيد وبيئتها الخلوية يمكن أن تسهم في مجموعة متنوعة واسعة من الأمراض الأيضية. استهلاك الأوكسجين وتسرب بروتون في الميتوكوندريا مؤشرات الصحة الميتوكوندريا. الطرق الموضحة في هذه الورقة كفاءة الطاقة المتقدرية تقدير استخدام آر استناداً إلى استهلاك الأوكسجين مع أو بدون تسرب بروتون. هذه النتائج يمكن أن تمثل 30 في المائة الطاقة المفقودة في استخدام المغذيات1. يمكن تحديد التغييرات في الاستهلاك وبروتون تسرب الأوكسجين خلل mitochondrial الذي يساهم في الأمراض الأيضية وتؤدي إلى انخفاض الطاقة الكفاءة. يمكن أيضا استخدام هذه الأساليب دراسة تأثير العلاجات المختلفة في التنفس المتقدرية. والهدف العام لقياس استهلاك الأوكسجين mitochondrial وحركية تسرب بروتون تقييم الوظيفة المتقدرية وكفاءة حيوية.
خلل المتقدرية الكبدية ارتبطت بالعديد من الأمراض في الأبقار الحلوب. تتأثر قدرة الأيض الخلوية للتبديل بين أنواع الوقود الكربوهيدرات والدهون عندما تواجه بعجز الطاقة في الرضاعة المبكرة بعدد ووظيفة الميتوكوندريا في الخلية2. العيوب الموجودة في الميتوكوندريا قادرة على التكيف مع زيادة طلب على الطاقة وزيادة بيتا--الأكسدة يمكن أن يؤدي إلى تراكم الدهون داخل الخلايا المرتبطة بمقاومة الأنسولين ويمكن أن يؤدي إلى تشكيل الكبد الدهني في الأبقار الحلوب الرضاعة المبكرة. الميتوكوندريا، كموقع هيئة كيتون الإنتاج والاستخدام، يمكن أن تلعب دوراً رئيسيا في الكيتوزيه في الأبقار الحلوب3. الافتقار إلى الميتوكوندريا أو خلل mitochondrial سوف تؤثر على توافر الوقود إلى الهامش، وتنعكس في التغيرات في استهلاك الأكسجين أو آر.
التغييرات استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا استجابة لالتهاب. دجاجة عمره سبعة أيام تم عشوائياً إلى مجموعة المصابين مع ماكسيما ايميريا و مجموعة تحكم4. الفراريج التي لم تطرأ التحدي الكوكسيديا قد خفض استهلاك الأكسجين بسبب تسرب بروتون وار أعلى مما يشير إلى أن الميتوكوندريا الكبد الاستجابة لتحدي منأى بزيادة بروتون تسرب. حين تسرب بروتون ورد الفعل إنتاج الأنواع الأوكسجين كان يعتبر علامة على الخلل في غشاء الميتوكوندريا وتضر بكفاءة حيوية، الآن ومن المعروف أن من المهم للبروتينات والكالسيوم استيراد الميتوكوندريا5 ، ومن أجل توليد الحرارة1.
تسرب إلكترون من سلسلة التنفس يجعل الميتوكوندريا عرضه لإنتاج الأنواع الأكسجين التفاعلية والضرر التأكسدي للغشاء الميتوكوندريا والبروتينات، والدهون والحمض النووي. كما سن الميتوكوندريا، يمكن أن تتراكم الأضرار خاصة إلى متدنا تسبب مزيدا من الخلل في التمثيل الغذائي المتقدرية6 وقابلية أكبر للبقرة للمرض. في الممارسة العملية، ويتم تغذية العديد من المواشي الحيوانات مستويات عالية من المكملات الغذائية مثل النحاس والزنك ومينيسوتا لتعزيز وظيفة المضادة للأكسدة. ومع ذلك، تغذية مستويات عالية من النحاس، الزنك والمنغنيز انخفاض إنتاج الحليب وزيادة استهلاك الأكسجين بسبب بروتون تسرب (4 حالة التنفس)7.
البحوث السابقة بشأن دور الوظيفة المتقدرية في كفاءة استخدام الطاقة في الماشية تركز على التغيرات في استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا وتسرب بروتون. وقد نشرت دراسات قليلة جداً في الأبقار الحلوب وأوراق معظم مقارنة كفاءة الإنتاج في شكل كمية الأعلاف المتبقية (آر إف أي) للوظيفة المتقدرية في الأبقار. تقلب في التنفس المتقدرية بحثت معدلات قياس الدولة 3، 4 وار في كبد من بقرة هولشتاين الحوامل والمرضعات من لحوم البقر الأبقار (انجوس، برانجوس وهيريفورد)8. الباحثون لم تجد أي علاقة في التنفس المتقدرية مع النمو أو الصفات للأبقار الحلوب ولكنها قدمت تقريرا علاقة بين التنفس المتقدرية وحلب الصفات الهولشتاين. في دراستين، تمت مقارنة RFI في الأبقار إلى معدلات التنفس المتقدرية (الدولة 3، الدولة 4 وار) في العضلات الميتوكوندريا9،10. تغيير معدلات التنفس المتقدرية ردا على DMI وانخفاض معدلات كانت ترتبط بأقل كفاءة من يرسم لحوم البقر. وفي دراسة أخرى، قورنت RFI ليرسم من الثيران آر إف أي ارتفاع أو انخفاض معدلات التنفس المتقدرية وبروتون تسرب حركية بين هاتين المجموعتين من ذرية11. وتعزى الاختلافات مكسب يؤكد الاستنتاج بأن اكتساب عدم تأثير التنفس المتقدرية في الأبقار.
في هذه الورقة، وتجربة دراسة الكبد سي ردا على تغذية 3 المضادة للأكسدة المعادن المرضعات ماشية الألبان يوضح استخدام أساليب لقياس استهلاك الأوكسجين أثناء الدولة 4 و 3 التنفس وتحلان.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liver Biopsy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument</td>
			<td>Sontec Instruments Englewood CO</td>
			<td>1103-904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-037-516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture needles</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Included with Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S2896 / S2646</td>
			<td># for handle and blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery towels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-129-6667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>Z168750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-314387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needles (22, 2 1/2)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MJ8881-200342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cow halter</td>
			<td>Tractor Supply Co.</td>
			<td>101966599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabbing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gauze squares (4x4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-246069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical scissors</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clostridia Vaccine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone Scrub</td>
			<td>Aspen Veteterinary Resources</td>
			<td>21260221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>793213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% lidocaine HCl (10-15 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation of Mitochondria (liver)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04369-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04468-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto Pipette (10 mL)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL) with ice</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB100600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microfuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-002-441EW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab102536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fatty acid free)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A7030-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M4125-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>38796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,&#160; pH 7.4 at 4 &#176;C, will last 2 days in refrigerator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Oxygen Comsuption</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode</td>
			<td>Hansatech (PP Systems)</td>
			<td>OXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated Water Pump</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLE2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark type Oxygen electrode</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autopipette (1 mL)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-70</td>
			<td>Included with Oxy1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small magnetic stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (10 &#956;L)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P9333-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P5655-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M1028-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>E3889-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,&#160; pH 7.4 at 30 &#176;C with 0.3% defatted BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone (4 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>R8875-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate (1 M solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S3674-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP (100 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A5285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin (solution of 8 &#956;g/mL in ethanol)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP electrode</td>
			<td>World Precision Instruments.</td>
			<td>DRIREF-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malonate (0.1 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin (8 &#956;g/mL in ethanol), keep in freezer</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,&#160; pH 7.4 at 30 &#176;C with 0.3% defatted BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring liver mitochondrial oxygen consumption and proton leak kinetics to estimate mitochondrial respiration in holstein dairy cattle

استهلاك الأوكسجين، دافع بروتون القوة (تحلان) وتسرب بروتون قياسات التنفس المتقدرية، أو مدى الميتوكوندريا قادرة على تحويل ATP NADH والقوات المسلحة الهايتية. منذ الميتوكوندريا هي أيضا الموقع الأساسي لاستخدام الأوكسجين والمغذيات الأكسدة إلى ثاني أكسيد الكربون والماء، مدى فعالية استخدام الأوكسجين، وإنتاج ATP مباشرة تتصل بكفاءة الأيض المغذيات، المتطلبات الغذائية من الحيوان، و صحة الحيوان. والغرض من هذا الأسلوب هو فحص التنفس المتقدرية، التي يمكن استخدامها لدراسة آثار المخدرات المختلفة، والوجبات الغذائية والآثار البيئية على الأيض المتقدرية. وتشمل النتائج استهلاك الأوكسجين قياس التنفس يتوقف بروتون (3 الدولة) وبروتون تسرب تعتمد التنفس (4 الدولة). يعرف بأنه نسبة التحكم الجهاز التنفسي (آر) نسبة التنفس الدولة 4 (3) الدولة ويمكن أن تمثل كفاءة حيوية المتقدرية. تسرب بروتون المتقدرية هي عملية تسمح تبديد للغشاء الميتوكوندريا المحتملة (MMP) يفصل الفسفرة من ADP تناقص كفاءة توليف ATP. تستخدم أقطاب حساس الأكسجين وترمب + مع ركائز mitochondrial ومثبطات سلسلة نقل الإلكترون لقياس الدولة 3 و 4 حالة التنفس، غشاء الميتوكوندريا تحلان (أو يمكن أن تنتج ATP) وتسرب بروتون. القيود على هذا الأسلوب هي أن نسيج الكبد يجب أن تكون طازجة قدر الإمكان ويجب تنفيذ جميع خزعات وفحوصات في أقل من 10 ح. وهذا يحصر عدد العينات التي يمكن جمعها ومعالجتها بواسطة شخص واحد في يوم واحد لحوالي 5. ومع ذلك، مطلوب 1 جرام فقط من أنسجة الكبد، حتى في الحيوانات الكبيرة، مثل الأبقار الحلوب، كمية العينة المطلوبة صغيرة بالنسبة لحجم الكبد، وهناك القليل من الوقت الانتعاش اللازم.

وترد نتائج إيجابية تظهر حركية تسرب آر وبروتون في الجدول 1 و الشكل 15، على التوالي. في تسرب7وار والبروتين في هذه الدراسة تم قياس حركية في هولشتاين الأبقار الحلوب في 70 يوما في الحليب بعد قد تم تغذية الأبقار 1 5 مستويات مختلفة من النحاس وال...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle at JoVE.com

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

ونشاطر هنا، أساليب لقياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية، تعريف مفهوم علم الطاقة الغذائية، وتسرب بروتون، السبب الرئيسي لعدم الكفاءة في جيل الميتوكوندريا من ATP. هذه النتائج يمكن أن تمثل 30 في المائة الطاقة المفقودة في استخدام المواد الغذائية للمساعدة في تقييم الوظيفة المتقدرية.

قياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية الكبد وحركية تسرب بروتون لتقدير التنفس المتقدرية في الأبقار الحلوب هولشتاين

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال حيوية، مثل صحة الميتوكوندريا، والكفاءة النشطة واستخدام الطاقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن استهلاك الأكسجين من الميتوكوندريا المعزولة يقاس مباشرة. النتائج لا تحتاج إلى تصحيح لعمليات الأيض الأخرى داخل الخلايا.قررنا أولاً اتباع هذه الطريقة في ماشية الألبان عندما أردنا دراسة كيفية تأثير كفاءة الميتوكوندريا على كفاءة التغذية. عرض الفيديو من هذه الطريقة أمر بالغ الأهمية كما الخطوات في العزل الميتوكوندريا من الصعب تعلم لأنها تحتاج إلى أن تكون متسقة ودقيقة. في أقرب وقت ممكن بعد إزالة عينة الكبد من البقر غسل العينة في وسائط عزل الميتوكوندريا لإزالة خلايا الدم الحمراء.باستخدام مقص ناعما مفروم الأنسجة في منقار مبردة التي تحتوي على وسائل الإعلام عزل ما يكفي للحفاظ على الأنسجة رطبة. نقل الكبد المفروم إلى قارورة زجاجية 30 ملليلتر تحتوي على وسائط عزل الميتوكوندريا. إضافة آفة تفلون التي لديها إزالة 0.16 ملليمتر، وقد احتضنت في الجليد وتجانس عينة الكبد في 500 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة مع أربع ضربات في الدقيقة.بعد ذلك، نقل المتجانسة إلى أنبوب يحتوي على وسائل الإعلام عزل الميتوكوندريا ووضع هذا في منقار معبأة بالجليد. التجانس الطرد المركزي في 500 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقيقة. تخلص من البيليه ونقل المابير إلى أنبوب طرد مركزي مبرد.أجهزة الطرد المركزي ناسخة الناتجة في 10،000 مرات G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق للحصول على بيليه الميتوكوندريا. Resuspend وغسل بيليه في 10 ملليلتر من وسائل الإعلام عزل الميتوكوندريا مع حمض الدهنية خالية من BSA. ثم جهاز الطرد المركزي في 8، 100 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.تجاهل supernatant وإعادة فرض بيليه في 200 microliters من وسائل الإعلام العزل. ضع هذا على الجليد حتى تصبح جاهزة للاستخدام لاستهلاك الأكسجين والبروتون تسرب المقايسات الحركية. تحديد تركيز البروتين من تعليق بيليه باستخدام طقم حمض bicinchoninic في تعليمات الشركة المصنعة باستخدام BSA كمعيار.أولاً، إنشاء وسائط استهلاك الأكسجين كما هو موضح في بروتوكول النص. احتضان وسائل الإعلام استهلاك الأوكسجين في 30 درجة مئوية. المقبل، إعداد غرفة التنفس، مضخة وكهرباء الأكسجين لنظام الأوكسيجراف وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.ثم ضع ملليلتر واحد من وسائل الإعلام استهلاك الأكسجين في غرفة التنفس. ثم إضافة 0.35 ملليغرام من بروتين الميتوكوندريا إلى الغرفة. يحرك بقوة لضمان أن يصبح الحل مشبعة بالهواء والحفاظ على درجة حرارة 30 درجة مئوية.سجل استهلاك الأكسجين لمدة خمس دقائق تقريبًا. عندما يصبح استهلاك الأكسجين ثابتًا يمثله خط مستقيم متناقص ، قم بتسجيل هذا كـ استهلاك الأكسجين الأساسي. إضافة 1.25 ميكرولترات من محلول أربعة ملليمترات الروتينون لمنع واحد معقدة، ومن ثم إضافة خمسة ميكرولترات من محلول واحد بوتشينات الضرس للوصول إلى تركيز نهائي من خمسة ملليمولار succinate في غرفة الجهاز التنفسي.هذا هو إستهلاك الأكسجين في الحالة الرابعة. بعد ذلك، أضف ميكرولتر واحد من محلول ADP 100 مليمولار للوصول إلى تركيز نهائي من 100 ميكرومولار في غرفة التنفس. سوف ينخفض استهلاك الأكسجين لمدة خمس دقائق تقريباً ثم سيصبح خط مستقيم.سجل هذا استهلاك الأكسجين كما التنفس الدولة الثالثة. حساب نسبة التحكم في الجهاز التنفسي كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم تُفطّن جميع الحلول من غرفة التنفس.شطف الغرفة عدة مرات مع الماء المزدوج الأيونية. أولاً، إعداد حل من 80 نانوغرام لكل ملليلتر من النيجر في الإيثانول الحد من كمية الإيثانول المضافة إلى أقل من ميكرولتر واحد. أيضا، إعداد حل من ثمانية ميكروغرام لكل ملليلتر oligomycin في الإيثانول.بعد شطف الغرفة بدقة مع المياه المزدوجة deionized، ضع ملليلتر واحد من وسائل الإعلام استهلاك الأكسجين في غرفة التنفس ويحرك بقوة مع شريط ضجة المغناطيسي. أضف 0.35 ملليغرام من بروتين الميتوكوندريا إلى غرفة التنفس. أضف قطبًا حساسًا لثبيل فوسفونيوم الميثيل إلى إعداد الغرفة مع التأكد من أن الطرف الآخر متصل بشكل صحيح بمتر pH.إضافة 1.25 ميكرولترات من محلول روفينون أربعة ملليمولار لمنع I.Record المعقدة التنفس لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق. سجل قيمة استهلاك الأكسجين عندما يصبح ثابتا. بعد ذلك، إضافة 0.56 ميكرولترات من حل oligomycin لمنع استخدام شرطة أبوظبي.سجل التنفس لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق. سجل قيمة استهلاك الأكسجين عندما يصبح ثابتا. ثم إضافة 0.112 ميكرولترات من 80 نانوغرام في حل النيجرية المليلتر لإلغاء التدرج PH عبر الغشاء الداخلي الميتوكوندريا.سجل التنفس لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق ولاحظ قيمة استهلاك الأكسجين عندما يصبح ثابتًا. إضافة خمسة ميكروليترات من 10 ملليمولار الميثيل ثلاثي الفينيلفوسفونيوم حل لاحتضان الميتوكوندريا للبدء في إعداد منحنى قياسي. كرر هذه الإضافة أربع مرات إضافية حتى تركيز إجمالي قدره 2.5.وقد تمت إضافة ميكرومولار. بعد هذا، إضافة خمسة ميكرولترات من محلول واحد رزينة الضرس إلى الغرفة لبدء التنفس. سجل التنفس حتى يتم تحقيق أثر مستقر.ثم إضافة ماسونات إلى titrate النظام كما هو موضح في بروتوكول النص. في هذه الدراسة، يتم قياس حركية تسرب RCR والبروتون في حليب الأبقار الحلوب هولشتاين بعد 70 يوما من الأبقار الحلوب قد تم إطعامها بمستويات مختلفة من النحاس والزنك والمنغنيز لمدة 28 يوما. وينظر إلى التنفس في الدولة الرابعة على أنه الأعلى في الأبقار نظرا لانخفاض مستويات المنغنيز، ومع ذلك هو أدنى مستوى في الأبقار السيطرة، مما يشير إلى أن المنغنيز يلعب دورا هاما في تقليل التنفس الذي يعتمد على تسرب البروتونات.ويكشف تحليل التنفس الذي يعتمد على تسرب البروتون الكبدي أن هذا التنفس هو الأكبر في الأبقار المعالجة بالمنغنيز المنخفض، وأدنى الأبقار المسيطرة. هذه النتائج تؤكد أن مجموعة المنغنيز المنخفضة لديها أكبر حالة التنفس الرابع في حين أن مجموعة التحكم لديها أدنى. في حين أن كفاءة الأعلاف أعلى في أنجوس توجه ولدت من الثيران RFI منخفضة من الثيران RFI عالية، وهذا لم ينعكس في RCR الميتوكوندريا أو حركية تسرب البروتون.أثناء تنفيذ هذا الإجراء من المهم الحفاظ على جميع القوارير والقارور على الجليد أثناء معالجة الميتوكوندريا. بعد تطورها مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التغذية الألبان لاستكشاف دور كفاءة الميتوكوندريا في كفاءة الأعلاف ووظيفة الميتوكوندريا في الكبد. لا تنس أن العمل مع الروتينون يمكن أن يكون خطيرا، وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات وحماية العين والمعدات الشخصية المناسبة دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

تحليلات لتدفق الكالسيوم المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المستزرعة

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

قياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية في ألياف بيرميبيليزيد من المورفولوجية استخدام كميات ضئيلة من الأنسجة

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

قياس وتفسير معدلات استهلاك الأوكسجين كلياً يطير رئيس قطاعات

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

قياس مجمعات نقل الإلكترونات الميتوكوندريا في الأنسجة القلبية المجمدة سابقا من ذرية سو: نموذج لتقييم التغيرات في الجيوجيات الحيوية الميتوكوندريا الناجمة عن ممارسة الرياضة

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

القياس الكمي عالي الإنتاجية القائم على الصور لتخليق وتوزيع الحمض النووي للميتوكوندريا

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

المقايسات المستقلة عن الأكسجين لقياس وظيفة الميتوكوندريا في الثدييات

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

طريقة محسنة لعزل مواقع ملامسة الميتوكوندريا

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Analyzing Mitochondrial Physiology and Bioenergetics in Fruit Flies

Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry

Exploring Mitochondrial Function and Chemical Toxicity Using Drosophila melanogaster (Video) | JoVE

تحليل وظيفة الميتوكوندريا في ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر PINK1B9-null الطافرة باستخدام قياس التنفس عالي الدقة

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy ...